metodichka_virusologija

20

гемаглютинації береться розведення 1:40.

2. Приготувати вихідне розведення сироватки 1:10. З цієї концентрації приготувати двукратні розведення до 1: 1280 (табл.2). Для цього у ряд пробірок внести по 0,25 мл фізіологічного розчину. У першу додати розведену сироватку 0,25 мл, перемішати та із неї відібрати 0,25 мл у другу пробірку і т.д. Із останньої пробірки 0,25 мл розведеної сироватки видалити, для того щоб у всіх пробірках був однаковий об’єм.

№

пробірок

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Таблиця 2

Схема проведення реакції гальмування гемаглютинації

Компоненти

Сироватка,	Алантоісна				результати
0,25 мл	рідина	хвилин		хвилин
1:10			2% суміш
1:20
1:40	по 0,25 мл	45	еритроцитів	20
1:80	у всі
			по 0,5 мл
		Інкубація		Інкубація
1:160	пробірки
			у всі
1:320
			пробірки
1:640
1:1280
контроль	антигенів
контроль еритроцитів

3.До всіх пробірок з розведеними сироватками додати по 0,25 мл робочої дози антигену. Суміш перемішати та залишити на 45 хвилин при кімнатній температурі.

4.До усіх пробірок додати по 0,5 мл 2% суміши еритроцитів. Пробірки залишити на 30 хвилин при кімнатній температурі.

5.Поставити 2 контролі:

-контроль антигену (0,25 мл фізіологічного розчину + 0,25 мл робочого розведення алантоїсної рідини + 0,5 мл суміші еритроцитів);

-контроль еритроцитів (0,5 мл фізіологічного розчину + 0,5 мл еритроцитів).

6.Провести облік результатів реакції гальмування гемаглютинації. Ідентифікувати вірус в алантоісній рідині та вказати титр антитіл у сироватці.

Контрольні питання

1.Назвіть мету використання курячих ембріонів в вірусологічних дослідженнях, їх переваги та недоліки, як об‘єкта для культивування вірусів.

2.Опишіть особливості анатомії та фізіології курячого ембріону.

3.Як зробити відбір та підготувати курячі ембріони до інфікування?

4.Які умови впливають на репродукцію вірусів в курячих ембріонах?

5.Назвіть методи інфікування курячих ембріонів.

6.Типи патологічних змін в органах та тканинах курячих ембріонів.

8. Як виявляють титр вірусу у реакції гемаглютинації?

21

9. Механізм постанови та діагностичне застосування реакції гальмування гемаглютинації.

Лабораторна робота 5

Культивування клітин організмів в штучних умовах

Мета: ознайомлення з методами отримання, культивування, морфології та класифікації культур клітин.

Матеріали та обладнання: жива культура клітин, колекція демонстраційних матеріалів – фіксовані забарвлені препарати культур клітин, лабораторний посуд, інструменти (ножиці, пінцети), дезінфікуючий розчин, центрифуга, термостат, мікроскопи, розчин трипсину або вересу, фізіологічний розчин, поживне середовище, сироватка крові крупної рогатої худоби, колекція демонстративних поживних середовищ (сироватка крові, сольові розчини Хенкса, Ерла, Тіроде, штучні поживні середовища 199 та інші), колекція ілюстративного матеріалу.

Теоретичні відомості І. Типи клітинних культур

Первинні культури клітин. Первинні культури клітин одержують із тканин людини або тварини шляхом їх ферментативної дезінтеграції з використанням холодного або теплого трипсину.

Метод з використанням теплого трипсину полягає в тому, що шматочки тканини або цілі органи ембріона вміщують у 0,25 % розчин трипсину при температурі 37 °С. Під час піпетування у теплому трипсині або перемішування шматочків тканин у трипсині на магнітній мішалці відбувається їх дезагрегація на окремі клітини. Порції клітин збирають у міру їх виділення, центрифугують, трипсин зливають, вносять середовище росту і суспендують у ньому клітини. Принцип методу використання холодного трипсину полягає в тому, що шматочки тканин заливають 0,25 % розчином трипсину і залишають на ніч при температурі 4 °С. Потім розчин трипсину із шматочками тканин підігрівають до 37 °С, витримують кілька хвилин і швидко піпетують; суспензію центрифугують, трипсин зливають, клітини повільно піпетують у середовищі росту і визначають їх кількість у лічильній камері Горяєва.

