Таблица 2.5. Простой способ установки темнопольного освещения для небольших увеличений (и освещение по Рейнбергу)

1.Установите освещение по Кёлеру и рассмотрите препарат, содержащий значительное количество дискретных видимых объектов (например, препарат диатомовых водорослей).

2.Запомните, что вы установили апертурную диафрагму так, чтобы з. ф. п. вашего объектива освещалась на 66%. Осмотрите диафрагму конденсора и измерьте ее диаметр.

3.Изготовьте из прозрачного материала диск диаметром, равным отверстию для фильтров в вашем конденсоре. Поместите на центр диска непрозрачный кружок такого же или несколько большего размера, чем апертура открытия диафрагмы конденсора.

4.Поместите собранный диск в оправу для фильтров конденсора и установите конденсор как можно ближе к препарату.

5.Вновь рассматривая препарат, вы, вероятно, увидите, что практически все стало черным! Слегка сместите фокус конденсора вверх и слегка приоткройте диафрагму конденсора. Этого окажется достаточно для того, чтобы появились ярко светящиеся точки на минимально освещенном фоне. Это и будет обратный контраст.

Как показано на рис. 1.5, этот эффект может быть легко достигнут путем удаления нулевого порядка дифракции в з„ ф. п. с помощью непрозрачного экрана. Можно воспользоваться другим приемом. На заднюю поверхность объектива малого увеличения помещают круглое покровное стекло с имеющейся на нем небольшой бляшкой. Апертуру освещения уменьшают так, чтобы она соответствовала центральному пятну. В лаборатории автора это достигалось при использовании роговицы бабочки в качестве препарата и объектива Мак Кроуна (МсСrоnе) с дисперсионной окраской. Конденсор микроскопа лучше при этом удалить и задавать апертуру падающего пучка непосредственно полевой диафрагмой, закрывая которую можно получить очень тонкий пучок света. Такой пучок легко перекрывается бляшкой, находящейся в з. ф. п. объектива. При наблюдении в светлом поле (без бляшки) видна картина типа сетки из темных проволочек, создаваемая за счет поглощения света, а если ввести бляшку, то «проволочки» становятся светлыми на темном фоне. Новое изображение создается исключительно за счет рассеянного света и не содержит .лучей нулевого порядка.

Однако обычно темнопольные условия наблюдения достигаются за счет того, что полностью перекрывается доступ в объектив для прямого света. Этот способ лучше, чем описанное выше использование темной бляшки в з. ф. п. объектива. В табл. 2.5 приведен метод изготовления бляшки для конденсора, позволяющей получить темное поле для малых увеличений.

Весьма полезно иметь набор таких бляшек для конденсора (их изготовление сравнительно дешево) в наборе к микроскопу. Они дают быстрый и хороший эффект темного поля для различных объективов с малым увеличением. Для работы при большом увеличении необходимы специальные конденсоры и может понадобиться иммерсия, что подробно описано в разд. 4.2.

4.1. Освещение по Рейнбергу

Бляшка для простейшего метода получения темного поля, «писанного в табл. 2.5, может быть сделана из прозрачного окрашенного материала. Часто для сравнения используются дополнительные цвета центральной зоны и периферии. Например, голубая бляшка и желтое поле или зеленая бляшка и красное поле. Легко показать, что при указанных комбинациях цвет препарата будет дополнительным к цвету фона. Препарат приобретает цвет, соответствующий тому, который он рассеивал, тогда как фон сохраняет цвет центральной бляшки.

Неокрашенные живые объекты будут хорошо видны при использовании либо темного поля, либо освещения по Рейнбергу, которые дают интересный контраст.

4.2. Темнопольные конденсоры высокого разрешения

Универсальные конденсоры имеют в своем составе гнездо для установки темного поля, и в большинстве лабораторий имеются темнопольные конденсоры различной степени сложности.

Некоторые из сухих темнопольных конденсоров, например те, которые имеются в микроскопах серии Ortholux (Leitz), очень просты в обращении. После установки освещения по Кёлеру для светлого поля конденсор удаляют и заменяют на темнопольный, который устанавливается вплотную к предметному столику. Другие фирмы также выпускают конденсоры, которые устанавливаются на место светлопольных, однако большинство конденсоров темного поля высокого разрешения требуют использования иммерсии, наносимой на нижнюю часть предметного стекла. Методика их использования приведена в табл. 2.6.

