Роль нуклеиновых кислот как носителей генетической информации

Большую роль в выяснении химической природы генов сыграли опыты Ф. Гриффитса (1928), обнаружившего у пневмококков (Streptococcus pneumonia) явление трансформации. Известно несколько типов пневмококков, различающихся по виду и размеру колоний, наличию или отсутствию плотной полисахаридной капсулы, защищающей их от фагоцитоза. При росте на питательной среде пневмококки, окруженные капсулой, образуют крупные гладкие колонии. Такие пневмококки, отнесенные к типу S (от англ. smooth - гладкий), являются возбудителем пневмонии у человека и некоторых животных, в том числе мышей. Примерно одна из 10⁷ клеток пневмококков может спонтанно превратиться (мутировать) в форму, лишенную полисахаридной капсулы. Бескапсульные пневмококки непатогенны, поскольку быстро уничтожаются путем фагоцитоза в организме зараженного животного или человека. На поверхности питательной среды такие бактерии, отнесенные к типу R (от англ. rough - шероховатый), образуют мелкие шероховатые колонии, которые легко отличить от гладких колоний, образуемых пневмококками типа S. Пневмококки, кроме того, различаются по типу поверхностных антигенов, определяемому особенностями капсульного липополисахарида (например, тип IIIS, IIR и др.), что служит еще одним важным признаком, наследующимся в потомстве. Введение мышам убитых нагреванием пневмококков типа IIIS, либо живых пневмококков типа IIR, не вызывало гибели животных. Напротив, введение живых бактерий типа IIIS, как и предполагалось, привело к развитию тяжелой пневмонии и гибели большинства зараженных мышей. Неожиданными оказались результаты опытов, в которых мышам вводили смесь убитых бактерий типа IIIS и невирулентных пневмококков типа IIR. В этом случае многие животные также погибли от пневмонии, а из организма погибших мышей были высеяны живые пневмококки типа IIIS. Такое превращение некапсульных форм бактерий в вирулентные капсульные не зависело от организма хозяина, поскольку наблюдалось и в опытах in vitro, когда в пробирку, содержащую живые R-клетки, добавляли убитые клетки типа IIIS, либо экстракты из них. В обоих случаях при высеве бактерий из пробирок на чашки Петри с питательной средой формировались не только шероховатые колонии, образованные бескапсульными бактериями, но обнаруживались и гладкие колонии, состоящие из клеток капсульных бактерий. Частота появления последних значительно превышала частоту спонтанного мутирования бактерий из IIR-типа в IIIS-тип.

Эксперименты Гриффитса выявили существование некоего “трансформирующего начала”, превращающего клетки пневмококков типа IIR в клетки типа IIIS. Однако сами по себе эти эксперименты не выявили химической природы вещества, обеспечивающего стойкое, наследуемое в потомстве превращение бактерий одного типа в другой. Это было сделано спустя 16 лет, когда О. Эвери, К. Мак-Леод и К. Мак-Карти (1944) показали, что если ДНК, выделенную из убитых нагреванием пневмококков типа IIIS, смешать с живыми бактериями типа IIR, то последние приобретают способность формировать на агаре гладкие крупные колонии, состоящие из бактерий типа IIIS. Следует иметь в виду, что в 20-40 гг. нашего века господствовало представление, согласно которому основным веществом наследственности является белок. Поэтому для доказательства того, что ДНК действительно являлась трансформирующим началом в опытах Гриффитса, препараты ДНК из пневмококков типа IIIS делили на порции, каждую из которых обрабатывали дезоксирибонуклеазой (ДНК-азой), рибонуклеазой или протеазой - ферментами, разрушающими соответственно ДНК, РНК или белки, а затем применяли для трансформации клеток типа IIR в тип IIIS. Оказалось, что только обработка ДНК-азой полностью снимала трансформирующую активность препаратов ДНК. С другой стороны, по мере очистки ДНК от примесей белка частота трансформации увеличилась. Эта очистка была доведена до такой степени, что в препарате ДНК, полностью сохранившем трансформирующую активность, белка было в 10 тыс. раз меньше, чем ДНК. Обе группы фактов явились доказательством того, что генетическая информация, кодирующая капсульный полисахарид и его антигенную специфичность у пневмококков, находится в ДНК. Дальнейшее развитие этот важнейший вывод получил в экспериментах А. Херши и М. Чейза (1952). В качестве объекта генетических исследований был использован один из вирусов бактерий - бактериофаг Т2, состоящий лишь из белковой оболочки или чехла - капсид, и упакованной в него молекулы ДНК. Для доказательства проникновения ДНК в бактериальные клетки, инфицированные фаговыми частицами, впервые были использованы радиоактивные изотопы, избирательно включающиеся в молекулы ДНК или белка.