Перещеплювальні культури клітин. Перещеплювальні клітини – це клітини одного типу, що набули здатність до необмеженого росту. Перещеплювальні клітини, як правило, походять з пухлин або нормальних тканин людини або тварин, які мають змінений каріотип.

Перещеплювані культури клітин вирощують у вигляді суспензій (із стаціонарною або проточною системою подавання живильного середовища) або одношарових культур на поверхні скла в посудинах, матрацах, пробірках, панелях. В останньому випадку необхідне систематичне проведення пасажів (посіви) клітин, використовуючи для цього культури попереднього пасажу або музейні клітини, що зберігаються в умовах консервації. Повноцінну популяцію клітин можна одержати лише за умови використання життєздатних клітин.

Відібрану для пересівання культуру клітин відокремлюють від скла за

22

допомогою трипсину (0,25 %), версену (0,2 %), хімопсину (0,02 %) або механічно, зішкрібаючи та подрібнюючи одержані клітини за допомогою багаторазового піпетування. У разі використання версену відокремлення клітин від скла і формування суспензії відбувається при кімнатній температурі за 5 – 10 хв (порізному для різних культур). Якщо розпушення шару клітин достатнє і почалося відокремлення його від скла, розчин версену зливають, а в матраци заливають мірну кількість середовища росту. Ним старанно змивають клітини із скла посудини. Одержану суспензію клітин після підрахунку в лічильній камері Горяєва розводять середовищем росту до концентрації, необхідної для посіву. Наприклад, у флакони місткістю 100 мл розливають по 20 мл зависі, що містить 40–60 тис. клітин в 1 мл, Формування моношару клітин відбувається за 48 год.

Культури диплоїдних клітин. Диплоїдні клітини – це клітини одного типу, здатні витримувати in vitro близько 100 поділів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом. Диплоїдні штами фібробластів, одержані з ембріона людини, використовують у діагностиці вірусних інфекцій та у виробництві вакцин. Ці культури надзвичайно вибагливі до умов культивування, тому їх рідко застосовують у практиці вірусологічних лабораторій.

Перед початком роботи культуру мікроскопують (рис. 2).

Додатково культури поділяють на патологічні, умовно-нормальні та іморталізовані.

Патологічні культури – це культури, які отримані на основі пухлинних клітин з різною тканинною належністю.

Умовно-нормальні культури – це культури, що отримують на основі методу первинної трипсинізації нормальних тканин.

Іморталізовані культури – це культури, отримані на основі злиття клітин з нормальних тканин та пухлинних клітин.

Відповідно до потреб експериментальної роботи обирають відповідну клітинну лінію, культуру якої можна отримати у Національному банку клітинних ліній Інституту експериментальної патології. онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького (м. Київ).

Рис. 2 Клітинні культури під мікроскопом (інвертна мікроскопія. збільшення

×900)

23

Слід пам’ятати, що робота із культурами клітин вимагає особливих умов стерильності та складного і коштовного обладнання. При недотриманні умов культивування культури швидко гинуть.

