Пошук, оцінка, культивування і зберігання зародків

Температура в лабораторії для роботи з ембріонами повинна бути 20...25 °С. За три години до початку роботи приміщення обробляють ультрафіолетовими променями за допомогою бактерицидних ламп, які встановлюють з розрахунку 1 Вт на 1 м². Прийомні ємності підвішують на спеціальному лабораторному штативі для седиментації і обробляють 70° спиртом. Тривалість осідання зародків 15...20 хв.

За спливом вказаного терміну верхній шар видаляють за допомогою сифона. Нижній шар рідини порційно по 20-30 мл для виявлення зародків досліджують у великих годинникових стеклах чи чашках Петрі під бінокулярною лупою при 10-50-кратному збільшенні. Знайдені зародки за допомогою пастерівської піпетки переносять в середовище для короткотривалого зберігання (середовище Дюльбекко з додаванням 20 % фетальної сироватки теля).

Найбільш широкого поширення набули способи оцінки якості та життєздатності зародків за морфологічними ознаками та результатами їх культивування.

Морфологічну оцінку зародків проводять с використанням інвертованого мікроскопу МБИ-13. При цьому враховують відповідність стадії розвитку зародку його віку, цілісність і форму прозорої оболонки; рівномірність дроблення бластомерів і стан їх цитоплазми; величину і прозорість перивітелінового простору (табл. 3). Зародки з ознаками дегенерації, виродливостей та недорозвитку для пересадок непридатні.

Таблиця 3

Шкала оцінки якості ембріонів за м.І.Сергеевим

Стадії розвитку	Морфологічнні ознаки	Оцінка	Балів	Умов. позн.
Морула Бластоциста	Кругла форма, ціла прозора оболонка, прозорий перивітеліновий простір, бластомери чіткі, одинакового розміру, протоплазма зерниста У перивітеліновомі просторі гранули та включення, бластомери неодинакового розміру, розміщені асиметрично, дещо здавлені Гранули та включення в перивітеліновому просторі, зародок частковий, незначне здавлювання бластомерів, окремі з них пошкоджені Деформація прозорої оболонки, частковий розпад бластомерів, порушений зв’язок між ними, фрагментація цитоплазми, здавлення бластомерів Невідповідність між стадією розвитку і віком ембріонів, дефекти прозорої оболонки (тріщини, сколи), розпад бластомерів, сильне їх здавлення Кругла форма, прозора оболонка однакової товщини, перивітеліновий простір вузький, прозорий, чітке диференціювання клітин трофобласту чи ембріобласту, чітко виділяється бластоцель Прозора оболонка стоншена, порожнина бластоцисти велика, займає весь перивітеліновий простір, має гладеньку поверхню, чітку диференціацію клітин, бластоцель не виражений, у перивітеліновому просторі гранули, включення, клітини трофобласту дещо здавлені Перивітеліновий простір збільшений, є включення, гранули, бластоцель не виражений, немає диференціації між клітинами трофобласту чи ембріобласту Дефект прозорої оболонки (тріщини, сколи), наявність гранул, клітинних фрагментів у перивітеліновому просторі, часткове руйнування клітин,здавлення бластоцеля Значний дефект прозорої оболонки, розпад бластомерів, рихле їх з’єднання	Відмінно Добре Задовільно Умовно придатні Непридатні Відмінно Добре Задовільно Умовно придатні Умовно непридатні	5 4 3 2 1 5 4 3 2 1	+ + + + – + – – – – + + + + – + – – – – –

Після оцінки зародків їх культивують при 37⁰С до моменту пересадки чи залишають для зберігання.

Для заморожування зародків готують середовище з наступних компонентів (в г/л): натрію хлорид 8,0; калію хлорид 0,2; гідроортофосфат (дінатрійфосфат) безводний 1,15; дигідроортофосфат (монокалійфосфат) однозаміщений 0,2; магнію хлорид, що містить 6 молекул води, 0,1; калію хлорид безводний 0,1; натрію піруват – 376; глюкоза – 1,0. В цей розчин додають 20 % фетальної сироватки крові теле і 100 тис. ОД/л пеніциліну (калієвої солі). Середовище готують в стерильних умовах в день використання. Частину середовища використовують для виготовлення робочого розчину (до 1 л середовища додають 1000 ОД пеніциліну і 2 мл фетальної сироватки), потім готують серію розчинів з різною концентрацією гліцерину за методикою, викладеною в інструкції, і насичують зародок гліцерином одно- чи багатоступеневим способом, цей процес контролюють під мікроскопом в стерильних умовах при температуре 20°С.

