VMB

видами; серед запропонованих варіантів найбільшого поширення знайшла класифікація Раньона (1959), в основу якої покладені дві властивості — колір колоній і швидкість росту. Відповідно вона виділяє 5 груп мікобактерій — патогенні (Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, M. bovis, M. microti і М. lepraemurium) і 4 групи атипових мікроорганізмів. Класифікація атипових мікобактерій за Раньоном передбачає розподіл їх на чотири групи. Перша група — фотохромогенні мікобактерії — при доступі світла утворюють жовтий або оранжевий пігмент, який надає відповідного кольору колоніям. До цієї групи належать М. kansasii і М. marinum, які виділяються із організму великої рогатої худоби та свиней. Друга група — скотохромогенні мікобактерії — утворюють жовто-оранжевий пігмент як на світлі, так і в темноті (М. scrofulaceum, М. gordonae, М. paraffinicum). Третя група — нефотохромогенні мікобактерії, які не утворюють пігмент, або лише його сліди. Четверта група — швидкоростучі мікобактерії, які утворюють колонії на 2—3-й день, у той час як представники перших трьох груп формують колонії на 10— 30-й день.

До недавнього часу вважали, що атипові мікобактерії мають генетичну спорідненість із збудником туберкульозу і є формами його мінливості. Проте Вайн в 1971 р. на підставі аналізу нуклеїнових кислот, кількісної таксономії і серологічних досліджень довів, що атипові мікобактерії є самостійними видами, а не мутантами М. tuberculosis. Разом з тим існує думка, що збудник туберкульозу птиці слід відносити до атипових мікобактерій.

Бактеріологічні методи ідентифікації різних мікобактерій включають визначення наступних параметрів: здатність до утворення пігменту, швидкість росту, ріст при різних температурах, здатність до

411

росту на МПА, форми колоній і мікроколоній, толерантність до NaCI і деякі біохімічні особливості.

Таблиця 1. Біохімічні ознаки патогенних, повільноростущих

мікобактерій

	М.	М.	M.	М.	M.	М.
Активність	mаrіnum	tuberculos	bovis	аvium	kansasіі	scrofulaceu
уреаза	+	+	+	-	+	+
піразинамідаза	+	+	-	+	±	+
кисла фосфатаза	+	+	+	-	+	-
відновлення	-	+	-	-	+	±
нітратів
α-естераза	-	+	+	+	-	±
каталаза	±	-	-	±	+	+
акумуляція ніацина	-	+	-	-		-
гідроліз твіну	+	±	-	-	+	-

Морфологія і тинкторіальні властивості. Тонкі, прямі чи злегка вигнуті палички розмірами 1-10х0,2-0,6 мкм, зі злегка закругленими кінцями; у цитоплазмі містять зернисті утворення (2- 10). Морфологія істотно варіює в залежності від віку культури й умов культивування — у молодих культурах палички більш довгі, а в старих схильні до простого розгалуження. Іноді утворять коковидні структури і L-форми, що зберігають інфекційність, а також фільтрівні форми, патогенетична роль яких залишається погано вивченою. Нерухомі, спор не утворюють, позбавлені капсул, але мають мікрокапсулу, відділену від клітинної стінки осмієфобною зоною. Кислоторезистентні, що обумовлено високим вмістом ліпідів і

412

міколової кислоти в клітинній стінці, а також утворюють кислотолабільні гранули, що переважно складаються з метафосфату (зерна Муха), що розташовуються вільно або в цитоплазмі паличок. Грампозитивні, анілінові барвники сприймають погано; по Цілю— Нільсену зафарбовуються в яскраво-червоний колір, по Муху-Вайссу

— у фіолетовий (йодофільність); гранули також фарбуються у відповідний колір.

Культуральні властивості. Аероби, але здатні рости факультативно у анаеробних умовах; вміст 5-10% СО2 сприяє більш швидкому росту. Розмножуються поділом, процес проходить дуже повільно, у середньому за 14-18 год. Температурний оптимум 37-38 °С; рН 7,0-7,2 (росте в межах 4,5-8,0). Для росту потребують присутності білкового субстрату і гліцерину, а також вуглецю, хлору, сірки, фосфору, азоту, факторів росту (біотину, нікотинової кислоти, рибофлавіну й ін.), іонів (Mg2+, К+, Na+, Fe2+). Для вирощування найбільше часто використовують щільні яєчні середовища

(Левенштейна—Йенсена, Петраньяні, Дорсе й ін.), синтетичні і напівсинтетичні рідкі середовища (наприклад, середовище Сотона) і ін. На рідких середовищах ріст спостерігають на 5-7 добу у виді сухої зморшкуватої плівки (R-форма), що піднімається на краї пробірки; середовище залишається прозорим. У середовищах, що містять детергент (твін-80), дають рівномірний ріст по товщі середовища (особливо при періодичному струшуванні). На рідких середовищах і при внутрішньоклітинному розвитку добре виявляється характерний корд-фактор (трегалоза-6,6-дімиколат), що обумовлює зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях, їх ріст у виді серпантиноподібних кіс, що має відношення до вірулентності збудника. На щільних середовищах ріст відзначають на 14-40 добу у