ІІ. Методи виявлення та ідентифікації вірусів в культурі клітин

Зараження культур клітин. Найчастіше для зараження використовують моношарові культури. Для цього культури клітин перед зараженням розглядають під мікроскопом, а потім відбирають пробірки з добре сформованим моношаром. Для дослідження однієї клінічної проби використовують 4—8 пробірок, таку саму кількість пробірок залишають для контролю клітин. Перед внесенням вірусвмісного матеріалу живильне середовище росту зливають, моношар промивають розчином Хенкса, пробірки маркують. У кожну пробірку вносять по 0,2 мл досліджуваного матеріалу і витримують у термостаті при температурі 37 °С протягом 1 год (для деяких вірусів – 2 год) для адсорбції вірусу на клітинах. Після 1–2-годинного контакту матеріал зливають, моношар промивають розчином Хенкса для видалення токсичних компонентів, заливають підтримувальним середовищем і витримують у термостаті при температурі 37 °С 7–14 днів до визначення результатів. Як підтримувальні можна використовувати середовище 199 з 2 % сироватки крові великої рогатої худоби (для ротавірусів – середовище 199 на розчині Ерла без сироватки), середовище Ігла з 2 % сироватки, розчин Ерла з 0,5 % гідролізатом лактальбуміну і 1–2 % сироватки крові.

У заражених культурах клітин рН (6,9–7,4) підтримують за допомогою 7,5 % стерильного розчину натрію гідрокарбонату. Якщо культивування заражених культур тривале, то можна підтримувальне середовище замінити на свіже.

Цитопатична дія вірусів у культурах клітин. Різні віруси спричиняють неоднакові зміни у клітинах. Морфологічні зміни, що виникають під час взаємодії вірусу і клітини, називають цитопатичною дією (ЦПД), а віруси, які стають причиною цих змін, – цитопатогенними. Період розвитку і характер цитопатичних змін, спричинених цитопатогенними вірусами в інфікованих культурах клітин, визначаються: 1) властивостями вірусу, 2) дозою вірусу; 3) властивостями клітин та умовами їх культивування.

Характерні для кожного вірусу цитопатичні зміни розвиваються в культурах клітин, заражених середніми дозами вірусу – 1000–10000 ЦПД50, (ЦПД50 – цитопатична доза вірусу, яка спричинює дегенерацію в 50 % пробірок із зараженою культурою клітин)с за умови яких процес загибелі клітин розтягується у часі. Якщо дози вірусу великі або малі, морфологічні зміни у клітинах бувають нетиповими: значні дози вірусів спричинюють розвиток некрозу з повним відшаруванням зруйнованих клітин від скла, а незначні – повільну осередкову дегенерацію клітин.

Для характеристики деструктивних змін одношарових культур клітин, що заражені різними вірусами, найчастіше використовується робоча класифікація ЦПД:

1 група. Рівномірно розподілена дрібнозерниста деструкція клітин – виникає при ураженні клітин вірусами полімієліту, Коксакі, ЕСНО, ЕСМО, віспи та ін.

24

2 група. Вогнищева дрібнозерниста деструкція клітин з тяжами незмінних клітин між ними – виникає при ураженні клітин вірусами весняно-літнього енцефаліту, вірусом хвороби Ауескі, грипу та ін.

3 група. Осередкові скупчення заокруглених клітин, що нагадують грона винограду – виникає при ураженні клітин аденовірусом.

4 група. Рівномірно розподілена крупнозерниста деструкція клітин (клітини збільшені у розмірі, заокруглені) – виникає при ураженні клітин вірусом простого герпесу, мавп’ячим вірусом В та ін.

5 група. Утворення гігантських багатоядерних клітин – симпластів та синцитіїв – виникає при ураженні клітин вірусами кору, вісповакцини, герпесу та ін. При цьому типі ЦПД відбувається розчинення клітинних оболонок, внаслідок чого цитоплазма сусідніх клітин зливається, утворюючи єдине ціле, в якому (в основному по перефірії) розташовані ядра клітин. Слід розрізняти термін синцитій та симпласт. Синцитії - це група клітин, які з’єднані між собою протоплазматичними відростками, вони виникають у результаті часткового злиття цитоплазматичної мембрани клітин. Симпласти мають загальну масу протоплазми, в якій містяться багато ядер, вони виникають внаслідок повного злиття мембрани.

