metodichka_virusologija

0

Міністерство освіти і науки України Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ ДО ВИКОНАННЯ ЛАБОРАТОРНИХ РОБІТ ІЗ КУРСУ

«ВІРУСОЛОГІЯ»

2014

1

Міністерство освіти і науки України Дніпропетровський національний університет ім.Олеся Гончара

Кафедра мікробіології, вірусології та біотехнології

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ ДО ВИКОНАННЯ ЛАБОРАТОРНИХ РОБІТ ІЗ КУРСУ

«ВІРУСОЛОГІЯ»

Дніпропетровськ РВВ ДНУ

2014

2

Наведено рекомендації щодо виконання лабораторних робіт, метою яких є засвоєння методів роботи з вірусами, що уражують клітини людини і тварин, рослин та бактерій. Розглянуто улаштування та правила роботи у вірусологічній лабораторії, методи виділення та дослідження вірусів, вивчення їх властивостей та визначення титру. Роботи розроблено на основі даних реального застосування методів дослідження вірусів, що використовуються у роботі лабораторних служб, що може бути корисним для майбутніх фахівців у галузі вірусології та мікробіології.

Для студентів ДНУ напряму «Біологія».

Темплан 2014, поз.

Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт із курсу

“Вірусологія”

Укладачі: канд. біол. наук, доц. Л.П. Голодок канд. біол. наук, доц. О.С. Воронкова канд. біол. наук, ас. Дрегваль О.А.

д-р біол. наук, проф. А.І. Вінніков

Редактор

Техредактор

Коректор

____________________________________________________________________

Підписано до друку . Формат 60х84/16. Папір друкарський. Друк плоский. Ум. друк. арк. 1,4. Ум. фарбовідб. 1,4. Обл.-вид. арк. 1,6. Тираж 100 пр. Зам. №

______________________________________________________________________

РВВ ДНУ, просп. Гагаріна, 72, м. Дніпропетровськ, 49010. Друкарня ДНУ, вул. Наукова, 5, м. Дніпропетровськ, 49050

3

ВСТУП

Віруси є одними з найбільш розповсюджених у світі істот, загальна кількість яких перевищує сукупність усіх інших організмів. Водночас віруси володіють цілим рядом властивостей, що суттєво різнять їх від інших. Так, вони є неклітинними формами житття, що за характером є облігатними паразитами, залежними від білоксинтезуючого та енергетичного апарату клітин-хазяїв. Ці найдрібніші істоти викликають захворювання людини і тварин, рослин, грибів і бактерій.

Віруси поширені там, де й їх господарі. Їх можна виявити в ґрунті, морській і річковій воді, стоках. Їх виділяють із клінічного матеріалу від хворих (гній, фекалії та ін.). Передаються віруси повітряно-капельним, аліментарним, статевим, парентеральним та іншими шляхами, іноді – за участі переносників.

Активність вірусів за певних умов проявляється у вигляді цитопатогенної дії на клітини своїх хазяїнів, що виражається у руйнації клітин, їх трансформації або як індуктивний вплив.

Водночас, віруси завдають не лише шкоду, але й можуть бути використані як діагностичні, лікувальні і профілактичні препарати проти бактерій них збудників захворювань у медицині. Неоціненна також їх роль як моделей генетичних і біохімічних досліджень, розпочатих ще в 30-ті роки минулого сторіччя: більшість положень молекулярної біології доведено на вірусах. Крім того, у генетичній інженерії віруси використовуються як векторні системи для створення організмів з новими ознаками.

Лабораторні роботи з курсу «Вірусологія» допоможуть студентам оволодіти рядом методів дослідження, застосовуваних у вірусологічній практиці.

Основну увагу в даному виданні приділено методам роботи із вірусами, що використовуються у рутинній лабораторній практиці. Студенти мають засвоїти основи стерильної роботи з вірусами та методи вивчення взаємодії «вірус – клітина». Набуті навички можуть стати в нагоді під час роботи в наукових та дослідних лабораторіях медичного, промислового та сільськогосподарського профілів.

Лабораторні роботи мають проблемний науково-дослідний характер, що відображає теоретичне й практичне значення вірусології. У ході виконання робіт студенти навчатимуться правильної постановки завдань, знаходження шляхів їх виконання, оцінювання результатів експерименту та оформлення висновків.