413

виді сухого зморшкуватого нальоту кремового кольору; колонії з піднятим центром, що нагадують кольорову капусту, крихкі, погано змочуються водою і мають приємний аромат. Культури погано знімаються із середовища, а при прожарюванні тріскотять. Під впливом антибактеріальних препаратів можуть дисоціювати з утворенням м'ягких вологих S-колоній або рости у виді гладких чи пігментних колоній. Відмінна риса Mycobacterium tuberculosis — здатність до синтезу значної кількості нікотинової кислоти (ніацина), що використовують для її диференціальної діагностики з іншими мікобактеріями (ніациновий тест); одне з умов — необхідність посіву на середовище Левенштейна—Йенсена, яке не містить малахітового зеленого (тому що барвник вступає в реакцію з використовуваними реагентами). На середовищах із жовчю утворюють сіруватий маслянистий наліт, утворений подовженими розгалуженими паличками.

Резистентність. Паличка Коха досить стійка до різних впливів: у молоці гине через 15-20 хв при температурі 60° С; при аналогічній температурі в мокротинні зберігається до години; при кип'ятінні гине через 5 хв. Пряме сонячне світло убиває паличку Коха через 45-55 хв, розсіяний світло — через 8-10 діб. Добре зберігається при висушувані (до декількох тижнів). Звичайні хімічні дезінфектанти відносно мало ефективні; 5% розчин фенолу убиває Mycobacterium tubercuhsis лише через 5-6 год; збудник також здатний швидко виробляти стійкість до більшості антибактеріальних засобів.

Збудник туберкульозу

414

Туберкульоз (Tuberculosis) інфекційне захворювання людини і тварин, яке частіше перебігає хронічно й характеризується утворенням у внутрішніх органах і тканинах типових вузликів— туберкулів, схильних до казеозного переродження.

Туберкульоз людству відомий з давніх часів, проте його природа поступово з'ясовувалася, починаючи з середини XIX століття.

В 1896 р. Леман і Нойман віднесли збудника туберкульозу до роду Mycobacterium.

Мікобактерії віднесені до порядку Actinomycetales, родина Муcobacteriaceae. Рід Mycobacterium об'єднує близько 40 видів.

Збудник туберкульозу має три основних види: Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, М. avium а також M. murium, M. poykilothermorum. У «Визначнику бактерій» Берджі (1997) відносяться до Групи 21 «Мікобактерії».

Морфологія. M. tuberculosis — прямі або злегка зігнуті палички довжиною 1—6 і шириною 0,3—0,6 мкм ( рис.18). Зустрічаються дуже короткі або видовжені й навіть гіллясті форми.

Рис.18. M. tuberculosis. Скануюча ЕМ (за Денніс Канкель,

415

2004 р.).

M. bovis— дещо коротші прямі або злегка зігнуті палички довжиною 1,5—2 і шириною 0,3—0,6 мкм. Цей вид є основним збудником туберкульозу у великої рогатої худоби, інших жуйних, рідше уражує людей, м'ясоїдних тварин і деякі види птиці.

М. avium — основний збудник туберкульозу птахів, інколи викликає захворювання у свиней і великої рогатої худоби. У нього виражений поліморфізм: поряд з тонкими прямими або зігнутими паличками мікобактерій туберкульозу зустрічаються кокоподібні й нитчасті форми (рис. 19).

За даними професора Власенка В.В. для збудника туберкульозу є закономірний біологічний цикл його розвитку: артроспори, дроблення, ділення та інші, що визначає значний поліморфізм їх в процесі росту та розвитку і вимагає від дослідника особливої уваги під час інрерпритації результатів мікроскопічного дослідження відповідних матеріалів.

Збудник туберкульозу, як і інші мікобактерії, кислотота спиртостійкий, фарбується позитивно за Грамом, нерухливий, не утворює cпoр i капсул. Добре фарбується за методом Ціль-Нільсена; при цьому фіксований на полум’ї мазок фарбують карболовим фуксином Ціля з підігріванням до відходження пари протягом 3 хв, промивають водою і знебарвлюють 3—5 %- ним розчином сірчаної кислоти 5—7 с, промивають водою, додатково обробляють 70—90 %-ним етанолом протягом 3—5 с, промивають водою і фарбують контрастно метиленовою синькою Лефлера близько 1 хв. Промитий мазок висушують. Мікобактерії, проявляючи стійкість проти кислоти і спирту, зберігають червоний колір, інші бактерії і клітини патологічного

416

матеріалу - сині.

Рис. 19. M. avium. Скануюча ЕМ (за Денніс Канкель, 2004 р.).

Здатність мікобактерій протистояти короткочасному впливу мінеральних кислот, спиртів, антиформіну пояснюється в основному їх хімічною структурою. Зокрема, мікобактерії туберкульозу відрізняються високим вмістом ліпідів, на частку яких припадає 10—40 % сухої мікробної маси. До складу ліпідів входять віск (5—12 %), нейтральні жири і фосфатиди, які імпрегнують бактеріальні клітини й надають їм гідрофобності. Крім того, віск містить значну кількість міколових кислот, які з основними фарбами утворюють міцну сполуку, стійку проти кислот і деяких інших хімічних речовин.