Ступінь дегенерації клітин оцінюють знаком плюс: (++++) – деструкція всіх клітин (100%); (+++) – більшості клітин (75%); (++) – половини клітин (50%); Враховуючи ЦПД вірусів, слід пам'ятати про неспецифічну «вікову» дегенерацію клітин, яка спостерігається у старіючих культурах, а також про дегенерацію, зумовлену токсичною дією інокульованого матеріалу. Для виключення токсичної дегенерації клітин проводять додатковий пасаж: по 0,2 мл культуральної рідини з пробірок з дегенерованими клітинами вносять у пробірки із свіжими культурами клітин. Якщо дегенерація була зумовлена токсичним фактором випробовуваного матеріалу, то ЦПД у культурі клітин не розвивається.

Внутрішньоклітинні включення. Надзвичайно характерним для ЦПД багатьох вірусів є формування внутрішньоядерних і цитоплазматичних включень. Динаміка їх формування, їхні форма, розмір, субклітинна організація, наявність у них вірусспецифічних нуклеїнових кислот і білків мають важливе діагностичне значення, оскільки відрізняються у вірусів різних таксономічних груп.

Включення можна виявити в забарвлених або оброблених флюорохромами препаратах. Для цього культури клітин вирощують на скляних пластинках («літаюче скло») або пластинках з прозорої слюди, у пробірках або матрацах. Потім культури заражають вірусом, і через певні строки інкубації, залежно від властивостей інокульованого вірусу, готують препарати, забарвлюючи їх барвниками або флюорохромами.

Для вивчення включень можна приготувати відбитки органів і тканин, зскрібки клітин, гістологічні зрізи з ураженої тканини. У наш час у зв'язку з трудомісткістю й тривалістю приготування препаратів метод гістологічних зрізів використовують для виявлення внутрішньоклітинних включень дуже рідко, здебільшого для діагностики сказу.

Забарвлення препаратів. Універсальним є забарвлення за РомановськимГімзою у різних варіантах, під час якого виявляються всі види вірусних включень.

25

Забарвлені за цим методом препарати фіксують у суміші Дюбоска-Бразіля-Буена (пікринова кислота – 1 г, 4 % формалін – 60 мл, 80% етиловий спирт – 150 мл, крижана оцтова кислота – 15 мл). Препарати опускають у нерозведений розчин барвника Романовського – Гімзи на 10 хв, промивають дистильованою водою та висушують на повітрі. Після забарвлення за цим методом вірусні включення стають рожевими або рожєво-бузковими.

Забарвлення за Павловським. Препарати забарвлюють протягом 3–5 с барвником, виготовленим з 10 мл дистильованої води, 1 краплі насиченого спиртового розчину основного фуксину, 8 крапель водного або насиченого спиртового розчину метиленового синього. Барвник змивають проточною водою, і препарати висушують на повітрі.

Забарвлення за Селлером. Вологий мазок або відбиток без фіксування 10 с забарвлюють сумішшю з насичених розчинів у метиловому спирті основного фуксину (32 мл) і метиленового синього (15 мл), а також чистого метилового спирту (25 мл). Промивають проточною водою, сушать на повітрі, мікроскопують. Вірусні включення (тільця Бабеша—Негрі) забарвлюються у червоний колір, цитоплазма, ядра, ядерця – у синій, еритроцити – у червонокоричневий.

Забарвлення гематоксилін-еозином (оглядове гістологічне): препарати фіксують на 5—10 хв у 70% та 96% етиловому спирті, промивають дистильованою водою, забарвлюють гематоксиліном Мейєра 3–5 хв, знову промивають дистильованою водою та 1–2 с витримують у 1 % водному розчині еозину. Потім препарати промивають дистильованою водою, роблять спиртову провідку (70 %, 96 % і абсолютні спирти, в кожному по 1–2 с) і освітлюють у ксилолі протягом 10—15 хв.

