metodichka_virusologija

30

використовується в фітовірусології.

5. Методи ідентифікації вірусів, їх суть.

ТЕМА 4. РОБОТА ІЗ ВІРУСАМИ БАКТЕРІЙ

Бактеріофаги – віруси бактерій. Їм притаманні виражені паразитичні властивості, що обумовлюють їх існування і розмноження тільки в культурах гомологічних мікроорганізмів. На цій основі наявність бактеріофага можна розглядати як непрямий показник інфікованості досліджуваного матеріалу відповідним мікробом.

Фаги можна розглядати і як корисні для людини віруси, і як шкідливі форми. Корисними фаги є для діагностики та лікування цілого ряду захворювань, у генетичній інжеенрії тощо. Шкідливими фаги є для мікробних виробництв, де знищують культури мікроорганізмів-продуцентів і зупиняють отримання цільового пордукту.

Лабораторна робота 7

Титрування фагів

І. Титрування фагів за методом Апельмана

Мета: оволодіти методикою титрування фагів за методом Апельмана. Матеріали та обладнання: колби (50, 250 мл), чашки Петрі, піпетки (1 мл),

пробірки, м’ясо-пептонний бульйон (МПБ), термостат, добові культури Bacillus megaterium, B. mycoides, B. subtilis, B. mesentericus, B. thuringiensis, B. brevis,

фаголізат.

Теоретичні відомості

Титр бактеріофага можна визначити за ступенем максимального розведення досліджуваного фаголізату, за якого ще спостерігається повний лізис чутливої до нього бактеріальної культури. Отриману величину виражають негативним десятковим логарифмом, де степінь вказує на розведення фага. Такий спосіб титрування проводять у рідкому середовищі за методом Апельмана.

Метод Апельмана заснований на внесенні різних кількостей титрованого бактеріофага в бульйон, засіяний однією і тією ж дозою культури гомологічних мікробів, з метою отримання феномена бактеріофагії.

Хід роботи

1.У дванадцять пробірок розлити по 4,5 мл МПБ.

2.Приготувати розведення бактеріофага від 10-1 до 10-10, користуючись кожного разу новою піпеткою. Для цього у першу пробірку стерильною піпеткою внести 0,5 мл досліджуваного концентрату фага. Вміст пробірки перемішати новою стерильною піпеткою і 0,5 мл рідини перенести у другу пробірку, з другої

–в третю і так далі до десятої включно. Із десятої пробірки зайві 0,5 мл вилити у

31

дезінфекційний розчин.

3.У всі 10 пробірок приготованого ряду розведень внести по 0,1 мл суспензії змиву добової агарової або бульйонної культури, яка містить 1·109 мікробних клітин у 1 мл (відповідність стандарту каламутності 10 од.). Використовують бактерії, гомологічні титрованому фагу. Додавана суспензія клітин не повинна містити стійких до фагу клітин.

4.Одинадцята пробірка – контроль культури. Вона містить 5 мл бульйону і 0,1 мл бактеріальної культури. Дванадцята пробірка – контроль на стерильність, містить 5 мл бульйону без додавання бактерій і фага. Усі пробірки струсити, штатив із ними помістити у термостат, інкубувати за температури 29ºС 18 – 20 год.

5.Одразу після інкубації провести облік результатів. Титром вважають те максимальне розведення бактеріофага, за якого спостерігається повний лізис чутливої до нього культури. Практично це відповідає останній пробірці в ряді, у якій бульйон ще залишатиметься абсолютно прозорим.

6.Визначити титр фага і внести його у висновки.

ІІ. Титрування фагів за методом Граціа

Мета: засвоїти методику титрування фагів за методом Граціа.

Матеріали та обладнання: колби (50, 250 мл), чашки Петрі, піпетки (1 мл), пробірки, м’ясо-пептонний агар (МПА) та МПБ з 0,4% глюкози і 0,02% CaCl2,

термостат, добові культури B. megaterium, B. mycoides, B. subtilis, B. mesentericus, B. thuringiensis, B. brevis, фаголізат.

