Chastnaya_mikrobiologia

странах, угрозой биотерроризма и т.д. Четко обозначилась также роль микроорганизмов в развитии неинфекционных болезней (ассоциация геликобактериозной инфекции с язвенной болезнью желудка и 12-перстной кишки, этиологическая роль вирусов в развитии онкологических заболеваний и т.д.) Прогресс современной биотехнологии позволил создать принципиально новые медико-биологические препараты (вакцины, иммуноглобулины, цитокины и т.д.) на основе новых технологий и существенно усовершенствовать имеющиеся. Успехи генетики вооружили практическую микробиологию полимеразной цепной реакцией, которая за короткий промежуток времени стала лидирующим методом экспресс-диагностики ряда инфекций. В связи с этим освоение студентами вопросов частной медицинской микробиологии на современном уровне является чрезвычайно важным этапом в изучении не только микробиологии, но и смежных дисциплин. Предлагаемое пособие, созданное на основе действующей программы по микробиологии, иммунологии и вирусологии для студентов лечебных, медико-профилактических и педиатрических факультетов (Москва, 2000), позволит студентам ознакомиться с современными методами лабораторной диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней. Наличие перечня вопросов, знаний и умений к каждому занятию, подробное описание методов лабораторной диагностики, самостоятельной работы, существенно облегчит подготовку студентов к практическим занятиям и самостоятельную работу на них.

Пособие предназначено для студентов медицинских вузов, а также может быть использовано при подготовке и проведении практических занятий со студентами, аспирантами и преподавателями кафедры микробиологии и кафедр смежных специальностей.

Учреждение-разработчик: Ярославская государственная медицинская академия

Рецензенты: заведующий кафедрой инфекционных болезней доктор медицинских наук, профессор Н.А.Благов, член-корреспондент РАЕН, заслуженный врач РФ; заведующий кафедрой детских инфекций кандидат медицинских наук, доцент В.П.Киселев, заслуженный врач РФ

Рекомендовано к печати: цикловой методической комиссией по морфологическим и патоморфологическим дисциплинам ЯГМА от 20.05. 2004 (протокол № 1);

Утверждено и рекомендовано к изданию: Центрально-координационным методическим советом и Редакционно-издательским советом ЯГМА, председатель – профессор Ю.П.Троханов (протокол № 2, от 03.06.2004)

Ярославская государственная медицинская академия, 2004

Список сокращений

БГКП - бактерии группы кишечной палочки ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа ЖСА - желточно-солевой агар

ИР - изотонический раствор хлорида натрия ИФА - иммуноферментный анализ ИЭМ - иммуноэлектронная микроскопия ИЭФ - иммуноэлектрофорез ЛПС - липополисахарид МКАТ - моноклональные антитела МПА - мясопептонный агар МПБ - мясопептонный бульон

МПК - минимальная подавляющая концентрация НК - нуклеиновая кислота ООИ - особо опасная инфекция

2

ОРА – ориентировочная реакция агглютинации на стекле ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция ОРЗ - острое респираторное заболевание ПВ - пептонная вода ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации РГА - реакция гемагглютинации РИА - радиоиммунный анализ

РИФ - реакция иммунофлюоресценции РН - реакция нейтрализации

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации РП - реакция преципитации РСК — реакция связывания комплемента

РТГА — реакция торможения гемагглютинации СПИД— синдром приобретенного иммунодефицита ЦПД — цитопатическое действие

CTL — цитотоксические лимфоциты spp. - виды (species)

1.Микробиологические методы исследования. Основы клинической микробиологии. Возбудители гнойно-воспалительных и раневых аэробных инфекций. Патогенные

2.Возбудители раневой анаэробной инфекции: анаэробной газовой инфекции, столб-

няка. Бактероиды…………………………………………………………………... 21

3.Возбудители бактериальных зоонозных инфекций: чумы, туляремии, сибирской язвы……………………………………………………………………………………….. 28

4.Возбудители бактериальных зоонозных инфекций: бруцеллеза, лептоспироза, бор-

6.Микробиология бактериальных кишечных инфекций: патогенные кишечные палочки, иерсинии, кампилобактерии, геликобактерии…………………………………. 59

7.Микробиология бактериальных кишечных инфекций: возбудители дизентерии, хо-

13.Общая вирусология: диагностика вирусных инфекций. Вирусологический метод исследования. индикация и идентификация вирусов. Серологический метод диаг-

3

4

ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Тема 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ОСНОВЫ

КЛИНИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ. ВОЗБУДИТЕЛИ ГНОЙНОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И РАНЕВЫХ АЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ. ПАТОГЕННЫЕ КОККИ: СТАФИЛОКОККИ, СТРЕПТОКОККИ, УСЛОВНО-ПАТОГЕННАЯ МИКРОФЛОРА.

Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей раневой и гнойной инфекции, методов лабораторной диагностики, профилактики и лечения гнойновоспалительных и раневых инфекций.

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1.Цели, задачи и методы клинической микробиологии

2.Проблема госпитальной раневой и гнойной инфекции (характеристика микроорганизмов, вызывающих госпитальную инфекцию, пути передачи, профилактика).

3.Стафилококки. Таксономия. Биологические свойства. Характеристика токсинов и ферментов патогенности. Патогенез стафилококковых инфекций, их роль в развитии госпитальных инфекций. Особенности иммунитета. Методы микробиологической диагностики стафилококковых инфекций. Препараты для специфической профилактики и терапии.

4.Стрептококки. Таксономия. Биологические свойства. Характеристика токсинов и ферментов патогенности. Патогенез стрептококковых инфекций. Особенности иммунитета. Методы микробиологической диагностики стрептококковых заболеваний.

5.Этиологическая и патогенетическая роль стрептококков группы А при респираторных инфекциях, рожистом воспалении, ангине, скарлатине, остром гломерулонефрите, ревматизме, стоматологических заболеваниях, сепсисе и др.

6.Условно-патогенные грамотрицательные бактерии – возбудители раневых и гнойных инфекций, их биологическая характеристика.

7.К лебси еллы . Их роль в патологии. Характеристика клебсиелл пневмонии, озены, риносклеромы. Микробиологическая диагностика. Проблема специфической профилактики. Этиотропная терапия.

8.Прот еи . Виды. Этиологическая и патогенетическая роль протея при гнойных и смешанных инфекциях, при пищевой токсикоинфекции. Роль во внутрибольничных инфекциях. Микробиологическая диагностика.

9.Псевдомонады. Таксономия. Экология. Резистентность. Синегнойная палочка. Биологические свойства. Факторы патогенности. Патогенность для человека. Роль в возникновении внутрибольничных инфекций. Микробиологическая диагностика. Этиотропная терапия.

Ознакомление с правилами взятия материала для микробиологического исследования

1. Материал для исследования берут с соблюдением правил асептики (стерильные инструменты, посуда и т.д.) в ранние сроки инфекции, желательно до начала антимикробной терапии, не допуская, с одной стороны, попадание в него антисептических, дезинфицирующих средств и микроорганизмов внешней среды, а с другой стороны – заражения материалом окружающих лиц и загрязнения предметов окружающей среды. Взятый от больного материал помещают в герметичную посуду, а затем в специальные биксы, металлические пеналы или контейнеры (подвергающиеся затем дезинфекции) и в кратчайшие сроки доставляют в лабораторию. Разрешается непродолжительное хранение исследуемого материала в холодильнике при температуре 40 С или в термостате при температуре 370 С в зависимости от терморезистентности микроорганизма. В ряде случаев отбор материала осуществляется в специальные транспортные среды, жизнеспособность возбудителя в которых поддерживается в результате создания оптимальных условий (влажность, рН, наличие питательных веществ и т.д.). При анаэробной инфекции материал помещают в бескислородные условия (применение сред для анаэробов, емкостей с бескислородной газовой атмосферой). Направление на микробиологическое

5

исследование пишется на специальном бланке, в котором указываются фамилия, имя, отчество больного, возраст, вид материала, дата взятия, предполагаемый клинический диагноз и другие сведения.

2.Кровь для серологического исследования (5-6 мл) у больного берут натощак из локтевой вены с соблюдением правил асептики. Пробирку с кровью помещают в термостат на 30—60 мин, образовавшийся кровяной сгусток отделяют от стенки стерильной стеклянной палочкой и оставляют в холодильнике на 18—20 ч. Отстоявшуюся сыворотку сливают в стерильную пробирку. Сыворотка не должна быть гемолизированной или содержать примесь эритроцитов и

может храниться в стерильных условиях в холодильнике до 1 мес. Длительное хранение осуществляется при температуре от -20 до –700 С или же сыворотки подвергают лиофильной сушке (высушивание в вакууме при низких температурах).

3.Все остатки инфекционного материала уничтожают путем автоклавирования.