Забарвлення флюорохромами. Препарати фіксують у холодному ацетоні на 10–15 хв або у 70 % етиловому спирті–5 хв. потім у 96% етиловому спирті – 3–5 хв. Після цього їх вміщують у водний розчин акридинового оранжевого (1 : 10000) на 1–3 хв, промивають дистильованою водою, сушать і досліджують під люмінесцентним мікроскопом, ДНК-вмісні структури дають зелене світіння, а РНК-вмісні – червоно-оранжеве.

Хід роботи

1.Продивитися під світловим мікроскопом неінфіковані вірусом культури клітин, які відносяться до первинних, перещеплювальних, диплоїдних. Визначити їх морфологію, тип клітин, вказати ступінь щільності популяції клітинного моношару.

2.Дослідити фіксовані забарвлені препарати інфікованих вірусами культур клітин для виявлення ознак цитопатичної дії, описати їх.

3.Знайти внутрішньоклітинні включення при інфекціях, що викликані різними вірусами.

4.Замалювати препарати здорових та інфікованих вірусом культур клітин.

5.Порівняти морфологію неінфікованих та інфікованих вірусами культур

клітин.

26

Контрольні питання

1.Поняття «культура клітин» та її використання у вірусології.

2.Умови культивування клітин поза організмом. Вимоги до поживних середовищ.

3.Які культури клітин і чому називають первинними та одношаровими.

4.Методу трипсинізації і техніка його проведення.

5.Які основні типи культур клітин тварин ви знаєте.

6.Назвіть методи зараження культур клітин вірусами.

7.Назвіть типи взаємодії вірусу з клітиною. Цитопатична дія вірусів та її прояви.

ТЕМА 3. РОБОТА З ФІТОПАТОГЕННИМИ ВІРУСАМИ

Фітопатогенні віруси – це віруси, що уражують рослини. Для організму людини і тварин ця група вірусів безпечна, однак, вони завдають великих збитків сільському господарству у разі виникнення епіфітотій – масових уражень рослинних культур. Додатковою негативною ознакою цих вірусів є те, що разово заражена рослина назавжди лишиться інфікованою і стане джерелом поширення вірусу. У разі появи ознак зараження рослина підлягає обов’язковому знищенню для запобігання поширення вірусу.

Лабораторна робота 6

Виділення, культивування та індикація фітопатогенних вірусів

Мета: ознайомлення з основними правилами роботи з вірусами рослин: виділення з навколишнього середовища, пасажі на рослинах-індикаторах, отримання чистих ліній вірусу, способи інокуляції рослин вірусами, культивування їх на рослинах-господарях та рослинній культурі тканин

Матеріали та обладнання: віруси – ВТМ (вірус тютюнової мозаїки), ХВК (Х-вірус картоплі), ВМК (вірус мозаїки костра); рослини індикатори – тютюн, лебеда, квасоля, петунія та ніші; рослини-господарі – гвоздика, лебеда, тютюн та інші; абразивні речовини – карборунд і корунд, цемент, пензлики, піпетки, планшетки, штативи, пробірки, шпателі, фізіологічний розчин, ножиці, ступки з маточками, марля, холодильник, термостат, центрифуга, ураджені рослини з симптомами вірусної інфекції, ілюстративний матеріал (таблиці, рисунки).

Теоретичні відомості І. Виділення та культивування вірусів рослин

Для культивування вірусів, в залежності від їх властивостей і від поставлених задач, використовують 4 типи рослин-господарів:

1)рослини, в яких вірус може зберігатися довгий час; 2) рослини, на яких легко виявляються симптоми, характерні для зараження

даним вірусом;

27

3)рослини, з яких можна отримати великі кількості вірусу;

4)рослини, які використовують для оцінки інфекційності вірусу.

Для цих цілей використовують, як правило, різні види рослин. Так, наприклад, вірус мозаїки люцерни можна довгий час зберігати в люцерні, його найбільш високе накопичення спостерігається при культивуванні у тютюну, для визначення його ефективності використовують листя квасолі звичайної, а характерні симптоми, які відрізняють його від інших вірусів виявляються на тютюну, квасолі та Chenopodium amaranticolor.

