metodichka_virusologija

10

Сисунця беруть лівою рукою, притримуючи з боків великим, вказівним і середнім пальцями і розміщуючи його уздовж пальців. Правою рукою роблять ін'єкцію матеріалу під шкіру (в ділянці сідниць), уводячи голку на глибину не більш як 2 мм вище за косий зріз на її _кінці. Доза матеріалу для зараження у разі уведення під шкіру – 0,03 мл; її звичайно ділять на 2 уколи – у праву та ліву сідничні ділянки. Якщо ін'єкцію зроблено правильно, то утворюється горбик розміром в ¼ середньої горошини.

У мозок мишей-сисунців уводять 0,01—0,02 мл досліджуваного матеріалу, в черевну порожнину – 0,05 мл (про методику йшлося вище).

Стан новонароджених мишей контролюють 2 – 3 рази на день. оскільки самиці можуть поїдати хворих тварин. Загибель, що настала протягом 24 год після зараження, вважають травматичною.

Якщо клінічних проявів інфекції у заражених тварин немає, вдаються до 2 – 3 сліпих культивувань матеріалу.

ІІ. Одержання вірусвмісного матеріалу з органів та тканин експериментально інфікованих тварин

У лабораторній практиці прийняті способи умертвіння, що характеризуються простотою прийомів і викликають швидку смерть тварини. Мишей, пацюків, морських свинок розміщують у склянці, що щільно закривається зі шматочком вати, просоченим хлороформом чи ефіром. Тварини засинають і гинуть протягом 3 – 5 хв. Кроликів зморюють за допомогою повітряної емболії. Для цього в крайову вену вуха в напрямку до його основи вводять голку шприца. Поява крапельки крові свідчить про те, що голка знаходиться у вені. Після цього голку з'єднують з порожнім 10-кубовим шприцом, поршень якого витягнуть до кінця. При натисненні на поршень у кровоносну систему тварини надходить повітря, що знаходиться в циліндрі шприца, викликаючи емболію і швидку смерть.

Розтин тварин. Перед початком розтину збирають докладний анамнез (вивчають історію хвороби), що дозволяє в процесі розтину виділити головні зміни в організмі тварини, точніше визначити хворобу і вивчити її наслідки.

Труп, призначити для розтину, спочатку піддають зовнішньому огляду, визначаючи вік, масу, будову тіла, угодованість, трупні зміни, стан шкіри та видимих слизових оболонок, поверхневих лімфатичних вузлів, скелетних м’язів, кісток, суглобів. Після цього роблять розтин грудної та черевної порожнин, досліджують вилучені органи, роблять розтин носової та придаткової порожнин, шиї, розтин хребта та черепа, вилучають для дослідження головний та спинний мозок. Розтин трупів тварин роблять стерильними інструментами, дотримуючись правил асептики, обов’язково використовуючи гумові руковички.

Зовнішній огляд трупа починають з визначення віку (за станом зубів), виду, статі, породи, маси, розмірів (довжини та висоти ) тіла. При виявленні відхилень в будові тіла відмічають, в чому вони проявляються (викривлення хребта чи кінцівок, тощо). Звертають увагу на форму та розмір живота (збільшений, підтягнутий). Угодованість визначається після зняття шкіри за станом підшкірного жиру та мускулатури. У виснажених тварин жир під шкірою

11

відсутній, чітко виступають ребра, хребет. При огляді шкіри відмічають стан шерстяного покриву: блиск чи тьмяність, скуйовдженість. Звертають увагу на колір, еластичність, цілісність шкіри, наявність на ній ерозій, виразок, пустул, папул, крововиливів. Встановлюють стан слизових оболонок – колір, блиск, характер уражень та виділень (кров’янисте, гнійне, піністе).

Розтин трупів варто робити таким чином, щоб попередити внесення мікроорганізмів з поверхні в глибину тканин, а також перенос мікробів з одного органа в іншій. З цією метою рекомендується розтинати тварин в агональному стані, приспавши їх ефіром, чи негайно після смерті, тому що в найближчі години після неї проникність тканин порушується і бактерії з одного органа можуть проникнути в іншій. Особливу небезпеку в цьому відношенні представляє кишечник, вміст якого буяє мікробами.