Более подробная информация о правилах взятия и доставки биологических материалов для микробиологических исследований представлена в приложении.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Методы обнаружения возбудителя инфекции в материале от больного

Для обнаружения возбудителя в материале от больного применяют следующие методы:

-микроскопические (бактериоскопические, микоскопические, вирусоскопические, направленные соответственно на выявление в исследуемом материале от больного бактерий, грибов, вирусов);

-микробиологические (бактериологические, микологические, вирусологические), предполагающие выделение чистой культуры микроорганизма;

-биологические (биопробы).

Микроскопические методы используют для обнаружения возбудителей (бактерий, грибов, простейших, вирусов) в окрашенных мазках или в нативных препаратах из исследуемого материала с помощью световой микроскопии. Достоинства этого метода состоят в быстроте, простоте и невысокой стоимости, недостатки - в невозможности определения вида микроорганизмов и невысокой чувствительности (не менее 106 микробных клеток в 1 мл или 1 г исследуемого материала).

Микроскопический метод имеет, как правило, ориентировочное значение. При некоторых инфекциях (например, при гонорее, микозах и заболеваниях, вызванных простейшими) диагностическая ценность микроскопического исследования высокая, являясь основанием для постановки окончательного диагноза заболевания.

Вирусоскопические исследования имеют ограничения, связанные с необходимостью использования дорогостоящего прибора - электронного микроскопа. Для диагностики вирусных инфекций могут применяться цитологические методы, выявляющие внутриклеточные включения в зараженных клетках (например, телец Бабеша-Негри при бешенстве, телец Пашена и Гварниери при оспе или цитомегалических клеток при заболеваниях, вызванных цитомегаловирусом).

Микробиологические методы основаны на выделении чистой культуры возбудителя из материала, полученного от больного, с ее последующей идентификацией до уровня вида на основании изучения биологических свойств микроорганизма, а в последнее время по данным методов генодиагностики (гибридизация ДНК, ПЦР). Микробиологические методы отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, являясь «золотым» стандартом при диагностике многих инфекций. Располагая чистой культурой возбудителя, можно определить факторы вирулентности и чувствительность к антибиотикам, что необходимо для рационального выбора этиотропной терапии. Ограничения микробиологического метода могут быть связаны с низкой скоростью размножения возбудителей, требовательностью к условиям культивирования (состав питательных сред, необходимость создания особых условий в зависимости от типа дыхания микроорганизма т.д.), а порой – невозможностью культивирования микроорганизма в искусственных условиях.

6

Для эпидемиологического анализа вспышек инфекционных заболеваний проводят типирование культур возбудителей, выделенных от разных больных и носителей патогенных микробов, а также из внешних объектов, являющихся возможными источниками инфицирования (вода, пищевые продукты и т.д.) с целью определения их биовара, хемовара, серовара, фаговара и т.д.

Микологические исследования с целью выделения чистых культур грибов выполняются при диагностике ряда микозов (кандидозы, глубокие микозы и т.д.).

Вирусологический метод является «золотым» стандартом в диагностике многих вирусных инфекций, однако является достаточно трудоемким, что связано с особенностями хранения, транспортировки и обработки исследуемого материала, использованием культур клеток, сложностью и длительностью культивирования ряда вирусов. Идентификацию выделенного вируса осуществляют, как правило, иммунологическими методами на основании изучения антигенной структуры, а также с помощью биохимических и молекулярно-биологических методов (ПЦР, гибридизация НК, и др.).

Биологические методы (биопробы) направлены на выделение микроорганизма или на обнаружение его токсинов путем заражения чувствительных лабораторных животных материалом, полученным от больного. Этот метод используют для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда микроорганизмы не растут или плохо культивируются на питательных средах, для дифференциации патогенных микробов или для определения их вирулентности. В настоящее время применение биопроб ограничено из-за соображений гуманности, финансовых трудностей, существованием повышенного риска заражения персонала лаборатории и в ряде случаев – длительностью выполнения биопробы, а также неспособностью современных штаммов микроорганизмов воспроизводить типичную инфекцию у чувствительного лабораторного животного. Наиболее часто биопробу применяют для выделения чистых культур возбудителей зоонозных инфекций (например, туляремии), а также для обнаружения ботулинистического токсина.

Иммунохимические методы диагностики возбудителя или его антигенов в материале от больного

Метод иммунофлюоресценции (ИФ) позволяет обнаружить в материале от больного или в зараженных вирусом клетках антигены бактерий и вирусов с помощью специфических антител, меченных флюорохромами.

