2.5. Типичные применения и ограничения метода

2.5.1. Светлопольная микроскопия

I. Преимущества. При использовании низких концентраций красителей уменьшается вероятность их токсического действия. Низкий контраст, обусловленный малой концентрацией естественных хромофоров или специальных прижизненных (витальных) красителей, может быть значительно усилен. Контраст можно повысить, если проводить наблюдения при той длине волны, где поглощение максимально. Используя подходящие камеры с кварцевыми окнами, можно осуществлять микроскопию в УФ-свете и получать с ее помощью высокое разрешение и высококонтрастные изображения [21].

Важным инструментом исследования в иммуноцитохимии на электронно-микроскопическом уровне является коллоидное золото, особенно конъюгированное с антителами [22]. Частицы коллоидного золота диаметром до 10 нм могут также быть обнаружены и локализованы с точностью до 200 нм с помощью VECмикроскопии. Различные по размерам частицы коллоидного золота будут иметь в изображении одинаковый размер (0,1—0,2 мкм в зависимости от фокуса), но окажутся с разными уровнями серого, так что с помощью псевдоцветного преобразования изображения их можно будет разделить на классы по размерам. Таким образом, становится осуществимым двойное мечение различными по размерам частицами коллоидного золота

(разд. 2.5.7).

II. Проблемы, возникающие при усилении светлопольного изображения. Фазовые объекты, когда они находятся в фокусе, имеют минимальный контраст и создают противоположный контраст в положениях выше и ниже фокуса. Однако часто бывает очень трудно сохранить такое расфокусированное изображение (изображение крапа), в формирование которого не вносил бы никакого вклада препарат. Это обстоятельство ограничивает использование аналогового усиления в светлопольной микроскопии.

2.5.2. Темнопольная микроскопия

I. Преимущества. Темнопольные изображения имеют очень высокий контраст, и он может быть еще увеличен путем усиления видеосигнала телекамеры. Истинный рассеянный свет от близко расположенных или находящихся не в фокусе рассеивающих объектов может быть частично удален путем приложения напряжения смещения, что позволяет повысить контраст и улучшить условия наблюдения объектов, дающих слабое изображение по сравнению с крупными объектами. Следует отметить, что темнопольные изображения могут быть обработаны и с помощью микроскопии с видеоусилением. П. Недостатки. Препарат должен быть тонким и содержать «сравнительно мало светорассеивающих деталей. Наиболее неприятно, что светорассеивающие структуры, которые находятся вне фокуса, не дают истинного рассеянного света, поскольку рассеянный свет от них распределяется по изображению неравномерно. Поскольку при темнопольной микроскопии в проходящем свете числовая апертура объектива не должна быть больше, чем 1,1, то метод темного поля не является методом очень высокого разрешения. Тем не менее он позволяет обнаружить в тонких препаратах наличие структур с размерами порядка нанометров. При эпиосвещении, однако, данный метод позволяет работать с максимальной NA и с максимальным разрешением.

2.5.3. Косое (анаксиальное) освещение

Косое (анаксиальное) освещение осуществляется несколькими способами, основанными на том, что апертура конденсора освещается неравномерно с целью получения дифференциального (отбрасывающего тень) изображения. Такое освещение обычно достигается за счет удаления в большей или меньшей степени недифрагированных лучей.

В оригинальном методе, который предложил Аббе, ирисовая диафрагма сдвигается к краю передней фокальной плоскости конденсора. В методе модуляции контраста по Хоффману [23] (Modulation Optics Inc.) недифрагированный свет частично удаляется трехзонной пластинкой, которая служит также для выделения высокоповторяющихся пространственных последовательностей. Дополнительный вращающийся поляризатор дает возможность изменять эксцентриситет прямого (недифрагированного) света. Очень хорошие результаты дает техника «одностороннего» освещения, разработанная Эллисом [24], в сочетании с видеомикроскопией. Можно также, используя вольфрамовую лампу и полусферическое зеркало, поместить зеркало так, чтобы освещалась только половина апертурной диафрагмы [19]. В случае микроскопии с видеоусилением контраста данные методы работают очень хорошо, поскольку их основной недостаток — низкую интенсивность изображений — можно преодолеть с помощью усиления.

I. Преимущества. В направленно оттененных дифференциальных изображениях (которые напоминают изображения, получающиеся при дифференциальном интерференционном контрасте по Номарскому) можно видеть детали, создающие фазовый эффект. Наблюдению не мешает, как при DIC-микроскопии сильное двулучепреломление препарата. Так, например, аксоны позвоночных лучше исследовать при косом освещении с усилением, нежели с помощью дифференциального интерференционного контраста, поскольку сильно двулучепреломляющие слои миелина создают при DIC-микроскопии избыточный контраст. Для данного метода не требуется дорогостоящего оборудования — нужен только светлопольный микроскоп. Сообщалось, что данный метод в отличие от DIC-микроскопии позволяет получать удовлетворительные изображения глубоко расположенных слоев ткани [19]. В принципе косое освещение не уменьшает рабочей апертуры или

170

разрешения до тех пор, пока освещается не менее половины диаметра входного зрачка системы.

II. Недостатки. Микроскопия при косом освещении иногда менее чувствительна, чем DIC-микроскопия по Номарскому, и получающееся изображение может обладать некоторой анизотропией (относительно тестовых изображений [25]). Оптические срезы получаются более толстыми и менее четкими.