Труп тварини черевцем догори кладуть на дерев'яну дошку чи лоток із пластинкою застиглого парафіну, розтягують пінцетом усі 4 лапи й у такім положенні фіксують їх шпильками чи невеликими гострими гвоздиками до поверхні дерева чи парафіну. Груди і черевце протирають ватою, змоченої 5% розчином карболової кислоти чи 5% розчином хлораміну, або краще змочують спиртом і підпалюють шерсть, щоб мікроби, що містяться на ній, у тому числі спороносні палички, не розліталися і не забруднювали стерильні інструменти й органи розтину трупа. У процесі розкриття дотримують загальноприйнятого порядку. Спочатку досліджують зовнішні покрови і підшкірну клітковину, потім проводять розтин, дослідження й узяття матеріалу з органів грудної порожнини, а в останню чергу розтин, дослідження й узяття матеріалу з органів черевної порожнини.

Оброблену шкіру розрізають по середній лінії живота довжиною від симфізу до грудино -ключичного зчленування. На рівні передніх і задніх лап роблять бічні надрізи. Шкірні шматки отсепаровують від підшкірної клітковини і відвертають у сторони, приколюючи шпильками до дошки.

У протоколі розтину відзначають стан підшкірної клітковини і лімфатичних вузлів у паху і пахвових западинах. Підшкірна клітковина може бути розвинута сильно, чи слабко помірно. Пахвові і пахові вузли виявляються легко. При огляді вузлів звертають увагу на їхню величину, форму і колір.

Перемінивши чи простерилізовав використані для розтину шкірних покровів інструменти, приступають до розтину грудної клітини. Грудину, захоплену пінцетом, злегка піднімають, роблять під нею невеликий надріз, вводять у нього браншу ножиців і перерізають ребра спочатку з однієї, а потім з іншої сторони. Спочатку досліджують об’єм та консистенцію легень, стан плеври (колір, блиск, тьмяність), наявність крововиливів, вузлів, еластичність, тощо. Реєструють у протоколі наявні в легенях зміни, наприклад ексудат в порожнині плеври, абсцеси, гіперемію (багряне-червоне фарбування) чи, навпаки, ішемію (недокрів'я) у легенях. Далі відмічають форму серця, стан предсердь, шлуночків, епікарду, жирової клітковини, наявність крововиливів. Шматочки органів грудної прожнини поміщають у стерильні флакони.

Після цього, перемінивши інструменти, переходять до дослідження органів черевної порожнини. Передній листок очеревини розкривають ножицями. Потім

12

оглядають печінку, селезінку, нирки, відзначаючи колір, величину органів, характеризуючи їхню консистенцію (щільна, м’яка, пухка), встановлюють наявність некрозів, крововиливів, тощо. При необхідності видаляють шлунок та кишечник і досліджують їхні відділи, колір, кількість та запах вмісту.

За умов досліду розтинають ротову та носову порожнину, вивчаючи язик, мигдалики, їхню величину, стан слизових оболонок, наявність гнійників.Розрізують глотку та стравохід, визначаючи стан слизових оболонок. Потім розрізують стінку гортані, трахеї та крупних бронхів, відмічаючи характер вмісту (кров’яниста чи піниста рідина, слиз, гній), стан слизових оболонок.

За необхідністю дослідження центральної нервової системи спочатку розтинають черепну коробку. Розріз шкіри роблять перпендикулярно до вісі тіла за вухами, на потилиці і продовжують зліва та справа до орбіт. Шкіру разом з вухами відпрепаровують і відкидають вперед, оголюючи черепну коробку. Одну браншу ножиць вставляють у вушний отвір і розрізують кістки черепа зліва та справа в напрямку до орбіт. Потім розрізують кістки черепа між орбітами і видаляють всю вирізану ділянку. Головний мозок тварин видаляють з основи черепа, піднявши його злегка розкритими браншами ножиць і підрізавши черепно-мозкові нерви та переносять на аркуш фільтрувального паперу розміром 10×10 см. Браншами ножиць відрізають по вертикальній площині невеликий шматочок його і кладуть поряд на папір. Потім відрізають наступний шар мозку, який також кладуть поруч і т.д. До кожного шматочка прикладають зверху знежирене предметне скельце, отримуючи відбитки.