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). Сущность метода заключается в том, что исследуемый материал, содержащий вирусы, обрабатывают специфическими антителами, образовавшиеся иммунные комплексы осаждают высокоскоростным центрифугированием, а затем вирусы в составе иммунных комплексов выявляют с помощью электронной микроскопии. ИЭМ позволяет значительно повысить чувствительность и специфичность вирусоскопического метода. Разработаны твердофазные методы ИЭМ, сущность которых состоит в предварительной фиксации специфических антител (немеченных или меченных частицами золота) на сетках для электронной микроскопии с последующей обработкой сеток исследуемым вируссодержащим материалом и выявлением связанных антителами вирионов с помощью электронной микроскопии.

Другие серологические реакции (РИФ, ИФА, РИА, РНГА, РП) также могут применяться для обнаружения антигенов бактерий и вирусов в материалах от больного.

Биохимические и молекулярно-биологические методы диагностики Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) используют для обнаружения продуктов

метаболизма микроорганизмов (летучих жирных кислот, спиртов, нелетучих органических кислот и т.д.) в исследуемом материале.

Методы генодиагностики. Специфические фрагменты нуклеиновых кислот (НК) различных возбудителей можно обнаружить в исследуемом материале от больного с помощью методов гибридизации нуклеиновых кислот (ДНК-зондов) или чаще - ПЦР, которая широко используется как высокочувствительный экспресс-метод для постановки предварительного диагноза при различных инфекциях. Ограничения ПЦР могут быть обусловлены высокой измен-

7

чивостью НК некоторых микроорганизмов, а также неадекватным подбором праймеров для реакции, что обеспечивает ложноотрицательные результаты, или же загрязнением реакционной смеси микроорганизмами или фрагментами их НК, приводя к возникновению ложноположительных реакций.

Серодиагностика и аллергодиагностика

Серодиагностика (serum – сыворотка). Метод основан на обнаружении антител в сыворотке крови больного и определении динамики нарастания их титра в ходе заболевания. Для серодиагностики инфекционных болезней применяют различные иммунологические реакции (РА, РСК, РНГА, ИФА, ИФМ и т.д.), используя в качестве антигенов живые культуры микроорганизмов или диагностикумы (инактивированные взвеси микроорганизмов или антигены из них, полученные химическим путем).

Серологические исследования проводят также для эпидемиологического анализа инфекционной заболеваемости (определение специфических антител у здоровых лиц, свидетельствующее о перенесении ими инфекции или о контакте с соответствующим возбудителем), а также для определения уровня специфических антител с целью оценки эффективности вакцинопрофилактики.

При серологических исследованиях учитывается диагностический титр выявленных антител (максимальное разведение исследуемой сыворотки, дающее положительный результат). Наиболее информативными являются серологические исследования парных сывороток крови больного, взятых в начале болезни и через разные промежутки времени в процессе ее развития. Диагностическое значение имеет нарастание титра в 4 раза и более.

Методы серодиагностики отличаются высокой специфичностью и чувствительностью. В последние годы широкое распространение получил метод ИФА.

Серологические реакции, несмотря на ряд достоинств, имеют некоторые ограничения, связанные с возможностью возникновения ложноотрицательных и ложноположительных реакций. Ложноотрицательные реакции могут появляться в результате нейтрализации антител избытком микроба или его антигенов в организме больного, а также в результате неоптимальных соотношений антигенов и антител при постановке реакции. Ложноположительные (псевдоиммунологические) реакции могут возникать при использовании гемолизированной или загрязненной микроорганизмами сыворотки крови, при нарушениях соотношения альбуминов и глобулинов, являться результатом перекрестных иммунологических реакций. Ложноположительные реакции могут появляться у беременных женщин, наркоманов, больных тяжелыми хроническими болезнями (красная волчанка, ревматоидный артрит, хронические гепатиты и т.д.) и инфекциями (бруцеллез и др.)

Аллергодиагностика. Наиболее часто при диагностике ряда инфекционных заболеваний (туберкулез, бруцеллез, туляремия и др.) ставят внутрикожные аллергические пробы для выявления гиперчувствительности замедленного типа к аллергенам микробов. Могут использоваться также методы аллергодиагностики in vitro, позволяющие оценить состояние специфической сенсибилизации лейкоцитов крови в отношении определенного антигена, например, реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), реакция лейкоцитолиза (повреждения нейтрофилов) в присутствии специфического микробного антигена.