Насичені гліцерином зародки розфасовують в пайети для заморожування і пересадки. При цьому набір середовищ проводять в наступному порядку: 0,75 М розчин сахарози в 20 % розчині ФС в ФСБ, повітряна кулька 2...3 мм; ембріон в 1 М розчину гліцерину в 20% розчині ФС в ФСБ, повітряна кулька 3...5 мм; простір пакети, що залишивсся заповнюють 0,75 М розчином сахарози в 20 % розчині ФС в ФСБ.

При заправці ембріона в пайету необхідно слідкувати, щоб середовище з гліцерином знаходилося від краю пайети з пробкою на відстані 66±3 мм. Порядок розміщення і кількість середовища вказана на рис. 7.

Установка для заморожування ембріоном складається з посудини Дьюара, контейнера для пайет, штатива для кріплення контейнера на горловині посудини Дьюара і термопар для уста­новки програми охолодження.

Після цього зародок відразу ж заморожують в скляних пробірках чи ампулах, пластикових соломинках, які маркірують. Охолодження проводять в декілька етапів: 1) знижують температуру від 20⁰С до -5...-7 °С зі швидкістю 1-10°С за 1 хв.; 2) при -6...-7⁰С проводять штучну кристалізацію, торкаючись пінцетом, переохолодженням в рідкому азоті, поверхні контейнера із зародками; 3) продовжують охолоджувати зі швидкістю 0,3°С за 1 хв. до -36°С; 4) занурюють в рідкий азот для швид-

кого охолодження до -196°С. Зберігають заморожені ембріони в посудинах Дьюара.

Відтаювання проводять, переносячи пакету з каністри посудини Дьюара в водяну баню кімнатної температури (20...22 °С).

Після відтавання вміст пакети перемішують струшуванням.

Через 5 хв. Після змішування середовищ ембріони оцінюють мікроскопічно через прозору стінку пакети. Якщо ж ембріони поміщені у французькі пакети, в яких немає можливості оцінити ембріон через стінку, їх вміст виливають в чашку Петрі і досліджують під мікроскопом. Для пересадки придатні непошкоджені ембріони, що мають нормальну морфологічну структуру. Можливо також використання ембріонів з незначними пошкодженнями – розриви одного чи декількох бластомі рів, незнане порушення зони пелюцида.

Після відтавання ембріони необхідно використати на протязі 2 год.

Короткочасне зберігання ембріонів. Короткочасне зберігання доцільне, якщо розсинхронізація між стадію розвитку ембріона і статевим циклом реципієнта не перевищує 1,5 доби.

Для короткочасного зберігання ембріон заправляють в пайету наступним чином: насмоктують 20 % розчин ФС в ФСБ чи СФСБ на довжину 30...45 мм, потім повітряну кульку на 5...10 мм, 20 % розчин ФС в ФСБ (на 20...30 мм) з ембріоном, знову повітряну кульку – 5... 10 мм і простір, що залишився, заповнюють 20 % розчином ФС в ФСБ. Для заправки середовища і ембріону використовують 1 мл полімерний шприц, який з’єднують з пайетою за допомогою полімерної трубки. Забір ембріона в пайету здійснюють під мікроскопічним контролем,

Для зберігання ембріонів при 0°С використовують льодяну баню, змішуючи розтовчений лід з дистильова­ною водою у співвідношенні 1:1. В якості ємності використовують побутовий термос. При 0°С можливе зберігання зародків на протязі 2 діб. Перед використанням пакети виймають з льодяної бані, вилучають з поліетиленового чохла і заправляють в інструмент для пересадки. З часу вилучення пакети з льодяної бані до пересадки не повинно пройти більше 2 год.

Розроблено і інші способи культивування зародків поза організмом, що дозволяють зберігати їх життєздатність до 24-48 год. Зародки можна культивувати в пробірках, а також в ампулах і пайетах з полівінілхлориду. До 4-7 днів зберігати їх можна в перев’язанному яйцепроводі кролика. Однак найбільш перспективним методомє глибоке заморожування зародків в рідкому азоті при температурі -196°С. Зародки великої рогатої худоби краще інших переносять заморожування і розморожування; виживаність – 50-70%.

Інтервал часу між одержанням зародку і початком наступного технологічного етапу (короткочасного зберігання, кріоконсервації) не повинен перевищувати 2 год.