Теоретичні відомості

Метод титрування вірусів бактерій на агаризованих середовищах запропонував бельгійський вчений Андре Граціа в 1936 р. для визначення кількості активних фагових часток у одиниці об’єму вихідного фаголізату. Такий метод дозволяє зробити точний підрахунок інфекційно-активних одиниць бактеріофага за утворенням негативних колоній на газоні чутливої культурихазяїна в результаті лізису бактеріальних клітин після розмноження вірусів всередині них. Метод полягає у використанні нижнього щільного шару агару (1,5%) для живлення бактерій, а верхнього м’якого шару агару (0,7%) – для розвитку інфекційної системи «фаг – бактерія». Полегшена дифузія фагових часток завдяки зниженій концентрації агару забезпечує циклічність інфекційного процесу, коли кожна генерація фагового потомства після лізису клітини-хазяїна здатна інфікувати сусідні клітини. У результаті цього від одного віріона утворюється одна прозора зона відсутності росту бактерій – стерильна бляшка. Для достовірності визначення титру фага проводять серію повторюваних дослідів (2 – 3) із ряду розведень вихідного фаголізату, а результати підрахунку кількості негативних колоній кожного експерименту усереднюють з урахуванням розведення і об’єму внесеного матеріалу.

32

Хід роботи

1.Напередодні постановки досліду приготувати живильні середовища. У чашки Петрі розлити 1,5%-й МПА в кількості 25 – 30 мл. Щоб запобігти контамінації мікрофлорою повітря, до розплавленого живильного агару перед розливанням додати 0,004%-й спиртовий розчин генціанового фіолетового з розрахунку 0,1 мл барвника на кожні 100 мл МПА. Чашки із середовищем накрити стерильним фільтрувальним папером і підсушити 30 хв у термостаті або 2 – 3 год за кімнатної температури, після чого закрити кришкою і залишити на ніч за кімнатної температури. Підготовлене середовище повинно бути абсолютно сухим, тому що навіть незначе зволоження може змінити кількісні показники вмісту фагових частинок у досліджуваній рідині.

2.Розплавити та витримати на водяній бані за температури +45ºС напіврідкий 0,7%-й МПА, розлитий у пробірки по 2,5 мл .

4.У день постановки досліду з рідини, що містить титрований фаг, приготувати у пробірках ряд послідовних розведень у МПБ з 0,4% глюкози і

0,02% CaCl2 (так само, як під час титрування фага на рідких середовищах за методом Апельмана). Для розведень фага також можна користуватися стерильним ізотонічним розчином натрію хлориду (0,5%-й NaCl).

5.У пробірки з 0,7%-м МПА, розплавленим у водяній бані і охолодженим до температури 44 – 46°С, долити по 0,1 мл розведень титрованого фага.

6.У кожну пробірку внести по 0,1 мл гомологічної до фага культури. До кожної пробірки з адсорбційною сумішшю додати по 5 мл м’якого розплавленого

іохолодженого до 45ºС агару, ретельно перемішати вміст пробірки, перекочуючи

їїміж долонями, і вилити на чашки Петрі із шаром агару, рівномірно розподіляючи суміш по його поверхні. Слід засівати не менше двох чашок фагом одного й того ж розведення. Після охолодження середовища чашки з посівом інкубувати за 29°С протягом 18 – 20 год.

7.Визначити титр фага шляхом підрахунку кількості негативних колоній на паралельних чашках і множення середнього значення на показник розведення.

Наприклад, якщо на чашці утворилось 150 БУО за умов внесення 0,1мл фагової суспензії із розведення 10-7, то титр фаголізату буде дорівнювати 150·10·107 = 1,5·1010 фагових часток у 1 мл. Занести титр фагу у висновки.

Контрольні питання

1.Принципи титрування фагів.

2.Титрування фагів у рідкому живильному середовищі: метод Апельмана.