4.2.1. Демонстрация темного или флуоресцирующего кубика

Если у вас есть универсальный конденсор или набор отдельных конденсоров, которые могут быть использованы с иммерсией, тогда для вас полезно проделать упражнения, указанные в табл. 2.7, и посмотреть, что дает каждое из них.

25

Таблица 2.6. Последовательность шагов для установки темного поля в случае светосильного объектива (рис. 2.2)

1.Установите препарат (например, одиночную диатомовую водоросль) в светлом поле таким образом, чтобы, пользуясь координатами столика или иными метками, вы могли найти его в дальнейшем.

2.Поместите каплю масла на нижнюю поверхность предметного стекла и одновременно на вершину конденсора и аккуратно установите препарат на столике так, чтобы два мениска масла соприкоснулись и слились друг с другом без пузырьков.

3.Установите препарат на нужное место, насколько это возможно,

4.У объективов с очень большой апертурой в з. ф. п. имеется диафрагма, которую следует полностью открыть. Это позволит получить условия светлого поля и поможет вам в дальнейшем искать препарат. Такие объективы специально маркированы и их следует использовать с масляной иммерсией.

Таблица 2.7. Конус света, выходящего из конденсора в рассеивающем кубе

1.Нанесите каплю масла на полированную поверхность рассеивающего куба или флуоресцирующего перспекса. Одновременно нанесите капельку масла на вершину линзы конденсора. Поместите кубик на столик и приведите его в контакт с маслом на конденсоре NB. Для того, чтобы пользоваться данным методом, надо быть уверенным в том, что при соприкосновении двух выпуклых поверхностей масляных капель все пузырьки воздуха вытолкнуты в стороны.

2.Используя установку конденсора для светлого поля, посмотрите со стороны на конус света в кубике. Его угол регулируется апертурной диафрагмой конденсора, а высота вершины конуса от поверхности конденсора — рабочим расстоянием конденсора. При установке света по Кёлеру вершина конуса оказывается внутри препарата. Помните, что при нормальной работе к конденсору добавляется толщина предметного стекла.

3.В универсальном конденсоре можно переводить отверстия для установки фазовых колец. Посмотрите на конусы света от каждого из колец. Заметьте, что все они внутри полые, но сходятся к объективу, когда он правильно установлен.

4.Установите темнопольный конденсор, и вы увидите конус с очень большим углом, тоже полый внутри, причем его угол столь велик, что выходит за пределы объектива.

Обратите внимание, что в отсутствие масла между вершиной конденсора и основанием кубика эти лучи света не попадут в кубик, поскольку они падают на него под углом, большим, чем критический угол для данного мате риала, и, следовательно, будут отражаться.

4.2.2. Значение света нулевого порядка для формирования изображения

Значение света нулевого порядка для формирования изображения демонстрируется в упражнениях, приведенных в табл. 2.8, где в качестве препарата предлагается использовать диатомовую водоросль Pleurosigma angulatum. Вид Е. ф. п. объектива при темнопольной микроскопии с данным препаратом интересен сам по себе (рис. 2.2), а также помогает лучше понять принцип метода.

Таблица 2.8. Формирование изображения при темнопольной микроскопии

1.В ситуации, которую вы получили на этапе 5, табл. 2.6, рассмотрите з. ф. п. объектива с помощью вспомогательного телескопа для установки фазового контраста.

2.Откройте диафрагму объектива и вы увидите свет нулевого порядка в виде яркого кольца вокруг наружного края з. ф. п. (рис. 2.2, Б).

3.Закройте вновь диафрагму так, чтобы она не пропускала свет нулевого порядка, не давая ему таким образом участвовать в формировании изображения (рис. 2.2, Г).

4.Сравните картины, получающиеся в з. ф. п. при различных положениях диафрагмы, с изменениями в контрасте изображения. В тот момент, когда вы перекрываете свет нулевого порядка, происходит реверсия контраста (сравните рис. 2.2, Б и Л).

5.В тех случаях, когда препарат обладает периодичностью, как, например, диатомовая водоросль P. angulatum, дифрагированный свет первого порядка будет виден в центре з. ф. п. в виде окрашенных пересекающихся полукружий. Порядок симметрии перекрестья и степень ровности освещения по периферии ярким светом нулевого порядка являются мерой правильности центровки микроскопа и совпадения в нем оптических осей конденсора и объектива. Если вы видите асимметрию в одном из этих аспектов, то вернитесь к юстировке конденсора с помощью центровочных винтов.

26