Для взяття шматочків спинного мозку випилюють окремі ділянки хребта (з шийного, грудного та поперекового відділів) і стерильним металевим стержнем з ватним тампоном виштовхують ділянки спинного мозку в стерильний посуд. Після зняття тверлої мозкової оболонки вивчають спинний мозок з поверхні і на поперечному зрізі.Відмічають чіткіж меж сірої та білої речовин, колір, вологість, кровонаповнення, консистенцію, стан міжреберцевих вузлів.

Після розтину трупи тварин складають у металеві бачки з щільно закритими кришками і засипають сухим хлорним вапном. Трупи дрібних лабораторних тварин можна заливати розчином різних дезінфікуючих речовин: 5% розчином карболової кислоти, 3 – 5% мильно-карболовим розчином, 3– 5% розчином хлораміну. Трупи тварин, що загинули від зараження споровими формами мікробів, заливають вапняним молоком чи 5 – 10% розчином хлорного вапна. У дезінфікуючій рідині трупи тварин зберігаються до моменту їхнього спалювання.

Хід роботи

1.Провести маркування лабораторних тварин водними розчинами фуксину та пікринової кислоти.

2.Зафіксувати тварину на дошці для фіксації.

3.Підготувати стерильний шприц та наповнити його стерильним фізрозчином для відпрацювання експериментального інфікування лабораторних тварин.

4.Здійснити ексериментальне зараження лабораторних тварин різними методами (інтраназальним, зараженням під шкіру, внутрішньочеревинним).

13

5.Встановити у заражених лабораторних тварин наявність чи відсутність візуальних симптомів хвороби.

6.Відпрацювати метод евтаназії заражених лабораторних тварин.

7.Провести розтин трупа експериментально інфікованої лабораторної тварини з метою виявлення патологоанатомічних змін в органах і вилучити їх (мозок, легені, серце, печінка, селезінка, нирки) у стерильні чашки Петрі.

Контрольні питання

1.Охарактеризуйте тварин як модель для культивування вірусів.

2.Основні правила утримання та догляду за здоровими та інфікованими лабораторними тваринами.

3.Який принцип відбору тварин до вірусологічних досліджень? Як проводиться підготовка тварин до проведення вірусологічних досліджень.

4.З‘ясуйте поняття: «гнотобіотичні тварини», «канібалізм», «тропізм вірусів».

5.Опишіть основні засоби експериментального зараження тварин. Який принцип вибору метода зараження тварин.

6.Методика забору крові від інфікованих тварин та одержання з неї специфічної імунної сироватки та плазми.

7.Які методи розтину тварин вам відомі?

8.Як одержують вірусвміщуючий матеріал з органів та тканин інфікованих тварин?

9.В чому принцип ідентифікації вірусів на тваринах?

Лабораторна робота 4

Використання курячих ембріонів для культивування вірусів людини і тварин

Мета: ознайомлення з використанням курячих ембріонів у вірусологічних дослідженнях, проведення зараження та розтин ембріонів.

Матеріали та обладнання: курячі ембріони, вірусвмісний матеріал (вірус вакцини Ньюкасла), інструменти (ножиці, пінцети, шприці), склянки для інструментів, лабораторний посуд (піпетки Пастера та мірні на 1, 2, 5 мл, пробірки, колби, чашки Петрі), мікроскоп, лоток, ступка, центрифуга, склянки з ватою, штатив, овоскоп, олівець, підставки для ембріонів, газові та спиртові горілки, 96% етиловий спирт, 2% спиртовий розчин йоду, фізіологічний розчин, стерильний парафін, стерильний пісок, дезінфікуючий засіб, колекція ілюстративного матеріалу (таблиці, фотографії, малюнки).