4

ТЕМА 1. ВІРУСОЛОГІЧНА ЛАБОРАТОРІЯ: УСТРІЙ ТА ПРАВИЛА ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ

Віруси є облігатними паразитами, що викликають захворювання інших живих істот. Незалежно від того, який організм є хазяїном віруса, витоку вірусвмісного матеріалу з лабораторої не повинно відбуватися. Тому правила безпечної роботи із вірусами жорстко регламентовані, а до устрою приміщень вірусологічної лабораторії висувається цілий ряд вимог.

Лабораторна робота 1

Структура вірусологічної лабораторії та особливості режиму роботи

Мета: ознайомлення з призначенням, улаштуванням вірусологічної лабораторії, її обладнанням та режимом роботи.

Матеріали та обладнання: холодильники, термостати, автоклав, сушильна шафа, центрифуги, бокси, інструменти, лабораторний посуд, колекція ілюстративного матеріалу (таблиці, фотографії, малюнки).

Теоретичні відомості

Вірусологічну лабораторію слід розташовувати в ізольованому блоці з окремими входом і виходом. У приміщеннях лабораторії має бути як добре природне освітлення, так і комбіноване. Обов'язковими є цілодобове забезпечення електроенергією, наявність водопроводу та каналізації. Розрахунок площі приміщень лабораторії провадять залежно від конкретних завдань, режиму, планованої кількості досліджень. Загалом вірусологічна лабораторія, як і бактеріологічна, складається з власне лабораторії та підсобних приміщень. У лабораторних приміщеннях створюються умови для роботи з дотриманням стерильності. Для цього необхідні спеціально обладнані бокси з передбоксниками або кімнати з настільними боксами, де на відстані 70 см від робочого стола розміщують бактерицидні лампи, передбачається також використання пересувних кварцових ламп і пристроїв для подавання стерильного повітря. Всю роботу з культурами клітин, вірусвмісним матеріалом, а також серологічні дослідження з живими вірусами провадять тільки у боксі.

Серед підсобних приміщень вірусологічної лабораторії обов'язково має бути мийна з гарячою та холодною водою, спеціальними раковинами й ваннами, її обладнують також столами, стелажами для сушіння посуду, газовими або електричними плитами. Площа мийної має бути не меншою за 10 м2, з розрахунку 5 м2 на кожного працівника.

Допоміжними приміщеннями вірусологічної лабораторії є також препараторська, кімната для збереження реактивів, посуду та діагностичних препаратів, приймальна для аналізів і видачі довідок, віварій тощо. Приміщення вірусологічної лабораторії мають бути такими, що легко миються та обробляються дезинфікуючими засобами, тому стіни треба фарбувати світлою

5

олійною фарбою або облицьовувати кахлем на висоту 1,5–1,7 м. Підлогу можна покривати лінолеумом або кахлем чи фарбувати олійною фарбою.

За ступенем небезпеки для людей збудники вірусних інфекцій поділяються на 4 групи :

І група – віруси Ебола, Ласса, Марбург, Мачупо, натуральної віспи, вірус В (мавп).

II група – арбовіруси, ареновіруси, що не увійшли до І групи, вірус сказу (дикий штам), віруси гепатиту А і В. Нині до II групи відносять збудник СНІДу – ВІЛ.

III група – віруси грипу, поліомієліту, енцефаломіокардиту, вакцини віспи. IV група – адено-, корона-, цитомегало-, ентеро-, рео-, онковіруси тощо. Дозвіл на роботу з вірусами І–IV груп видають спеціальні режимні комісії. У

вірусологічних лабораторіях СЕС дозволяється робота з вірусами тільки III–IV груп.

Роботу з вірусами, що спричинюють особливо небезпечні інфекції (І група), а також із збудниками висококонтагіозних епідемічних вірусних захворювань людини (II група) можна провадити тільки у спеціалізованих лабораторіях, що мають дозвіл режимної комісії.