3.Титрування фагів на твердому живильному середовищі: метод Граціа.

4.Принципи стерильної роботи в ході досліджень.

Лабораторна робота 8

Фаготипування бактерій

Мета: навчитися типувати мікроорганізми за допомогою фагових тестнаборів.

33

Матеріали та обладнання: чашки Петрі, піпетки (1 мл), пробірки, МПА, термостат, дослідна культура, діагностичний фаговий набір.

Теоретичні відомості

Фаготипування дозволяє здійснювати внутрішньовидову диференціацію бактерій. Оскільки фаготипна характеристика бактеріальних штамів достатньо стабільна, фаготипування має виняткову значущість для проведення епідеміологічного аналізу. За допомогою фагового маркування можна встановити зв’язки між окремими випадками захворювання і джерелами інфекції, а також шляхами її поширення.

Нині розроблено різні схеми фагодіагностики і фаготипування для багатьох видів бактерій – збудників інфекційних захворювань людини. Найбільш поширене є фаготипування стафілококів. Для типування коагулазопозитивних стафілококів, виділених від людини, застосовують міжнародний набір – Англія, а виділених від великої рогатої худоби – набір Давідсона. Ці набори містять по 23 і 7 типів бактеріофагів відповідно. Типування здійснюють всіма фагами набору одночасно. Типують лише коагулазопозитивні стафілококи, для коагулазонегативних характерна нестабільність даної ознаки. Більшість коагулазонегативних стафілококів не взаємодіють із фагами діагностичних наборів для фаготипування.

Фаготипування також проводять для багатьох інших бактерій. У клінічних дослідженнях його застосовують для вивчення ентеробактерій, у першу чергу сальмонел, шигел, кишкових паличок.

Хід роботи

1.Ліофілізований вміст кожної ампули з типовим фагом розчинити у 1 мл

МПБ з 0,4% глюкози і 0,02% хлористого кальцію, отримуючи основне розведення 10-1. Далі приготувати розведення, відповідні одиниці тест-розведення (ТР) і 100 ТР.

2.Добову агарову культуру випробуваного штаму засіяти у пробірку з МПБ. Вирощувати за оптимальної для росту культури температури до появи помітної каламуті (3 – 6 год). У чашки Петрі розлити 1,2%-й МПА з 0,4% глюкози і 0,02% хлористого кальцію (останній додають безпосередньо до готового розплавленого середовища перед розливом по чашках). Чашки із застиглим агаром підсушити 40

–60 хв за 37°С.

3.За допомогою пастерівської піпетки нанести бульйонну культуру на поверхню агару. Надлишок культури видалити і підсушити 30 – 40 хв за температури 37°С. Дно засіяної чашки розкреслити відповідно до кількості використовуваних фагів.

4.У кожен маркований номером фага квадрат засіяного середовища внести краплю відповідного фага тонко відтягнутою пастерівською піпеткою. Після підсихання крапель фагів чашку перевернути та помістити для інкубації у термостат за 30°С на 18 – 20 год або за 37°С на 5 – 6 год.

34

5.Облік і реєстрацію результатів провести за ступенем лізису культури, застосовуючи систему «плюсів»: ++++ – зливний (повний) лізис; +++ – напівзливний (незначне зростання культури в зоні лізису); ++ – наявність у місці нанесення краплі фага понад 50 колоній плям лізису; + – від 20 до 50 колоній фага; ± – менше 20 колоній фага; - – повна відсутність лізису. Перші три ступені лізису (++++, +++, ++) називають сильною реакцією. Останні ступені лізису (+, ±) – слабка реакція. Штам вважають типованим, якщо хоча б один фаг дав сильну реакцію. Якщо під час типування 1 ТР отримані лише слабкі реакції або лізис відсутній, то цей штам досліджують повторно з тими ж фагами в розведенні 100 ТР.

6.Одержані результати описати у робочих зошитах, у висновках указати фаготип досліджуваного штаму. Зарисувати чашку з фагограмою.