Теоретичні відомості

У вірусологічній практиці курячі ембріони використовують здебільшого для виділення вірусів з клінічного і секційного матеріалу, культивування лабораторних штамів збудників, приготування діагностичних препаратів і

14

первинно-трипсинізованої культури клітин, а також для одержання вакцин. Перевагами курячих ембріонів перед лабораторними тваринами є

доступність їх для будь-якої вірусологічної лабораторії, порівняна дешевизна, простота в роботі тощо.

Для виділення вірусів застосовують курячі ембріони віком від 5 до 12 – 14 днів. При цьому вік використовуваних ембріонів, спосіб їх зараження та строки одержання

Максимальної кількості вірусів (час інкубації) залежить від біологічних особливостей культивованих вірусів і їхнього тропізму.

Перед роботою курячі ембріони витримують у термостаті при температурі 37 °С і 60 – 70% відносної вологості, що підтримується наявністю в термостаті лотків з водою. Щоб ембріональні оболонки не злипались, яйця час від часу повертають (у термостаті – вручну, кілька разів на день).

Під час пасирування лабораторних штамів вірусів на курячих ембріонах важливо дотримуватися виробленої емпірично оптимальної дози збудника. Так, для вірусу грипу вона коливається у межах 100 – 1000 ЕІД50 (ЕІД50 – ембріональне інфекційна доза з 50% ефектом, вона дорівнює найменшій кількості вірусних часток, що репродукується в 50% узятих для зараження курячих ембріонів), для вірусу паротиту – 10–100 ЕІД50 і т. д.

Перед зараженням курячі ембріони овоскопують для визначення їхньої життєздатності. Ознаки живого ембріона – наявність самостійних рухів, добре виражений судинний малюнок, пульсація судин.

Під час овоскопії визначають і позначають на шкаралупі межу повітряного мішка, місце розташування ембріона («темне око» ембріона) або роблять інші позначки, необхідні для зараження обраним методом.

І. Зараження курячих ембріонів

Існує кілька способів зараження курячого ембріона: у порожнину амніону й алантоїса, на хоріоналантоїсну оболонку, в жовтковий мішок.

Роботу з курячими ембріонами провадять у стерильних умовах (у боксі), стерильними інструментами (пінцети, ножиці, препаративна голка, шприци тощо). Після виконання певного фрагмента роботи інструменти занурюють у 70 % етиловий спирт і перед наступною маніпуляцією пропалюють. Перед зараженням шкаралупу курячого ембріона протирають запаленим спиртовим тампоном і 2 % спиртовим розчином йоду.

Об'єм досліджуваного матеріалу, що вводиться в ембріон, дорівнює 0,1 – 0,2 мл. Для виділення вірусів з одного матеріалу використовують не менше ніж чотири курячих ембріони.

Будову ембріона і місця зараження показано на рис. 1.

			15
	Алантоїсна			Хоріоналантоїсна
				оболонка
	порожнина
					Амніотична
	Повітряна				порожнина
	камера

Білок

Шкарлупа	Жовтковий
	мішок

Рис. 1 Будова курячого ембріона (голками показано місця зараження ембріона)

Зараження в порожнину алантоїса. Порожнина алантоїса є органом виділення ембріона, заповненим рідиною, що містить ізотонічний розчин різних солей. Алантоїс оточує ембріон і жовтковий мішок, розташовуючись на внутрішній поверхні шкаралупи, під хоріоном. У міру розвитку ембріона алантоїс значно збільшується, досягаючи максимуму за об'ємом алантоїсної рідини (до 7 – 10 мл) па 11 – 13-й день.

Техніка зараження курячого ембріона досить проста. У центрі тупого кінця вертикально розміщеного яйця над повітряним мішком проколюють шкаралупу, вводять голку для внутрішньо м'язових ін'єкцій на 2 – 3 мм нижче межі повітряного мішка, і туберкуліновим шприцом вприскують досліджуваний матеріал.

Другий спосіб зараження в порожнину алантоїса – матеріал вводять у бічну частину ембріона, розмістивши яйце горизонтально. При цьому шкаралупу проколюють двічі: в ділянці повітряного мішка і на бічній поверхні ембріона, де в алантоїсі немає великих кровоносних судин. У місце бічного проколу вводять голку туберкулінового шприца на глибину 2 – 3 мм і провадять зараження.