Оценка результатов клинико-диагностических микробиологических исследований

Обнаружение патогенных микроорганизмов, являющихся возбудителями заболеваний имеет решающее значение для постановки диагноза.

Инфекционный процесс способны вызвать также на фоне иммунной недостаточности (действие радиации, цитостатиков, сахарный диабет, СПИД и другие инфекции, первичные иммунодефициты и др.) условно-патогенные (оппортунистические) микроорганизмы, представляющие обширную группу аэробных и анаэробных бактерий, грибов, простейших. Эти микроорганизмы широко распространены во внешней среде, в организме человека и животных. Наибольшую роль в патологии человека играют условно-патогенные микроорганизмы родов

Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Citrobacter,

8

Serratia, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Veillonella, Vibrio, Peptococcus, Peptostreptococcus, Mycobacterium, Mycoplasma, Candida и др. У здорового человека эти мик-

роорганизмы заболеваний не вызывают. Поэтому констатация этиологической роли условнопатогенных микроорганизмов в патологии человека должна основываться на следующих критериях:

1.Условно-патогенные микроорганизмы выделяются из жидкостей организма (кровь, спинномозговая жидкость и др.), которые у здоровых людей являются стерильными.

2.Количество условно-патогенных микроорганизмов в исследуемом материале достаточно высоко, при этом многократное исследование больного в динамике процесса показывает повторное выделение одного и того же вида условно-патогенного микроорганизма из одного и того же материала. Нередко одни и те же виды условно-патогенных микробов высеваются из разных образцов материала.

3.При серологическом исследовании парных сывороток крови больного констатируют нарастание титра антител в 4 раза и более к определенному условно-патогенному микроорганизму, а также появление положительных кожных аллергических реакций у больных с аллергенами из условно-патогенных микроорганизмов.

4.При внутрибольничных (госпитальных или нозокомиальных) инфекциях условнопатогенные микроорганизмы одного и того же вида выделяются от группы больных, а также либо от бактерионосителей, либо из внешней среды или предметов обихода.

5.Наблюдается совпадение данных лабораторного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам с эффективностью антимикробной терапии.

Результаты микробиологических исследований оформляют на специальных бланках, в которых указывают вид патогенных или условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при микробиологическом исследовании, а также результаты определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

ВОЗБУДИТЕЛИ РАНЕВЫХ И ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ

Гнойно-воспалительные и раневые инфекции относятся к распространенным инфекциям, встречаясь практически во всех отраслях медицины, но наиболее часто – в хирургической и акушерско-гинекологической практике, в дерматовенерологии, оториноларингологии, стоматологии и т.д.. Нередко эти инфекции приобретают характер внутрибольничных или госпитальных инфекций. Особенно тяжело протекают гнойно-воспалительные процессы у детей. Возбудителями указанных инфекций являются многочисленные разнообразные микроорганизмы

(табл. 1).

Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций

Методы микробиологической диагностики стафилококковых заболеваний отражены в схеме 1. Выполняется следующий комплекс методов исследования.

Бактериоскопический метод – микроскопия мазков из материала от больного, окрашенных по Граму. Выявление в мазках кокков, располагающихся небольшими группами по 2-3 бактерии; типичное расположение в виде гроздьев винограда характерно для чистых культур стафилококка (рис. 1 – цветная вкладка).

Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают на чашки с желточносолевым (ЖСА) и кровяным МПА, инкубируют при 370С сутки. На 2 день учитывают характер роста колоний на обеих средах. На желточно-солевом агаре колонии стафилококка имеют ровные края, гладкую поверхность, вокруг колонии образуется радужный венчик в результате расщепления лецитина яичного желтка ферментом лецитовителлазой; цвет пигмента колоний варьирует от золотистого до белого. На кровяном МПА вокруг колоний образуются зоны гемолиза. Из типичных для стафилококка колоний делают мазок, окрашивают его по Граму, микроскопируют. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. На 3 день проводят идентификацию выделенной культуры стафилококка с дифференциацией основных видов в соответствии с таблицей 2, определяют чувствительность

кантибиотикам методом бумажных дисков и фаговар (набор для фаготипирования состоит из

9

фагов 21 типа, разделенных на 4 группы; при внутрибольничных инфекциях наиболее часто встречаются фаговары 77 и 80).

Таблица 1. Этиология бактериальных раневых и гнойно-воспалительных инфекций

10