Лабораторная работа №312

Определение арсеназо 1 и голубого декстрана в их смеси.

Литература:

ФХМА, М. 2001г, стр. 432-441

Краткое теоретическое введение:

Общая характеристика метода

Гель-хроматография, или гель-проникающая, или эксклюзионная хроматография является одним из вариантов жидкостной хроматографии, в котором растворен­ное хроматографируемое вещество распределяется между раство­рителем, окружающим гранулы сорбента (подвижная фаза), и растворителем, находящимся внутри пор гранул сорбента (непод­вижная фаза). Ввиду того, что сорбенты, используемые в гель-хроматографии, имеют различные по размерам поры, то разделе­ние в данном случае зависит от соотношения размеров молекул разделяемых веществ и размеров пор сорбента. Помимо разме­ров, которые можно в первом приближении принять пропорцио­нальными молекулярным массам, существенную роль в гель-хро­матографии играет форма молекул. Особенно большое значение этот фактор имеет для растворов полимеров, в которых при од­ной и той же молекулярной массе молекулы могут принимать различную форму (сферическую или другую) в соответствии с их конформационной подвижностью и вследствие этого они по-раз­ному ведут себя в колонке. Дальнейшие рассуждения справедли­вы для молекул, имеющих сферическую форму.

При прохождении через колонку компоненты смеси разделя­ются на фракции в соответствии с их молекулярными массами; первыми вымываются (элюируются) наиболее крупные молеку­лы, особенно такие, у которых размеры молекул превышают раз­меры пор сорбента, так как они не в состоянии проникнуть в по­ры и остаются только в окружающем сорбент слое растворителя (внешнем объеме). При промывании колонки растворителем ско­рость движения таких молекул максимальна. Молекулы меньшего размера будут проникать в поры полностью или частично (в зави­симости от размера пор), и весь процесс разделения будет зави­сеть, кроме размера пор сорбента, от коэффициента диффузии разделяемых молекул. Согласно уравнению Эйнштейна коэффи­циент диффузии D_H обратно пропорционален радиусу частицы r сорбента:

где R — универсальная газовая постоянная; Т— абсолютная тем­пература; η — вязкость среды; N_A — число Авогадро.

Сорбенты.

В зависимости от свойств хроматографируемых со­единений в гель-хроматографии применяют гидрофильные или гидрофобные сорбенты с жесткой, полужесткой и мягкой матри­цей. В качестве гидрофильных сорбентов используют мягкие декстрановые гели (сефадексы и молселекты), полиакриламидные ге­ли (биогели), гидроксиалкилметакрилатные гели (сфероны), а так­же макропористые силикагели и макропористые стекла (жесткие сорбенты). В качестве гидрофобных сорбентов применяют неко­торые типы сефадексов, полистирольные гели (стирогель, пора-гель), поливинилацетатные гели и также силикагель и макропо­ристое стекло (порасил).

Основное требование к работе сорбентов в гель-хроматогра­фии — исключить адсорбцию и ионный обмен разделяемых ве­ществ, т. е. разделение должно проходить только за счет размеров молекул. Среди гидрофильных сорбентов наиболее применимы­ми являются декстрановые гели — сефадексы. На примере сефадекса ниже рассмотрены физико-химические основы удерживания в гель-хроматографии, которые справедливы для любых других сорбентов в данном хроматографическом методе.

Декстран — растворимый линейный полисахарид с молеку­лярной массой до 10 млн., очень гидрофилен вследствие высоко­го содержания гидроксильных групп. При частичном гидролизе в разбавленной кислоте декстран распадается на фракции, имею­щие различную молекулярную массу. Используя реакцию декстрана с эпихлоргидрином, получают трехмерный, нерастворимый в воде гель, называемый сефадексом. Он выпускается в виде гра­нул. Степень набухания и размеры пор в фракции сефадекса за­висят, главным образом, от степени сшивки линейного полимера декстрана и его молекулярной массы. Чем сильнее набухаемость в воде фракций сефадекса, тем больше размеры пор и тем боль­шие по размеру молекулы можно разделять на данной фракции.

Сефадексы практически не оказывают химического действия на исследуемые вещества и не изменяют их природы. Они устой­чивы к органическим растворителям, к разбавленным растворам кислот и щелочей в интервале рН от 2 до 10.

Растворитель в колонке, заполненной сорбентом, например гелем, состоит из неподвижной фазы (растворитель в порах геля) и подвижной фазы (растворитель между гранулами геля). Общий объем столбика геля (объем колонки) V_t складывается из внешне­го объема (объема растворителя между гранулами, т. е. подвиж­ной фазы) V_o , внутреннего объема (объема растворителя внутри гранул, т. е. неподвижной фазы) V_H и объема сухого геля (объема матрицы) V_м:

Значение V_о определяют, пропуская по колонке высокомоле­кулярное вещество, не способное проникать в гранулы геля, т. е. размер молекул которого больше размера пор геля. Объем раство­рителя, прошедшего через колонку от момента внесения высоко­молекулярного вещества до момента появления максимума его концентрации в элюате на выходе колонки, точно соответствует внешнему объему V_o. Значение V_H определяют по формуле:

где а — масса сухого геля, г; S— емкость геля по растворителю, г/г геля; р — плотность растворителя, г/см³.