Лабораторна робота 9

Визначення колі-фагів у воді

Мета: визначити титр колі-фагів у зразках води.

Матеріали та обладнання: чашки Петрі, піпетки (1 мл), пробірки, МПА, термостат, фільтри, проби води, препарат колі-фага, контрольна культура

Escherichia coli.

Теоретичні відомості

У санітарній мікробіології та вірусології виявлення колі-фагів у воді – це один з показників, що характеризують якість очищення питної води та охорони ґрунтових вод. У разі виявлення у воді колі-фагів роблять висновок про її забруднення. Крім того, у випадку наявності цих фагів воду обов’язково треба дослідити на патогенні для людини і тварин віруси кишкової групи.

Хід роботи

1.Культуру бактерій засіяти у пробірку з 5 мл МПБ та інкубувати протягом 5

–6 год за 37ºС. Концентрація бактеріальних клітин повинна бути не менша 108 клітин/мл.

2.Попередньо в 4 стерильні чашки Петрі розлити по 15 – 20 мл 2%-го МПА та добу висушувати у термостаті. Також приготувати 4 стерильні пробірки з 5 мл 1%-го МПА. У пробірки з МПА додати по 5 мл проби води та по 1 мл суспензії клітин тест-культури. Обережно перемішати вміст пробірок, запобігаючи утворенню бульбашок повітря, і вилити на поверхню 2%-го МПА. Вилитий матеріал рівномірно розподілити і залишити до застигання на горизонтальній прохолодній поверхні. Підсушити чашки, витримуючи їх з частково відкритими кришками, після чого їх закрити та інкубувати у положенні догори дном за 37ºС протягом 6 – 8 год. Далі чашки вийняти із термостата й залишити у темному місці за кімнатної температури на 18 – 20 год. Цей прийом запобігає негативному впливу на облік результатів іншої, наявної в матеріалі мікрофлори.

3.Постановка негативного контролю потрібна для підтвердження відсутності

35

контамінації фагом живильних середовищ, лабораторного посуду, устаткування на етапах підготовки та проведення аналізу, а також дозволяє підтвердити здатність тест-культури утворювати рівномірний повноцінний газон. Негативним контролем є стерильна водопровідна вода, яку вивчають у такий же спосіб, як і досліджувані проби води. У випадку виявлення зон лізису на чашках з негативним контролем результати дослідження даної серії проб вважають недійсними. У такому разі необхідно перевірити стерильність живильних середовищ, лабораторного посуду, устаткування та робочу культуру. Негативний контроль єдиний для всіх досліджуваних проб і його здійснюють 1 раз на день.

4.Постановка позитивного контролю передбачає перевірку чутливості тесткультури до фагів. Чутливість перевіряють кожного разу, коли беруть нову пробірку з робочою тест-культурою. Культуру вважають чутливою та придатною для проведення аналізу за наявності чітких зон лізису на повноцінному бактеріальному газоні. За відсутності зон лізису культура не може бути застосована в аналізі та підлягає заміні.

5.Облік результатів. За наявності зон лізису підрахувати їх кількість на чотирьох чашках і помножити на 10, що у підсумку дає вміст коліфагів у 1 л води досліджуваного зразка. Розрахувати титр колі-фага і внести його у висновки. У нормі титр колі-фага не повинен перевищувати 10 одиниць.

Контрольні питання

1.Реакція наростання титру фага.

2.Фаготипування бактерій та його застосування у клінічній практиці.

3.Метод титрування колі-фагів.