Метод механічної інокуляції. Метод механічної інокуляції – найбільш поширений в лабораторній практиці спосіб засіб передачі вірусів здоровій рослині.

При механічній передачі інфекційний вірус (або його РНК) вводиться в

клітину через пошкодження (мікротравми) кутикули листя, що викликається застосуванням при інокуляції абразивом. Дрібні (400-700 мкм) абразивні порошки діатомових водоростей (наприклад, "целіт") є найбільш ефективним матеріалом для цієї операції. Для механічної інокуляції поверхня листя опилюється абразивним порошком, потім наноситься 1-2 краплі вірусної суспензії на оброблену абразивом поверхню і за допомогою скляної палички або пластикової петлі інокулят разом з аброзивом рівномірно розподіляється на поверхні ураженого листя. Цю операцію необхідно виконувати з врахуванням багатьох факторів: виду рослини, віку та стану листя, якості абразивного порошку та інших.

Методом механічної інокуляції краще всього передаються віруси, які достигають в рослинах високої концентрації та здатні уражати як епідерміс, так і інші тканини. До цієї категорії відносяться віруси, що викликають мозаїку, крапчатість або кільцеву плямистість. Після певного часу з моменту зараження чутливих до вірусу видів рослин можуть розвитися симптоми інфекції.

Віруси здатні заражати на тільки цілий організм господаря, але його окремі клітини, які вирощують у культурі (але і культурі клітин). Ціла клітинна оболонка рослин не доступна для вірусів і, якщо таку рослину обробити препаратом вірусу, зараження не відбудеться. Але, якщо зруйнувати клітинну оболонку рослини пектиназами і целюлазами, то отримані протопласти легко заражаються вірусом при додавання його у середовище для культивування протопластів. Протопласти використовують для культивування вірусів тютюнової мозаїки, огіркової мозаїки, Х- вірусу картоплі та інші.

ІІ. Ідентифікація та титрування фітопатогенних вірусів

Різні види рослин-хазяїв реагують на інфекцію по-різному. Характер реакції рослини залежить від її генетичної природи і від типу інфекції, якої заражають рослину. Відрізняють 4 основних типи реакції рослини на зараження їх вірусом:

1)імуність – рослина не заражається даним вірусом;

2)зверхчутливість – рослина заражається з утворенням уражень (некрозів), які з‘являються в наслідок відмирання клітин навколо точки зараження;

3)толерантність – вірус розповсюджується по тканинам рослини, але симптоми захворювання виражені слабо;

4)системні ураження – вірус розповсюджується по всім тканинам рослини з

28

яскраво вираженими симптомами захворювання.

Симптоми захворювання можуть бути різними: мозаїка, деформація листя, просвітління жилок, утворення хлоротичних плям різної форми. між цими типами реакції рослини на вірусну інфекцію іноді відсутні чіткі межі. Наприклад, тяжко відрізнити реакцію толерантності і системного ураження. У деяких рослин після механічної інокуляції спочатку утворюються некрози (зверхчутливість), далі рослини уражуються системно.

Але при вірному підборі рослин -хазяїв, а також при певних умовах інокуляції та культивування інфікованих рослин можливо отримати чіткі характерні картини інфекції.

Для кожного з вивчених вірусів можна підібрати набір рослин, які будуть специфічно редагувати на інфекцію (рослини – індикатори вірусу). Різні штами вірусу можуть відрізнятися по набору чутливих рослин-хазяїв або викликати різні типи реакції при ураженні рослин-індикаторів.

Таким чином, при використанні набору рослин-індикаторів, можливо ідентифікувати даний вірус та визначити його в суміші з іншими вірусами. Такий метод ідентифікації вірусів називається візуальний.