Після закінчення роботи проколи в шкаралупі закривають розплавленим парафіном або лейкопластирем.

Зараження у порожнину амніона. У ній міститься тіло ембріона, і

вірусвмісний матеріал, уведений у цю порожнину, потрапляє в його дихальні шляхи. Амніотична рідина – це ізотонічний розчин солей, який у процесі розвитку ембріона збагачується білком. Об'єм її – близько 1 мл. Перший спосіб зараження ембріона у порожнину амніону — відкритий. Над повітряним мішком вертикально розміщеного яйця прорізують віконце розміром 1×1 см і обережно знімають частину хоріоналантоїсної оболонки над тілом ембріона. Потім очним

16

пінцетом, мінімально травмуючи тканини, захоплюють амніон і підтягують його вгору. Після цього амніон перехоплюють пінцетом з плоскими браншами лівого рукою, а правою за допомогою туберкулінового шприца уводять досліджуваний матеріал. Після зараження ембріона інструменти забирають (при цьому амніон перебуває у тому самому положенні), а отвір у шкаралупі закривають стерильною поліетиленовою плівкою або годинниковим склом за допомогою парафіну. Можна використати й медичний лейкопластир.

Другий спосіб зараження – закритий. Зараження провадять під контролем овоскопа в затемненому боксі. Матеріал уводять через прокол у шкаралупі в ділянці тупого кінця вертикально розміщеного яйця. При цьому голку спрямовують на «темне око» ембріона, відхиляючи її від центральної осі яйця, або, якщо є прокол над повітряним мішком, роблять прокол і на бічній поверхні горизонтально розміщеного яйця, і вводять голку в напрямі до тіла ембріона. Якщо матеріал уведено правильно, то тінь ембріона зміщується. Отвори закривають.

Зараження у хоріоналантоїсну оболонку. Перший спосіб зараження такий.

Над повітряним мішком вертикально розміщеного яйця вирізують шматочок шкаралупи, створюючи віконце, потім відшаровують оболонку під шкаралупою, оголюючи ділянку хоріоналантоїсної оболонки, на яку наносять досліджуваний матеріал. Отвір у шкаралупі заклеюють лейкопластирем або закривають поліетиленовою плівкою (можна скляною кришечкою), герметичне прикріплюючи) їх розплавленим парафіном. Описаний спосіб технічно простий, але у разі його застосування ушкоджується хоріоналантоїсна оболонка, тому краще проводити зараження іншим способом.

Другий спосіб полягає у створенні штучного повітряного мішка на бічній поверхні яйця, у тому місці, де хоріоналантоїсна оболонка вільна від великих кровоносних судин (його позначають олівцем). Для цього в позначеній ділянці шкаралупи випилюють щілину завдовжки 6 – 8 мм і завширшки 2 мм так, щоб оболонка під шкаралупою залишилася неушкодженою. На тупому кінці яйця над природним повітряним мішком роблять прокол.

На оголену оболонку під шкаралупою наносять краплю стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду (кімнатної температури) і через неї роблять в оболонці розрив за допомогою пера для взяття крові або спеціальною голкою із загнутим кінцем. Розривати оболонку під шкаралупою треба обережно, щоб не травмувати хоріоналантоїсну оболонку, яка щільно прилягає до неї. Під час розриву оболонки під шкаралупою крапля ізотонічного розчину потрапляє всередину, оскільки хоріоналантоїсна оболонка відшаровується і опускається, формуючи новий повітряний мішок, його розміри збільшують, відсмоктуючи повітря гумовою грушею крізь прокол на тупому кінці яйця. Утворення штучного повітряного мішка контролюють за допомогою овоскопа.

На хоріоналантоїсній оболонці повітряного мішка наносять досліджуваний матеріал, рівномірно розподіляють по ній, отвір заклеюють лейкопластирем. Прокол на тупому кінці яйця закривають парафіном. Яйця інкубують так, щоб штучний повітряний мішок опинився зверху.