Увірусологічних лабораторіях персонал повинен працювати в хірургічних халатах, шапочках або косинках і масках з 4 – 6 шарів марлі. Халати слід міняти не рідше як 1 раз на три дні, а маски – щодня. Для роботи у боксі надягають два халати (верхній – стерильний), стерильну шапочку та маску. Шапочку й маску міняють протягом робочого дня 2 – 3 рази. Під час роботи у боксі з лабораторними тваринами додатково надягають фартух із клейонки, гумові рукавички, у разі необхідності – захисні окуляри. Гумові рукавички та фартух знезаражують 0,5 % розчином хлораміну або 6 % розчином перекису водню з 0,5

%розчином мийних засобів шляхом 2 – 3-разового занурювання в ексикатор із

розчинами. Халати, шапочки та маски обробляють шляхом парової стерилізації (60 хв підтиском 108,1 кПа, або 1,1 кгс/см2) або кип'ятіння у 2 % розчині натрію гідрокарбонату (можна з будь-яким мийним засобом) протягом 1 год. Окуляри занурюють у 70 % спирт на 2 год.

Зберігати матеріал, що містить віруси, можна тільки у спеціально призначених для цього холодильниках з обов'язковим пломбуванням їх. Досліджуваний матеріал разом з культурами вірусів реєструють у спеціальних журналах реєстрації матеріалів, що надійшли для дослідження, обліку виділених культур та їх знезараження, руху культур і заражених тварин, стерилізації заразного матеріалу, а також в інвентарній книзі музейних культур. Усі журнали мають бути пронумеровані, прошнуровані й опечатані.

Увсіх приміщеннях вірусологічної лабораторії слід щодня провадити вологе прибирання. Підлогу в боксах і передбоксниках до початку роботи обробляють 0,5 % розчином хлораміну, столи та інші горизонтальні поверхні – 70 % етиловим спиртом. Перед початком роботи та після її закінчення у боксі й передбокснику на 20 – 30 хв вмикають бактерицидні лампи. Стерильність повітряного середовища контролюють 1 – 2 рази на тиждень за допомогою седиментаційного методу.

6

Хід роботи

1.Ознайомитися з вірусологічною лабораторією кафедри та її основним обладнанням. Занотувати у робочему зошиті основні типи посуду, інструментарію, приладів та обладнання, які використовуються у лабораторії.

2.Вивчити санітарно-епідемічні правила роботи вірусологічної лабораторії. Одержати інструктаж по техніці безпеки при роботі у лабораторії і розписатися в журналі.

3.Підготувати бокс до стерильної роботи: провести дезинфекцію, обладнати необхідними матеріалами. Провести аналіз на стерильність боксу. Для цього відкриті чашки Петрі з м‘ясо-пептонним агаром (МПА) або пептонним агаром Сабуро витримати протягом 7 – 10 хв у боксі, потім чашки з МПА поставити у термостат за температури 37 °С на 3 – 5 днів, а чашки з агаром Сабуро залишити при кімнатній температурі на 7 – 10 діб. Якщо на чашках з'явиться не більше 10 колоній протягом усього зазначеного періода, то бокс вважається чистим.

Контрольні питання

1.Які види робіт виконуються у вірусологічній лабораторії?

2.Які основні вимоги ставляться до приміщення вірусологічної лабораторії та її оснащення?

3.Що таке дезинфекція? Як і для чого вона здійснюється?

4.Принципи класифікації вірусів за ступенем небезпеки.

5.Які причини та джерела внутрішньолабораторного зараження персоналу вірусологічних лабораторій?

Лабораторна робота 2

Методи обробки та стерилізації лабораторного посуду, гумових виробів, металевих інструментів для вірусологічних досліджень

Мета: ознайомлення з основними методами обробки та стерилізації лабораторного посуду, гумових виробів, металевих інструментів, живильних середовищ, одягу.

Матеріали та обладнання: лабораторний посуд (піпетки Мора, Пастера та мірні, пробірки біологічні, клінічні та Лейтона, чашки Петрі, Карреля, матраци, колби круглі та конічні, воронки, циліндри, гумові пробки, металеві інструменти (ножиці, пінцети, шприці), стерилізатор для інструментів, штативи, марля, вата, склянка з водою, папір для обгортання, шпагат, олівець, дезінфікуючі та миючі засоби, сушильна шафа, автоклав, колекція ілюстрованого матеріалу (таблиці, фотографії, малюнки).