Для перевірки результатів, отриманих за допомогою візуального методу, використовують серологічні реакції з антисироватками до кожного із визначених вірусів та екстрактами рослин з системною інфекцією. Аглютинація хлоропластів

– найпростіший тест для вірусів рослин. Краплю антисироватки або нормальної сироватки змішують з краплею соку зараженої рослини. Якщо вірусні частки вступають в реакцію з антисироваткою, то відбувається аглютинація хлоропластів. Для титрування вірусних антигенів широко використовують серологічний тест – аглютинація. Для проведення цього тесту вірусний антиген у різних розведеннях змішують з одним і тим ж розведенням антисироватки і спостерігають утворення преципітату. Визначають оптимальне співвідношення концентрації антигену до антитіл при якому найшвидше утворюється преципітат та кінцеве розведення антигену, при якому можливе утворення видимого преципітату.

Серед мікроскопічних методів виявлення вірусів в рослинних клітинах широко використовується метод люмінесцентної та електронної мікроскопії. Використання флуорохрому – акридина помаранчевого дозволяє виявити локалізацію та тип нуклеїнової кислоти.

Для дослідження ультраструктури інфікованих вірусами клітин використовують методику: фіксують невеликий шматочок тканини визначеними хімічними речовинами (наприклад чотириокис осмію), обезводжують, домішують епоксидну смолу, за допомогою скляного ножа зразок ріжуть на шматочки товщиною 50-100 нм і зрізи обробляють солями урану або свинцю та досліджують в електронному мікроскопі.

Хід роботи

Для ідентифікації вірусу за допомогою набору різних рослин індикаторів виконують такі операції:

1. Вимити руки, робочу поверхню стола, інструменти, роботи проводити на чистому листі фільтрувального паперу.

29

2.За допомогою механічної інокуляції провести зараження 2-3 листків рослини тютюну, дурману, лободи, гомфрени, ячменя, квасолі.

3.Залишок вірусного препарату змити дистильованою водою.

4.Спостерігати за станом рослини протягом 12 діб з моменту зараження; визначити симптоми інфекції та час з‘явлення симптомів. Ідентифікацію вірусів провести на основі характеру уражень індикаторних рослин або відсутності інфекції у імунних до даного вірусу рослин (таблиця 3).

5.Отримані дані занести до протоколу і зробити висновки.

			Таблиця 3
	Реакція рослин-індикаторів на віруси
Рослина-	Типи реакції на різні віруси
індикатор	ВТМ	ХВК	ВМК
Тютюн клейкий	Великі (до 2 мм)	Слабкі симптоми	імунно
-	некрози через 35 діб	крапчатої мозаїки
Nicotiana	після зараження	через 10-12 діб після
glutinosa L.		зараження
Дурман –	Дрібні (0,5-1 мм)	Системна реакція	імунно
Datura	некрози через 3-5 діб	(мозаїка) через 7-10
stramonium L.	після зараження	діб після зараження
Гомфрена	Великі (до 2 мм)	Великі некрози (з	імунно
головчаста –	некрози через 4-5 діб	червоним ореолом)
Gomphrena	після зараження	через 6-7 діб після
globosa L.		зараження
Лобода	Дрібні (0,2-0,5 мм)	Великі (1-1,5 мм)	Дуже дрібні (0,1-
різнокольорова-	некрози через 4-5 діб	некрози з червоним	0,2 мм) некрози
Chenopodium	після зараження	ореолом через 12-20	через 2-4 доби
amaranticolor		діб після зараження	після зараження
Ячмінь -	імунно	імунно	Системна реакція
Hordeum			(мозаїка бурих
vulgare L.			крапин і коротких
			штрихів)
Квасоля –	Некрози (1 мм )	імунно	імунно
Phaseolus	через 2-3 доби після
vulgaris var.	зараження
Pinto

Контрольні питання

1.Поясніть терміни рослини-індикатори, рослини-господарі.

2.Охарактеризуйте поняття: «чиста лінія вірусу», «дикий вірус».

3.Основні методи зараження рослин вірусом. Переваги та недоліки цих методів. Для чого використовують абразиви.

4.Рослинна культура, її основні властивості. Для який цілей вона