ТЕМА 5. ЗАСТОСУВАННЯ СЕРОЛОГІЧНИХ РЕАКЦІЙ У ВІРУСОЛОГІЧНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ

Від самого початку досліджень вірусних хвороб постала актуальна проблема їх розпізнавання й діагностики. Візуальне спостереження зовнішніх симптомів широко застосовувалось, так як прояв симптомів залежить головним чином від взаємодії вірусу і організму. Але на характер прояву симптомів впливають різноманітні фактори, що ускладнюють діагностику.Саме тому було розроблено методи виявлення та використання антитіл (імуноглобулінів) для розпізновання антигенів, тобто серологічні реакції. Ці методи досліджень, засновані на виявленні антигенної специфічності вірусів, не залежать від взаємовідносин вірусу та організму. Завдяки специфічності антитіла реагують тільки з тими антигенами вірусного білку, у відповідь на введення якого вони утворились, або з вірусами, що подібні за антигенною структурою.

Лабораторна робота 10 Реакція кільцепреципітації

Мета: ознайомлення з реакцією кільцепреципітації.

36

Матеріали та обладнання: матеріал, який містить віруси, специфічна імунна сироватка, лабораторний посуд, штативи, баночки з ватою, фізіологічний розчин, холодильник, термостат, дезінфікуючий розчин.

Теоретичні відомості

Термін «преципітація», як правило, використовуються для визначення реакції взаємодії між розчиненими антигенами і специфічними антитілами. Результат цієї взаємодії – преципітат помітний неозброєнним оком. Цю реакцію відкрив Р.Крауз в 1897 р. при вивченні бактеріальних захворювань. З того часу вона широко використовується при діагностиці бактеріальних і вірусних захворювань.

При постановці реакції кільцепреципітації в ряд маленьких вузьких пробірок вносять за допомогою пастеровскої піпетки з довгим і тонко відтягнутим капіляром сироватку так, щоб не змочити нею внутрішню поверхню стінок пробірки.

На поверхню сироватки наносять різні розведення антигену в кількості рівному обсягу сироватки, що міститься в пробірці. При постановці реакції кільціпреципітації антиген звичайно нашаровують на сироватку, що по своїй відносній щільності важче за антиген. Щоб не відбулося змішування рідин, пробірку в момент нашаровування антигену тримають у похилому положенні, а антиген окремими краплями наливають по внутрішній поверхні стінки, для цієї мети користуються пастеровською піпеткою з довгим, дуже тонким капіляром. В результаті реакції на межі двох фаз утворюється кільце преципітації, звичайно, при умові специфічності антигену та антитіла. Реакція кільцепреципітації супроводжується постановкою 3 обов'язкових контролі:

1)нормальна сироватка від тварини токого ж виду, якого імунизували для одержання преципітуючої сироватки + досліджуваний антиген.

2)специфічна преципітуюча сироватка + ізотонічний розчин хлориду натрію.

3)специфічна преципітуюча сироватка + відповідний їй антиген.

Після додавання антигену пробірки поміщають у штатив і залишають при кімнатній температурі.При позитивній реакції преципітації, відмічуваної "+", протягом 5-30 хв на границі зіткнення двох рідин з'являється добре видиме на темному фоні кільце молочно-білого кольору, чітко обмежене зверху і знизу. При стоянні пробірок товщина кільця збільшується, а чіткість лінії зникає. Останнє розведення антигену, при якому ще утворюється кільце преципитації, вважають титром сироватки, і навпаки, останнє розведення сироватки – титром антигену.

У контрольних пробірках, за винятком 3-й (специфічна преципитирующая сироватка + відповідний їй антиген), кільця помутніння не з'являється.

Хід роботи

1.Розлити у 7 пробірок по 1 мл фізіологічного розчину.

2.Зробити серійні розведення вірусвмісного матеріалу з коефіцієнтом 2 у об‘ємі 1 мл (внести у першу пробірку 1 мл вірусу, із першої перенести у другу 1 мл і т.д.). Із останньої пробірки 1 мл матеріалу відібрати у дезинфікуючий розчин.

37

3.Розлити у преципітаційні пробірки специфічну приципітуючу сироватку (розведення 1:5) по 0,4 мл.

4.Обережно, тримаючи пробірки під кутом 45°, нашарувати на сироватку по 0,4 мл.різних розведень антигену.