Если размеры молекул вещества значительно меньше пор гра­нул геля и беспрепятственно проникают внутрь пор, то для таких молекул коэффициент распределения К_Д = 1. Молекулы вещест­ва, по своим размерам занимающие промежуточное положение, могут проникать в поры ограниченно, т. е. для них доступны не все поры и, следовательно, не весь внутренний объем гранул. Для них справедливо соотношение: 0 < К_Д < 1. При разделении на данном геле коэффициент К_Д является константой вещества и за­висит только от размеров и конформации молекул вещества.

Параметры элюирования. Удерживание веществ в гель-хрома­тографии (объем удерживания V_R) подчиняется общему уравне­нию хроматографии:

Из-за сложности определения объема растворителя внутри пор, т. е. величины V_н, вместо К_Д в гель-хроматографии иногда используют величину К_аv — так называемую константу доступно­сти. От К_Д она отличается тем, что вместо внутреннего объема V_H для ее вычисления берут общий объем геля. Константу доступно­сти вычисляют по формуле:

Различие между К_Д и К_аv тем меньше, чем более пористым яв­ляется сорбент. Значения К_Д и K_av изменяются от 0 до 1 только в отсутствие взаимодействия с фазой геля. Если эти константы превышают единицу, то, значит, на гель-фильтрацию накладыва ются другие процессы, в частности, адсорбция на поверхности ге­ля и распределение между раствором и фазой геля в целом По­этому общее уравнение, описывающее процесс гель-хроматогра­фии, имеет вид:

где S — поверхность гранул сорбента; К₁ = К_Д; К₂ и К₃ соответст­венно коэффициенты адсорбации и распределения.

В этом уравнении второй член описывает проникновение ве­щества в поры, третий член К₂S — адсорбцию веществ на скелете сорбента (для слабонабухающих), четвертый член К₃V_м — распре­деление вещества между подвижной фазой и фазой геля в целом, что наблюдается только для малопересеченных сильнонабухающих гелей, для которых V_H >> V_M. Для таких гелей принимают, что не существуют раздельно поры и матрица, а есть одна систе­ма, в которой и происходит распределение макромолекул.

Явления адсорбции и распределения в гелях разделить очень трудно, и обычно оба явления рассматривают вместе. Например, низкомолекулярные ароматические и гетероциклические соеди­нения (фенол и пиридин) сильнее задерживаются в гранулах сефадекса, чем это можно ожидать только вследствие диффузии, т. е. V_R > V_{R теор}, что, вероятно, можно объяснить в некоторых случаях образованием водородных связей между ОН-группами сефадекса и молекулами разделяемых соединений. В отсутствие взаимодействия веществ с фазой геля К₂ = 0 и К₃ = 0 и общее уравнение приобретает первоначальный вид.

Элюенты. В гель-хроматографии элюенты (подвижная фаза) выбирают, главным образом, исходя из требований, чтобы они растворяли разделяемые вещества и обладали малой вязкостью. Для гидрофильных веществ при работе с мягкими гелями исполь­зуются водные растворы с определенной ионной силой и рН. Для разделения полимеров, не растворимых в воде, применяют орга­нические растворители такие, как тетрагидрофуран, диметилформамид, толуол и др. Кроме того, при выборе элюента следует учи­тывать, что подвижная фаза должна быть совместима с исполь­зуемым сорбентом. Иногда замена одного растворителя другим приводит к достижению разделения вследствие взаимодействия растворителя и разделяемых веществ.

В разделении методом гель-хроматографии участвует лишь незначительная часть объема колонки (V_t — V_о) (см. рисунок), по­этому число компонентов, которое можно разделить, ограничено. И, как следствие, в гель-хроматографии применяют довольно длинные колонки, но в этом случае происходит размывание зон и увеличивается ВЭТТ. Особенно значительно размывание зоны в колонке при разделении высокомолекулярных веществ, так как на ВЭТТ влияет скорость диффузии вещества внутрь пор: чем больше молекулярная масса диффундирующего вещества, тем больше сопротивление массопередаче (меньше скорость диффузии) при определенной молекулярной массе оно достигает мак­симума а затем начинает уменьшаться и становится равным ну­лю когда размеры молекул становятся больше размеров пор. Вследствие этих причин максимальное число разделяемых ком­понентов в гель-хроматографии в три раза меньше, чем на анало­гичной колонке в газовой или жидкостной хроматографии при равном числе теоретических тарелок.