Теоретичні відомості

Новий скляний посуд (матраци, флакони, колби, пробірки тощо) миють

7

водопровідною водою та обробляють хромовою сумішшю. Для приготування хромової суміші беруть 200 г калію дихромату (К2Сг2С7), кладуть у порцеляновий кухоль і розводять невеликою кількістю 20 % розчину сірчаної кислоти, після чого нею ж повільно доводять до загального об'єму 10 л. Новий посуд занурюють у цю хромову суміш на 1 год, потім виймають, дотримуючись відповідних правил техніки безпеки, споліскують 10 – 12 разів під проточною водою, складають у відро, заливають дистильованою водою і кип'ятять протягом 1,5 год. Після цього посуд висушують і готують до стерилізації сухим жаром. Шийки чистих сухих пляшок і матраців закривають двома шарами алюмінієвої фольги та обв'язують шпагатом. Пробірки по 10 – 20 штук обгортають пергаментним папером або фольгою. Піпетки затикають ватою, кожну обгортають смужкою пергаментного паперу або по кілька штук розміщують у спеціальних пеналах для стерилізації. Стерилізують не менш як 60 хв при температурі 180 °С або 150 хв при температурі 160 °С.

Використаний не забруднений мікрофлорою посуд споліскують під проточною водопровідною водою, кладуть у бак із нержавіючої сталі й кип'ятять протягом 20 – 30 хв у 0,5 % мийному розчині. Після цього посуд ретельно миють йоржами, 8 – 10 разів промивають проточною водою для видалення залишків детергенту й занурюють у хромову суміш на 1 год. Далі обробляють так само, як і новий посуд.

Нові пробірки й гумові трубки кип'ятять протягом 1 – 3 год у 4 % розчині натрію гідрокарбонату. Потім їх кілька разів промивають гарячою водопровідною водою та кип'ятять 1 раз у 0,3 – 0,5% мийному розчині будь-якого синтетичного порошкоподібного засобу. Промивають 5 – 6 разів під краном, заливають дистильованою водою і кип'ятять протягом 1 год, після чого пробки загортають по 15 – 20 штук у пергаментний папір. Стерилізують парою 30 хв під тиском 156,4 кПа, або 1,5 атм.

Пробки й гумові трубки, що були у користуванні, промивають водопровідною водою, 20 – 30 хв кип'ятять у дистильованій воді й висушують. Висушені пробки обгортають пергаментним папером і стерилізують парою у зазначеному режимі.

Пінцети, ножиці, скальпелі та інші інструменти миють під проточною водою й витирають. Перед роботою інструментарій кип'ятять у дистильованій воді протягом 30 хв.

Використані панелі з полівінілхлориду, полістиролу промивають проточною водою та кладуть на 2 год у мийний 0,3—0,5% розчин детергенту при температурі 37 °С. Панелі, інфіковані вірусом, попередньо витримують 2 – 3 год у 3% розчині хлораміну.

Якщо треба механічно видалити залишки матеріалу, застосовують м'які щіточки, щоб не пошкодити поверхню лунок. Потім пластикові панелі промивають під сильним струменем проточної води протягом 10 – 15 хв і споліскують близько 10 разів дистильованою водою, щоразу струшуючи її рештки. Далі панелі занурюють у 96 % етиловий спирт на 24 год. Після цього у холодильнику вони можуть зберігатися тривалий час. Перед використанням їх виймають із спирту й висушують. Стерилізувати панелі можна за допомогою УФ-

8

випромінювання, при цьому їх вкладають у поліетиленові пакети, запаюють і так зберігають.

Хід роботи

1.Підготувати лабораторний посуд (пробірки, флакони, піпетки) до стерилізації сухим жаром.

2.Підготувати гумові вироби (пробки, трубки) до стерилізації парою.

3.Підготувати металеві інструменти (ножиці, скальпелі, пінцети) для проведення для вірусологічних досліджень.

Контрольні питання

1.Назвіть види лабораторного посуду та металевих інструментів, що застосовуються у вірусологічних лабораторія?

2.Охарактеризуйте методи обробки та стерилізації посуду, гумових виробів?

3.Як підготувати металеві інструменти до вірусологічних досліджень?

ТЕМА 2. РОБОТА З ВІРУСАМИ ЛЮДИНИ І ТВАРИН

Віруси людини і тварин є одними з найбільш значущих для людини. Вони обумовлюють виникнення як поодиноких випадків захворювання, так і епідемій, що охоплюють велику кількість осіб. і навть пандемій, що набувають світового значення. Віруси людини і тварин є одними з найбільш небезпечних патогенів за наслідками їх дії на організм живої істоти. Крім того, для лікування вірусних інфекцій майже відсутні специфічні препарати.