Збудник туберкульозу нерівномірно сприймає фарби, в зв'язку з чим має зернистий вигляд. В цитоплазмі знаходять різні за формою і величиною включення, названі зернами Муха. Крім цитоплазми їх можна виявити поряд з клітинами і навіть в мазках із патологічного матеріалу.

В цитоплазмі туберкульозних мікобактерій можна виявити також

417

кілька вакуолей. Бактерії туберкульозу здатні утворювати дефектні щодо клітинної стінки форми, або такі, які повністю її втратили (L- форми). Останні можуть тривалий час існувати в організмі і реверсувати у початковий стан як тільки припиниться вплив трансформуючого фактора (антибіотиків, поверхнево активних речовин типу гліцину, лізоциму, мікобактеріофага). L-форми зберігають антигенність і під їх впливом утворюються антитіла. Однак патогенність цих форм порівняно з початковим типом значно нижча і при зараженні морських свинок розвивається в'ялий туберкульозний процес.

Культуральні властивості. Збудники туберкульозу культивуються на елективних живильних середовищах в аеробних умовах. М. bovis — мікроаерофіл і при пересівах він легко адаптується до росту в аеробних умовах. Оптимальна температура росту для М. tuberculosis 37—38 °С, М. bovis — 38—39, М. avium — 39—41 °С, з оптимальною рН для усіх видів 6,8—7,4.

Збудники туберкульозу дуже вибагливі до живильних середовищ. Останні повинні містити мінеральні солі, амінокислоти, фактори росту, деякі інші речовини й обов'язково гліцерин як джерело вуглецю (гліцеринові МПБ, МПА, картопля).

Для приготування елективного середовища Левенштейна — Ієнсена беруть 1 л яєчної маси (вміст яєць асептично виливають у колбу з бусами), 600 мл сольового розчину, до складу якого входять калій однозаміщений фосфорнокислий 2,4 г, магній сірчанокислий — 0,24, магній лимоннокислий — 0,6, L-аспарагін — 3,6 г, гліцерин — 12 мл, вода дистильована — 600 мл, додають 30 г картопляного борошна і 20 мл 2 %-ного стерильного розчину малахітової зелені. Сольовий розчин стерилізують, в автоклаві при 1,5 атм. протягом 30 хв,

418

після охолодження до нього додають стерильне картопляне борошно, яєчну масу й розчин малахітової зелені, фільтрують через паперовий фільтр, розливають у пробірки й піддають згортанню в нахиленому положенні при температурі 85 °С протягом 30 хв.

Широко застосовують також елективні середовища Гельберга, Петраньяні, Мордовського та інші, а також синтетичні — Сотона, Моделя та інші, рецептура яких і спосіб приготування описані в спеціальних довідниках.

На щільних живильних середовищах М. tuberculosis (рис. 20), на 20— 30-ту добу після посіву утворює бородавчасті колонії (R-форма), рідше — з рівними краями і поверхнею (S-форма). У рідких середовищах на 15—30 -ту добу на поверхні утворюється потовщена зморщена плівка, краї якої дещо завертаються на стінки колби. Інколи на дні її помітні дрібні крупинки, рідина в усіх випадках прозора. M. bovis пpи первинному виділенні на щільних середовищах росте погано й перші ознаки росту з’являються лише через 30— 60 діб. Поступово формуються дрібні, круглі, вологі, майже прозорі колонії. Особливістю цього виду є те, що гліцерин затримує його ріст, у зв'язку з чим на яєчних середовищах з гліцерином він росте, дуже погано, або й не розвивається зовсім. За рахунок мікроаерофільності в напіврідких середовищах колонії утворюються на глибині 9—20 см від поверхні. В рідких середовищах М. bovis утворює тонку, інколи сітчасту плівку, яка не покриває всієї поверхні рідини.

419

Рис. 20. Ріст мікобактерій на середовищі Петраньяні.

М. avium росте порівняно швидше. Починаючи з 20-ї доби, можна помітити утворення гладеньких, блискучих сірувато-білого або жовтуватого кольору кратероподібних колоній. Нерідко формується суцільне вологе ослизле нашарування. У рідких середовищах на дні пробірки колонії мають вигляд ватоподібного осаду. В інших випадках на поверхні середовища виникає спочатку суха, потім ослизла суцільна плівка.

Відомі також середовища, що «прискорюють» ріст збудника туберкульозу (Власенко В.В., 2002). Помітний ріст його можна спостерігати вже через декілька днів після посіву.

Антигенна структура. Для всіх мікобактерій спільним є термостабільний антиген поліцукридної природи. Кожен вид збудника туберкульозу має від 4—6 до 8—10 антигенних компонентів, серед яких є і групові. Зокрема, М. avium має 4, сапрофітні мікобактерії

— 2—3 антигени, ідентичні з антигенами М. bovis. Це в значній мірі ускладнює імунологічну діагностику туберкульозу через групові реакції. Незважаючи на спільність антигенних комплексів, виявилося, що окремі антигени мікобактерій різняться між собою за кількісною і

420