Теоретическая справка Возбудитель дифтерии Культуральные свойства

Наиболее характерные колонии на среде Клауберга II с добавлением теллурита калия или натрия (элективная среда для выращивания С. diphtheriae). Они вырастают в виде почти черных колоний, выделяющихся на красном фоне среды. Цвет колоний обусловлен способностью С. diphtheriae в процессе роста восстанавливать теллуристый калий до элементарного теллура.

Микробы дифтерии не являются однородными по своим культурально- биохимическим свойствам и подразделяются на биовары gravis, mitis и intermedius. На среде Клауберга II через 48 часов бактерии биовара gravis вырастают в виде круглых (d 1,5- 2 мм) колоний с неровными краями, часто имеют приподнятый центр и радиальная исчерченность. Колонии серовато- черного цвета, напоминают маргаритки. Вариант mitis дает круглые выпуклые колонии черного цвета (d 1- 1,5 мм) с ровными краями. Вариант intermedius занимает промежуточное положение. Дает черные выпуклые с блестящей поверхностью колонии.

Серодиагностика

Антитела к С. diphtheriae определяют в крови больных, начиная с первых дней болезни и повторно через 10-14 дней. Обязательным условием является определение специфических антител в динамике болезни в парных сыворотках. Диагностическое значение имеют результаты серологических исследований при нарастании титра антител не менее чем в 3-4 раза.

Для определения уровня дифтерийного антитоксина в сыворотке человека применяют несколько реакций:

1. Рпга

РПГА - двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного (представляет собой эритроциты с адсорбированным на них дифтерийным анатоксином) и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сы­воротке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

В нашей стране РПГА рекомендована в качестве основного метода для определения напряженности антитоксического иммунитета к С. diphtheriae, а также для оценки вакцинального иммунитета.

Оценка состояния коллективного иммунитета требует более детальной характеристики, чем только установление процента серонегативных. Для этого следует давать развернутые по каждому титру данные в РНГА т.е. с учетом степени напряженности. Отсутствие антител является безусловным показателем незащищенности; титры 1:10 и 1:20 можно считать индикатором пограничного иммунитета, не обеспечивающего безусловной защиты; однако заболевание при этом, как правило, протекает в легкой форме без летального исхода. Титры 1:80 и выше являются показателем защищенности группы.

Таким образом, процентное распределение показателей титров в каждом разведении дает качественную характеристику состояния иммунитета к дифтерии в обследованной группе. Например, выявление у 50% обследованных показателей пограничного иммунитета (титры 1:10, 1:20) свидетельствует о слабой защищенности группы, в которой с годами будет увеличиваться число лиц, не защищенных от дифтерии.

В настоящее время приняты следующие количественные критерии, характеризующие степень восприимчивости к дифтерии в зависимости от уровней антитоксических антител.

Содержание антитокси­ческих антител	Интерпретация результатов
< 0,01 МЕ/мл	обследуемый восприимчив к дифтерии
0,01 МЕ/мл	минимальный уровень циркулирующих антител, обеспечивающий некоторую степень защиты
0,01-0,09 МЕ/мл	уровни циркулирующих антитоксических анти­тел, обеспечивающие некоторую степень защиты
0,1 МЕ/мл	защитный уровень циркулирующих антител
> 1,0 МЕ/мл	уровень антитоксина, обеспечивающий стойкую длительную невосприимчивость к дифтерии

2. ИФА

ИФА предназначен для количественного определения антибактериальных и антитоксических иммуноглобулинов А, М, G человека в сыворотке крови больных дифтерией, бактерионосителей и здоровых людей. Принцип ИФА основан на образовании специфического комплекса антиген-антитело, выявляемого с помощью второго антитела, меченного пероксидазой хрена. При последующем добавлении субстратной смеси развивается ферментативная реакция, регистрируемая по появлению окрашенного продукта. Интенсивность реакции учитывается с помощью иммуноферментного анализатора или визуально.

3. Определение титра антител к дифтерийному токсину в сыворотке крови человека в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток.

Метод основан на том, что метаболическая активность и рост клеток культуры ингибируется дифтерийным токсином, который, в свою очередь, может быть нейтрализован антитоксином, содержащимся в сыворотке крови. Последовательное разведение сыворотки крови человека добавляют в лунки микропланшета, в которые затем вносят дифтерийный токсин в рабочей дозе и культуру клеток. Обнаружение по окончании инкубации (t 37^оС 5-6 суток) живых клеток культуры в лунках, содержащих определенные разведения сывороток, будет указывать на соответствующий титр антител к дифтерийному токсину в тестируемых сыворотках + проба на токсигенность.