Дослідження вірусів є одним з приоритетних завдань медицини та біології, ля чого орзроблено цілий комплекс методів лабораторного та дослідницького призначення.

Лабораторна робота 3

Використання лабораторних тварин для дослідження вірусів людини і тварин

Мета: ознайомлення з використанням лабораторних тварин у вірусологічних дослідженнях та з методами розтину та одержання вірусвміщуючого матеріалу з органів та тканин інфікованих тварин.

Матеріали та обладнання: лабораторні тварини (щури, миші); вірусвмісний матеріал; лабораторний посуд (піпетки мірні на 1, 2, 5 мл, пробірки, колби); інструменти (ножиці, пінцети, корнцаги, шприци); стакан з етиловим спиртом; стерилізатори для інструментів; штативи; ексикатори; склянка з ватою; склянка для фіксації дрібних лабораторних тварин; газові або спиртові горілки; 2% спиртовий розчин йоду; 3% водний розчин пікринової кислоти; водний розчин фуксину; 96% етиловий спирт; фізіологічний розчин; ефір для наркозу; дезінфікуючі засоби; колекція ілюстративного матеріалу (таблиці, фотографії, малюнки).

9

Теоретичні відомості

І. Культивування вірусів людини і тварин у організмі лабораторних тварин

Лабораторних тварин використовують у вірусологічні:'. практиці для виділення вірусів із клінічного і секційного матеріалу, подальшого титрування та ідентифікації цих вірусів підчас реакції нейтралізації. Для цього використовують білих мишей (дорослих і сисунців), морських свинок, хом'ячків, кролів та ін.

Найбільш чутливими до широкого спектра збудників вірусних інфекцій є білі миші. Сприйнятливість тварин де вірусів визначається їхнім віком, а в ряді випадків оптимальну чутливість відзначено у новонароджених тварин.

Існують різні способи уведення інфекційного матеріалу лабораторним тваринам, значною мірою це визначається тропізмом вірусу

Зараження у мозок. Тварин (мишей, щурів) тримають лівою рукою, відтягуючи шкіру голови до потилиці великим і вказівним пальцями. Тонку голку туберкулінового шприца уводять вертикально, трохи латеральніше за середню лінію голови. Перед уколом і після нього шкіру обробляють 70 % етиловим спиртом.

Внутрішньочеревинне зараження проводять з участю асистента, який тримає тварину вниз головою, злегка відтягуючи вгору її лапки. Дослідник уводить матеріал у черевну порожнину так, щоб голка не травмувала внутрішніх органів, зсунутих донизу. Місце ін'єкції перед і після неї обробляють 70 % етиловим спиртом або 3 % розчином йоду.

Інтраназальне зараження проводять під ефірним наркозом (тварину вміщують у закриту скляну банку, на дні якої є вата, змочена ефіром). Досліджуваний матеріал уводять сонній тварині в кожну ніздрю шприцом або пастерівською піпеткою.

Зараження під шкіру. Тварину фіксують лівою рукою, пальцями цієї самої руки відтягують складку шкіри на шиї або в іншому місці, уводять матеріал підшкірне в основу складки шкіри після попереднього знезаражування її.

Зараження новонароджених мишей. Для одержання новонароджених мишей (сисунців) необхідно тримати у віварії па 5 – 6 самиць одного самця. Строк вагітності нелактуючих самиць – 19 – 21 день, а тих, що народжують повторно – 26 днів. Самиці мають бути цілком здоровим: (а отже, не мати латентних інфекцій, і такі, яких не використовували для виділення вірусів. Вагітних самиць розсаджують по одній у скляні банки або клітки та спостерігають за ними не менше ніж 2 рази на день.

Для того щоб запобігти поїданню сисунців матерями-самицями, всі маніпуляції з тваринами проводять у рукавицях. Ніс самиці та шкіру мишенят змащують спиртом. Самиці дають багато пити. З кожною самицеюгодувальницею залишають 6 – 8 сисунців. Заражають їх за допомогою туберкулінових шприців з тонкими голками. Для зараження матеріалом від одного хворого використовують 4 – 8 мишенят – одноразовий приплід однієї самки.