Этапы репликации

Рассмотрим механизм осуществления основных этапов репликации ДНК - инициации и элонгации. Инициация репликации происходит в локусе ori и начинается с появления Y-образной структуры - репликативной вилки, образование которой связано с раскручиванием дуплекса ДНК и локальным разделением ее цепей. Продвижению репликативной вилки вдоль каждой из цепей ДНК предшествуют стабилизация ее расплетенной сверхскрученной структуры ферментом SSB (от англ. single strand binding), специфично связывающимся с однонитевой ДНК, и появление затравочного полинуклеотида, к 3ОН-концу которого начинают присоединяться последующие нуклеотиды. Для ДНК полимеразы I в системе in vitro такой затравкой служит предшествующая цепь ДНК. Однако in vivo во всех исследованных случаях подобной затравкой служит не ДНК, а сравнительно короткая РНК, синтез которой осуществляется РНК-полимеразой, либо особым ферментом “праймазой”. Образующиеся на коротком участке между ДНК матрицей и РНК затравкой гибриды обеспечивают, как показано у E.coli, возможность следующего за инициацией этапа синтеза ДНК - элонгации ее цепей в направлении 5-3, осуществляемой от 3ОН-конца РНК затравки ДНК-полимеразой III. Немного позднее ставшая ненужной РНК-затравка удаляется, и в освободившийся участок встраиваются нуклеотиды, комплементарные ДНК-матрице. Ковалентное сшивание этой ДНК, синтезированное вместо РНК-затравки, с основной, вновь образованной цепью ДНК, осуществляет ДНК-лигаза, катализирующая образование фосфодиэфирных связей между соседними 3ОН и 5-Ф-концами.

Поскольку две цепи дуплекса ДНК антипараллельны, синтез комплементарных им нитей должен в одном случае идти в направлении 5-3, а в другом - в направлении 3-5. Первая нить называется лидирующей, вторая- запаздывающей. Как отмечалось, все известные ДНК-полимеразы нуждаются для своей активности в свободном 3ОН-конце, к которому они присоединяют нуклеотиды. В результате происходит рост цепи ДНК в направлении 5-3. Как же в таком случае осуществляется синтез цепи ДНК в направлении 3-5? Предполагалось, что для этого необходима какая-то особая ДНК-полимераза. Оказалось, однако, что синтез 3-5-цепей носит прерывистый характер. Он осуществляется комплексом ферментов, называемым праймосомой, в состав которого входит обычная ДНК-полимераза, синтезирующая сравнительно короткие (длиной 100-200 нуклеотидов у эукариот и 1000-2000 нуклеотидов у E.coli) фрагменты ДНК в направлении 5-3. Синтез каждого такого фрагмента инициируется РНК-затравкой длиной около 10 нуклеотидов. После удаления РНК-затравки и завершения синтеза ДНК на освободившихся участках, эти фрагменты, названные по имени открывшего их японского ученого Оказаки, объединяется между собой ДНК-лигазой. Такой, казалось бы, вынужденный способ синтеза ДНК у некоторых организмов осуществляется на обеих цепях, т.е и тогда, когда в принципе в нем нет необходимости.

Помимо рассмотренного известен еще один тип репликации ДНК - по способу “катящегося кольца”; так реплицируются кольцевые ДНК некоторых фагов, вирусов, митохондрий, плазмид. При этом способе в одной из цепей исходной ДНК (“+”- цепь) происходит разрыв и освободившийся 5-конец присоединяется к клеточной мембране. На 3-конце “+”-цепи по комплементарной матрице не разорванной “-”-цепи начинается прерывистый синтез дочерней цепи. При этом происходит вращение кольцевой “-”-цепи родительской молекулы, обеспечивающее “сползание” с нее удлиняющейся дочерней цепи. Последняя нарезается на куски, соответствующие по длине исходной молекуле ДНК. Такой способ репликации обусловливает образование многих копий материнской ДНК. Осуществляется он и в случае переноса плазмидной или хромосомной ДНК от донора к реципиенту в процессе конъюгации у бактерий.

Репликация ДНК тесно связана с клеточным делением и играет для него роль биологических часов. У бактерий подавление репликации до ее окончания блокирует возможность их деления. Врастание клеточной мембраны обеспечивает сегрегацию (расхождение) вновь синтезированных молекул между дочерними клетками.

Необходимо иметь в виду, что в живой клетке репликация ДНК существенно зависит от особенностей ее вторичной структуры, связи с клеточной мембраной и различными белками, входящими вместе с ДНК в состав нуклеоидов (эквивалентов ядра) у прокариот и хромосом у эукариот.