Заражение бактериальных клеток фагами приводит к резкой перестройке метаболического аппарата хозяина, направленной на обеспечение репродукции фага. Процесс этот происходит очень быстро, так что в некоторых случаях от момента заражения клетки до выхода из нее сотен вновь образовавшихся частиц зрелого фага (потомства лишь одной фаговой частицы, генетический материал которой проник в бактерию), проходит лишь 15-20 минут. К таким высокоинфекциозным фагам относится и фаг Т2, размножающийся в клетках бактерии кишечной палочки (Escherichia coli). Вся репродукция фага Т2 происходит внутри клетки E.coli. Однако оставалось неизвестным, проникает ли в момент заражения в клетку вся фаговая частица, либо только какая-то ее часть. Фаговые ДНК и белки были помечены соответственно изотопами ³²Р и ³⁵S путем размножения фаговых частиц на клетках E.coli, выращиваемых в среде, содержащей один из указанных изотопов. Такая специфическая метка дает возможность проследить за поведением каждого компонента фаговой частицы - белка и ДНК. Фаги Т2, меченные по ³²Р либо по ³⁵S, по отдельности смешивали на несколько минут с клетками, чтобы дать фаговым частицам адсорбироваться на бактериях. Затем клетки с прикрепленными к ним мечеными фагами резко встряхивали на специальном аппарате - блендере, или сместителе Уоринга. Такое воздействие позволяет отделить компоненты фага, проникшие внутрь бактериальной клетки, от оставшихся снаружи. Последующим центрифугированием инфицированные клетки осаждались на дне пробирок, в то время как компоненты фага, не проникшие в клетку и отделенные от нее встряхиванием, оставались в надосадочной жидкости. Определение радиоактивности в осадке и надосадочной жидкости дало резко отличающиеся результаты в зависимости от того, какие из меченых частиц были взяты в эксперимент. В случае использования фагов, ДНК которых метились по ³²Р, практически вся радиоактивность оказалась в осадке, т.е. в клетках. При использовании же фагов, меченных по ³⁵S, основная часть радиоактивности оказалась вне клеток в надосадочной жидкости. Эти данные показали, что во время инфекции в клетку проникает преимущественно фаговая ДНК и, следовательно, именно ДНК необходима для образования фагового потомства. Позднее, когда из E.coli научились получать протопласты, т.е. клетки с удаленной стенкой, способные инфицироваться не целыми фаговыми частицами, а чистой фаговой ДНК, удалось окончательно доказать, что генетический материал Т2 и других фагов, содержащих ДНК и белок, полностью сосредоточен в ДНК. Эта ДНК содержит генетическую информацию, необходимую для репродукции фагов внутри клеток. Репродукция включает синтез новых фаговых белков для упаковки в них этих ДНК. Процесс инфекции клеток с помощью изолированных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства получил название трансфекции.

Опыты Эвери с соавторами на бактериях, а также опыты Херши и Чейза на фаге Т2, позволили сделать заключение, что, по крайней мере, у этих объектов ДНК служит хранилищем генетической информации. Вместе с тем у многих вирусов ДНК отсутствует и вместо нее в белковый чехол упакована РНК. Может ли РНК служить генетическим материалом, т.е. определять строение и функции вирусных частиц? Положительный ответ на этот вопрос был получен Х. Френкель-Конратом и Б. Зингером (1957), работавшими с вирусом табачной мозаики (ВТМ). Ими показано, что РНК, а не белок родительского штамма ВТМ, определяет белковый состав и характерные признаки вирусного потомства, т.к. содержит необходимую для этого генетическую информацию.

Рассмотренные примеры свидетельствуют о том, что генетическим материалом живых организмов являются нуклеиновые кислоты, в большинстве случаев ДНК и, как исключение, РНК. Косвенно такое заключение подтверждают данные о неизменности и видоспецифичности содержания и состава ДНК в клетках животных и растений, а также факт уменьшения вдвое количества ДНК в гаплоидных гаметах с восстановлением его исходного уровня в диплоидной зиготе.