5.Поставити 3 контролі. Для цього у 2 пробірки налити по 0,4 мл специфічної сироватки, в першій нашарувати відповідний сироватці антиген, а в другій - фізіологічний розчин. В третю пробірку налити нормальну сироватку і нашарувати досліджуваний вірусвмісний матеріал.

6.Врахувати результати реакції за наявністю кілець преципітації та зробити висновок щодо гомологічності досліджуваного антигену до данної сироватки та визначити титр сироватки.

Контрольні питання

1.В чому принцип реакції кільцепреципітації?

2.Які задачі дозволяє вирішити ця реакція?

3.Які контролі супроводжують реакцію?

СПИСОК РЕКОМЕНДОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология [Текст] / Л.Б. Борисов. – М.: Мед. информ. агенство, 2001. – 736 с.

Букринская, А.Г. Вирусология [Текст] / А.Г. Букринская. – М.: Медицина, 1986. – 336 с.

Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях [Текст] / под ред. М.И. Соколова [и др.]. – Л.: Спец. лит., 1972. – 198 с.

Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология [Текст] / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. – СПб.: Спец. лит., 1998. – 580 с.

Пилянкевич, А.Н. Электронные микроскопы [Текст] / А.Н. Пилянкевич. – К.:

Наук. думка, 1976. – 205 с.

Поліщук, В.П. Посібник з практичних занять з курсу «Загальна вірусологія» [Текст] / В.П. Поліщук, І.Г. Будзанівська, Т.П. Шевченко. – К.: Фітоцентр, 2005. – 204 с.

Посібник з медичної вірусології [Текст] / за ред. В.М. Гиріна. – К.: Вища шк., 1995. – 367 с.

Современная микробиология: прокариоты [Текст]: в 2 т. / под ред.

И. Ленгелера [и др.]. – М.: Мир, 2005. – Т. 2. – 496 с.

Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования [Текст] / под ред. А. Г. Букринской. – М.: Наука, 1982. – 455 с.

Bacteriophages: biology and applications [Text] / edited by E. Kutter, A. Sulakvelidze. – Boca Raton: CRC PRESS, 2005. – 528 р.

Cann, A.J. Principles of molecular virology [Text] / A.J. Cann. – Burlington: Elsevier Academic Press, 2005. – 316 с.

Carter, J. Virology: principles and applications [Text] / J. Carter, V. Saunders. – Chichester: John Wiley & Sons Ltd, 2007. – 382 р.

		38
		ЗМІСТ
Вступ……………………………………………………………………………			3
Тема 1. Вірусологічна лабораторія: устрій та правила техніки безпеки…...			4
Лабораторна робота	1.	Структура вірусологічної лабораторії та
особливості режиму роботи...............................................................................			4
Лабораторна робота	2.	Методи обробки та стерилізації лабораторного
посуду, гумових виробів, металевих інструментів для вірусологічних
досліджень...........................................................................................................			6
Тема 2. Робота з вірусами людини і тварин.....................................................			8
Лабораторна робота	3.	Використання лабораторних тварин для
дослідження вірусів людини і тварин...............................................................			8
Лабораторна робота	4.	Використання курячих ембріонів для
культивування вірусів людини і тварин...........................................................			13
Лабораторна робота	5.	Культивування клітин організмів в штучних
умовах..................................................................................................................			21
Тема 3. Робота з фітопатогенними вірусами....................................................			26
Лабораторна робота	6.	Виділення, культивування та індикація
фітопатогенних вірусів.......................................................................................			25
Тема 4. Робота із вірусами бактерій..................................................................			30
Лабораторна робота	7.	Титрування фагів....................................................	30
Лабораторна робота	8.	Фаготипування бактерій........................................	32
Лабораторна робота	9.	Визначення колі-фагів у воді................................	34
Тема 5. Застосуванн серологічних реакцій у вірусологічних
дослідженнях………………………………………………………......…........			35
Лабораторна робота 10. Реакція кільцепреципітації....... .............................			35
Список рекомендованої літератури…………………………………………..			37