Зараження у жовтковий мішок. Яйце вкладають на підставку

17

горизонтально так, щоб тіло ембріона було внизу, а жовток – над ним. Голкою для внутрішньо м’язових ін’єкцій у шкаралупі роблять прокол у ділянці повітряного мішка (глибина проникнення 2/3 довжини голки) по центральній осі яйця, шприцом уводять досліджуваний матеріал. Отвір закривають парафіном або лейкопластирем.

Після зараження ембріони інкубують у термостаті, розміщуючи їх тупим кінцем догори. Температура і тривалість інкубації залежать від біологічних властивостей вірусу, який ізолюють. Після закінчення інкубації ембріони охолоджують, досягаючи максимального звуження кровоносних судин: при температурі -10... -18 ºС – 2 год, +4 ºС – 16-18 год.

ІІ. Розтин курячих ембріонів

Відбір хоріоналантоісної оболонки. Стерильними ножицями підрізають оболонку на межі з повітряною камерою, убирають цю частину та переносять весь матеріал, що містить ембріон у чашку Петрі, а хоріоналантоісну оболонку забирають у стерильну чашку. Проводять мікроскопічне дослідження на темному фоні оболонки, виявляючи цитопатичну дію вірусів грипу А. Для виявлення виду та титру вірусних часток з хоріоналантоісної оболонки роблять гомогенну масу (оболонку перетирають у ступці з піском 1:3). Фізіологічний розчин додають по вазі до 20% суміші. Після центрифугування (3000 об/хв на протязі 20 хв) рідина, що утворилася над осадом використовують для подальших досліджень.

Відбір алантоісної рідини. Курячі ембріони перед розтином тримають у холодильнику на протязі 3 годин. При цьому кровоносні судини звужуються, тому кровотечі при розтині курячого ембріону не буде. Дезінфікують шкаралупа, стерильними ножицями зрізають її на відстані 3 мм вище межі повітряної камери. Яйце нахиляють та роблять прокол у хоріоналантоісну оболонку. Через прокол Пастеровською піпеткою відбирають алантоїсну рідину, яку зберігають при t0=4 0C або в замороженому стані.

Відбір амніотичної рідини. Розтинають амніон та відбирають алантоїсну рідину. Потім пінцетом захоплюють ембріон, Пастеровською піпеткою протикають амніотичну оболонку та, злегка нахиляючи ембріон, відбирають амніотичну рідину.

Хід роботи

1.Ознайомитися з будовою курячого ембріону за таблицями.

2.Підготувати кутячий ембріон до ураження (овоскопування,визначення місця розміщення повітряної камери, великих кровоносних судин, тіла ембріону, обробка шкарлупи йодом).

3.Підготувати шприци з вірусвмісним матеріалом для ін’єкцій.

4.Уразити курячий ембріон вірусом у порожнину алантоїса, у порожнину амніона, у хоріоналантоїсну оболонку, в жовтковий мішок.

5.Провести розтин уражених курячих ембріонів. Відмітити патологоанатомічні зміни у різних структурах ембріону.

6.Отримати вірусвмісний матеріал з органів інфікованих курячих ембріонів і

18

деембріонувати яйце.

ІІІ. Індикація та ідентифікація вірусу у матеріалі з ембріону

Завдання 1. Визначення титру вірусу за допомогою реакції гемаглютинації

Мета: визначення концентрації вірусу вакцини Ньюкасла в алантоїсній рідині.

Матеріали та обладнання: вірусвміщуючий матеріал (алантоїсна рідина), 2% суміш еритроцитів, фізіологічний розчин.

Теоретичні відомості

Реакція гемаглютинації широко використовується у вірусологічній практиці, як швидкий та надійний метод виявлення вірусів у дослідному матеріалі, а також для титрування вірусних гемаглютининів.

Принцип реакції гемаглютинації заключається в тому, що аглютинація відбувається за рахунок адсорбції вірусних часток на поверхневих рецепторах еритроцитів різноманітних тварин. Ця властивість зумовлена взаємодією поверхневих вірусних білків (у простих вірусів це білки капсиду, у складних – глікота ліпопротеїни суперкапсиду), які дістали назву гемаглютининів, з поверхневими білками еритроцитів (глікопротеїнами). В результаті такої адсорбції еритроцити склеюються один з одним, що призводить до утворення агрегату, який осідає на дно пробірки або лунки планшету.

