Возможности метода.

Гель-хроматография широко применяет­ся в биохимии, синтетической органической химии и химии по­лимеров. Основные направления применения гель-хроматогра­фии следующие.

1. Групповое отделение высокомолекулярных соединений от низкомолекулярных. В биохимии это разделение называется обессоливанием. Этот метод позволяет получить чистые белки, нук­леиновые кислоты с большой молекулярной массой, при этом низкомолекулярные соли, например NaCl, задерживаются в по­рах сорбента.

2. Разделение (фракционирование) компонентов смеси, разли­чающихся по молекулярным массам, но не столь значительно, как для указанных в пункте 1. Например, на сефадексе G-150 достигается разделение ферментов селезенки с молекулярными массами 100000, 45000 и 24000. В связи с разработкой сорбентов особо высокой дисперсности гель-хроматографию все чаше применяют для разделения низкомолекулярных соединений, например, триглицеридов выс­ших жирных кислот (М ≈ 200 - 500) в процессе физико-хими­ческих превращений олигомеров в полимеры (М ≈ 500 - 1000).

3. Определение молекуляр­ных масс белков, олигомеров, полимеров, углеводородов, ос­нованное на линейной зависи­мости объемов выхода веществ от молекулярной массы:

Каждый сорбент характеризуется своей градуировочной кри­вой, по которой находят молекулярные массы веществ.

В качестве калибровочных соединений (стандартов) использу­ют вещества, близкие по своей природе к исследуемым вещест­вам. Так как на данной колонке объем выхода вещества воспро­изводится очень точно, то вначале через колонки пропускают стандартные вещества и определяют их объемы выхода, строят градуировочный график, а затем, зная V_R вещества с неизвестной молекулярной массой, находят ее по графику.

4. Тонкослойная гель-хроматография находит широкое приме­нение для определения молекулярно-массового и композиционно­го распределения полимеров, в клинической диагностике как экс­пресс-метод для определения патологических белков в сыворотке крови, спинномозговой жидкости, для проверки чистоты препа­ратов и т. д.

Экспериментальная часть.

Разделение красителя арсеназо 1 (молекулярная масса 592,3) и нитрофенола (молекулярная масса 139,1) на колонке с сефадексом G-25 происходит вследствие различия их молекулярных масс. Первым вымывается арсеназо 1, как имеющий большую молеку­лярную массу, а затем нитрофенол. Для определения внешнего объема колонки (величина V_o) в анализируемую смесь добавляют высокомолекулярный полисахарид—голубой декстран (молеку­лярная масса до 2 млн.) Это вещество вымывается из колонки во внешнем объеме.

Количественное определение голубого декстрана, арсеназо 1 и нитрофенола проводят фотометрически по их собственной окраске.

Приборы и реактивы:

Хроматографическая колонка с сефадексом G-25 длиной 45 см, диаметром 2,5 см.

Фотоэлектроколориметр.

Градуированные пробирки вместимостью 5 мл.

Стаканы вместимостью 100 мл.

Пипетки вместимостью 1 мл.

Раствор NaOH, 20%-ный.

Анализируемый раствор: смесь растворов голубого декстрана, арсеназо 1 и нитрофенола, содержащие по 1 мг/мл, подкисленная двумя каплями 2М СН₃СООН.