Гистидиновый оперон s. Tuphimurium

Лактозный оперон E.coli – пример негативной регуляции транскрипции в случае индуцируемых генов. Рассмотрим теперь, как действует система негативного контроля в случае репрессированного оперона на примере группы генов, детерминирующих биосинтез аминокислоты гистидина у S. tuphimurium. Гистидиновый (his) оперон состоит из девяти структурных генов (his E, I, F, A, H, B, C, D, G), порядок расположения которых не соответствует очередности осуществления кодируемых ими этапов метаболизма гистидина, и прилегающей к ним справа операторной последовательности (О). Особенностью регуляции his–оперона является участие корепрессора, в отсутствии которого указанные структурные гены транскрибируются. Этим корепрессором служит особым образом модифицированная гистидиновая тРНК. Активный корепрессор образуется под контролем пяти генов, не сцепленных друг с другом и с his – опероном. Мутации в любом из этих генов – регуляторов (his R, S, T, U, W) приводят к конструктивному синтезу ферментов биосинтеза гистидинов. Таким образом, в случае his–оперона отсутствует продукт – репрессор, непосредственно выключающий транскрипцию структурных генов путем присоединения к оператору. Вместо одного гена–регулятора имеется целых пять генов, мутации в которых снижают концентрацию и активность корепрессора, способного присоединяться к оператору, блокируя тем самым транскрипцию структурных генов his–оперона. Истинного репрессора his–оперона не найдено. Вместе с тем регуляция активности his–оперона, как и других репрессированных оперонов, например оперона биосинтеза триптофана, связана с активностью специального контролирующего элемента–аттенюатора(от англ. аttenuate – ослаблять), представляющего собой участок ДНК, локализованный в случае his–оперона между оператором и первым структурным геном his G. Аттенюатор обеспечивает терминацию иРНК в начале оперона. В присутствии активированной гистидиновой тРНК (то есть когда в клетке есть корепрессор) синтез иРНК терминируется в локусе аттенюатора и, таким образом, транскрипции структурных генов не происходит.

Наряду с аттенюатором, выполняющим функцию негативно действующего регулятора транскрипции, существует и позитивный регулятор his–оперона. Им служит гуанозинтетрафосфат, присутствие которого облегчает присоединение РНК- полимеразы к промотору.

Триптофановый оперон e .Coli

Биосинтез аминокислоты триптофана – многостадийный процесс, в результате которого хоризмовая кислота превращается вначале в антраниловую кислоту, затем в фосфорибозилантранилат, далее в индолглицерофосфат и на следующем этапе – в триптофан. Эта цепь ферментативных реакций кодируется пятью структурными генами, образующими триптофановый (trp) оперон. Наиболее проксимально к регуляторной промотор – операторной зоне расположен ген trpE, а наиболее дистально– ген trpA. Ген trpR, кодирующий белок–репрессор, расположен на значительном удалении от trp–оперона: их разделяют 73 генетические карты E .coli. Оператор trp–оперона находится внутри промотора, содержит палиндром, образованный двумя инвертированными повторами длиной 10 п.н. Анализ полярных мутаций в левой части оперона выявил, что внутри него перед геном trpC имеется еще один промотор, обеспечивающий конститутивную экспрессию генов trpC, B и A.

Trp–оперон обладает важными особенностями, характерными и для других бактериальных оперонов, контролирующих биосинтез аминокислот. Регуляция биосинтеза триптофана осуществляется на трех уровнях. Первый из них связан с ингибированием конечным продуктом, не затрагивающим непосредственно активность генов. Суть этого феномена состоит в том, что один из продуктов биосинтетической цепи, обычно конечный, подавляет активность продуктов – предшественников. Например, при высоких концентрациях триптофана в среде фермент антранилатсинтетаза обладает значительно меньшим сродством к своим субстратам – глутаминовой и хоризмовой кислотам. Ферменты, чувствительные к такому ингибированию, часто состоят из нескольких субъединиц, одна из которых несет участок, связывающийся с субстратом, а другая – с конечным продуктом. При взаимодействии с последним фермент изменяет свою конформацию, что снижает его сродство к субстрату. Белки, способные к подобным превращениям, называютсяаллостерическими.Ингибирование конечным продуктом не следует путать с репрессией, то есть с ингибированием синтеза фермента в результате выключения транскрипции кодирующего его гена.

Второй тип регуляции биосинтеза триптофана осуществляется на уровне взаимодействия репрессора с оператором. В отличие от оперонов, определяющих утилизацию сахаров, цАМФ и белок САР не участвуют в регуляции оперонов, детерминирующих биосинтез аминокислот. Второе отличие состоит в том, что молекула–эффектор не индуцирует генную активность в результате отсоединения репрессора от оператора, а, напротив, подавляет функционирование структурных генов вследствие присоединения к оператору апорепрессора. Последний представляет собой комплекс репрессора с конечным продуктом всего биохимического пути, то есть в данном случае с триптофаном. Таким образом, триптофан обеспечивает оба уровня регуляции собственного биосинтеза. С одной стороны, он действует как аллостерический ингибитор фермента антранилатсинтетазы, а с другой – входит в состав апорепрессора, блокирующего транскрипцию оперона. При избытке триптофана в среде апорепрессор подавляет образование иРНК, что снижает уровень продукции ферментов биосинтеза триптофана примерно в 70 раз.

Казалось бы, такой двойной системы регуляции достаточно, чтобы клетка не продуцировала аминокислоту, имеющуюся в окружающей среде в достаточном количестве. Однако, секвенировав операторный и промоторный участки trp–оперона, Яновский с соавторами обнаружили еще один механизм регуляции его работы. Оказалось, что каждая иРНК, образующая при транскрипции trp–оперона, имеет район, списываемый с последовательности ДНК, лежащей между оператором и триплетом, кодирующим стартовый кодон АУГ, с которого инициируется трансляция полицистронной иРНК. Эта последовательность, состоящая из 162 п.н., называется лидирующей. При сравнении влияния различных делеций в trp–опероне на его транскрипцию установлено, что последовательность длиной 30–60 нуклеотидов, примыкающая к гену trpE, является контролирующим элементом - аттенюатором. Подобный элемент, как уже говорилось, участвует в регуляции и his–оперона. Аттенюатор терминирует транскрипцию иРНК, начавшуюся от промотора. В результате образуется короткая иРНК, комплементарная первым 130 нуклеотидам лидирующей последовательности. Прекращение транскрипции в сайте–аттенюаторе не обязательно и зависит от количества триптофана в клетке. При росте клеток в среде с избытком триптофана из каждых десяти молекул РНК–полимеразы лишь одна преодолевает аттенюаторный барьер и начинает транскрипцию структурных генов. В случае недостатка экзогенного триптофана число молекул РНК–полимеразы, прошедшие аттенюатор, существенно увеличивается. 42 из 162 кодонов лидирующей последовательности детерминируют трансляцию пептида из 14 аминокислот. Лидерный пептид регулирует взаимодействие молекул триптофановых тРНК с иРНК на рибосомах. Аттенюаторы обнаружены в различных оперонах и у различных бактерий. Особенность их структуры – наличие палиндрома, ведущего к образованию терминирующей шпильки в иРНК. Сочетание механизмов супрессии и аттенюации обеспечивает более эффективную и адекватную условиям внешней среды регуляцию генной активности.