Позитивну реакцію оцінюють плюсами від одного до трьох. Коли еритроцити розташуються рівномірним шаром по вогнутому дну пробірки з хвилястою крайовою зоною (вид перевернутої парасольки) – це повна аглютинація (+++). Аглютинація, яка дає рівномірне осадження еритроцитів інколи з рівним краєм та кільцевою зоною на дні пробірки приймають за реакцію на ++. Значне осадження еритроцитів цільним, компактним знаком з зернистим краєм приймають на +. Осадження еритроцитів цільним диском з рівними краями

– негативна реакція (-).Титром вірусу вважається те найбільше його розведення, при якому відбувається аглютинація еритроцитів не менше, чим на два плюси.

Хід роботи

1.Приготувати початкове розведення алантоїсної рідини 1:10. З цього розведення приготувати послідовні двократні розведення (табл. 1). Для цього в 10 пробірок налити фізіологічний розчин: у першу пробірку внести 0,9 мл, в інші – по 0,5 мл. Потім в першу пробірку додати 0,1 мл алантоїсної рідини (розведення 1:10), перемішати та перенести 0,5 мл у другу пробірку, 0,5 мл з другої пробірки перенести в третю і т.д. З останньої пробірки 0,5 мл вилити у посуд з дезінфікуючим розчином. Останнє розведення - 1:2560.

2.До всіх пробірок, крім першої, додати по 0,5 мл еритроцитів.

3.Пробірки струсити та залишити за кімнатної температури на 45 хв.

4.Провести облік результатів реакції гемаглютинації та визначити титр

19

вірусу у алантоїсній рідині.

	Схема проведення реакції гемаглютинації				Таблиця 1
№ про-	Алантоїсна	Фізіологічн	Розведення	2% суміш	Результати
бірки	рідина, мл	ий розчин,		еритроцитів	реакції
		мл
1	0,1	0,9	1:10	-
2	0,5	0,5	1:20	0,5
3	0,5	0,5	1:40	0,5
4	0,5	0,5	1:80	0,5
5	0,5	0,5	1:160	0,5
6	0,5	0,5	1:320	0,5
7	0,5	0,5	1:640	0,5
8	0,5	0,5	1:1280	0,5
9	0,5	0,5	1:2560	0,5
10	-	-	-	0,5

Примітка: 1 пробірка – контроль алантоїсної рідини, 10 пробірка – контроль еритроцитів.

Завдання 2. Реакція гальмування гемаглютинації

Мета: провести ідентифікацію вірусу.

Матеріали та обладнання: антисироватка проти вірусу вакцини Ньюкасла; вірусвміщуючий матеріал (алантоїсна рідина); еритроцити – 2% суміш; фізіологічний розчин; 34 пробірки; 34 піпетки на 1 мл; пластини з ; термостат.

Теоретичні відомості

Принцип реакції гальмування гемаглютинації полягає в тому, що блокований антитілами вірус не може аглютинувати еритроцити. Переваги реакції – специфічнисть, простота техніки, швидкість, вона не потребує стерильності. Недоліки – реакція можлива тільки з гемаглютинуючими вірусами. Реакція дуже широко використовується при діагностиці вірусних захворювань, для виявлення антитіл у сироватці хворих та вивчення антигенної структури вірусів. За титр антитіл приймається те найвище розведення сироватки, яке дає повну затримку гемаглютинації. Типова належність вірусу в алантоїсній рідині визначається за реакцією з імуноспецифічною сироваткою. Таким чином, застосовуючи відомі імунні сироватки, визначають невідомий компонент реакції – вірусний антиген.

Хід роботи

1. Приготувати робочу дозу антигену. Для цього алантоїсна рідина береться у розведенні в 4 рази більше, ніж титр вірусу. Наприклад, якщо в реакції гемаглютинації виявлено, що титр вірусу 1:160, то для реакції гальмування