2.5.4. Фазовый контраст

Фазовый контраст является хорошим методом для наблюдения очень тонких препаратов и очень мелких фазовых объектов, в особенности живых клеток. Видеоусиление контраста при достаточном аналоговом усилении часто дает ценные результаты, особенно для тонких препаратов.

Недостатки. При наблюдении в фазовом контрасте нельзя получить оптических сечений толстых препаратов, поскольку изображение в каждой плоскости имеет ложный контраст, создаваемый деталями, лежащими в других плоскостях препарата, а также из-за наличия гало вокруг деталей, дающих фазовый сдвиг. В результате усиления резко увеличивается неоднородность фона. Иногда неравномерный фон можно вычесть, взяв для этой цели изображение плоскости, находящейся примерно на 0,25 мкм выше или ниже интересующей вас, на участке, свободном от препарата. В большинстве случаев изображения крапа в расфокусированной части препарата не могут быть получены без того, чтобы в них частично не содержалось изображение расфокусированного препарата. Даже очень тщательной очистки проекционной оптики обычно недостаточно для удаления всего мешающего крапа.

2.5.5. Поляризационная микроскопия

Для визуального наблюдения большинства биологических объектов, которые дают небольшую задержку смещения луча, микроскоп, снабженный простыми поляризаторами, не подходит. Изображение заполняется рассеянным светом, возникающим из-за деполяризации света на поверхностях линз и двулучепреломления в одном или более оптических элементах. Последнее возникает из-за имеющихся в них внутренних напряжений

(табл. 8.1).

Для тонкого выявления или фотомикрографии двулучепреломляющих структур как правило лучше использовать поляризационный микроскоп с оптическим выпрямителем (Nikon), в котором удаляется не только рассеянный свет, возникающий из-за деполяризации на поверхностях линз, но также аномалии в дифракционной картине, которые могут приводить к ухудшению контраста и разрешения [26]. Оптический выпрямитель состоит из менисковой линзы с нулевой оптической силой и правильно ориентированной полуволновой пластинки [2, 16].

Используя поляризационную микроскопию с видеоусилением можно производить сравнительно тонкие наблюдения с помощью простого поляризационного микроскопа, даже если его объективы имеют небольшое внутреннее напряжение. В большинстве случаев светлопольный микроскоп можно превратить в эквивалент видеомикроскопа со сравнительно высоким светопоглощением, применив недорогие пленочные поляризаторы (например, пленку Polaroid HN 22 фирмы Polaroid Inc., которая поставляется в виде листов и может быть разрезана любым удобным способом). Аналогично тому, что говорилось об AVEC-DIC-микроскопии (разд. 2.1 и рис. 8.10), при установке смещения запаздывания на величину 1/9 /„ (AVEC-POL-микроскопия) аномальная дифракция в виде клеверного листа, которая видна при скрещенных поляризаторах и нулевом сдвиге, заменяется на нормальную картину, в результате чего наблюдениям больше не мешает ухудшение разрешения или контраста. Кроме того, аномалии дифракции, возникающие вследствие слабого внутреннего двулучепреломления в оптических компонентах микроскопа, также пропадают [3, 4].

Применение в поляризационной микроскопии оптических элементов наивысшего качества и видеоусиления (AVEC-POL и IVEC-POL, разд. 2.1) позволяет наблюдать объекты с исключительно малым двулучепреломлением, например отдельные микротрубочки, жгутики бактерий и т. д. [2, 25].

2.5.6. Микроскопия с использованием дифференциального интерференционного контраста

1. Преимущества. Данный метод в большинстве случаев лучше всего подходит для видеоусиления. Микроскопия по Номарскому дает сфокусированные, высококонтрастные изображения с направленным оттенением фазовых деталей, где направление тени противоположно для элементов, сдвигающих фазу вперед я назад [26]. При больших рабочих апертурах область контраста ограничивается очень небольшой глубиной поля зрения, так что данный метод уникален тем, что он позволяет получать высококонтрастные оптические срезы толщиной всего 200— 300 нм. С его помощью может быть получен также амплитудный контраст [26]. В сочетании с AVECили IVEC-методами DIC-микроскопия позволяет достичь настолько большой чувствительности, что при наилучшей настройке становятся видимыми фазовые объекты с размерами до 15 нм.

Увеличение смещения запаздывания света (рис. 8.10) вызывает непропорциональное увеличение контраста, возникающее вследствие малого сдвига фазы, по сравнению с контрастом, обусловленным большим сдвигом фазы. Например, если малоконтрастные структуры, участвующие в цитоплазматическом транспорте, маскируются яркими органеллами, скажем крахмальными зернами, то контраст последних может быть уменьшен за счет использования более слабого источника света и приближения величины смещения запаздывания к 1/4А, (рис. 8.10). П. Недостатки. Единственным недостатком данного метода является, вероятно, то, что контраст некоторых объектов с сильным двулучепреломлением (например,

171

поперечнополосатых мышц или миелиновых нервных волокон), возникающий в результате отражения, может маскироваться контрастом, возникающим в результате собственно двулучепреломления. В этом случае может помочь косое освещение. Поскольку изображение контрастируется (оттеняется) в определенном направлении, препарат следует поместить на вращающийся столик и исследовать в нескольких положениях, чтобы не пропустить линейных структур, которые могут оказаться расположенными параллельно направлению сдвига

(рис. 8.11).

2.5.7. Отражательная контрастная микроскопия

Интерференция света, отраженного от различных поверхностей при эпиосвещении препаратов, используется для визуализации зон прикрепления клеток к стеклу [27, 28]. Для того чтобы уменьшить нежелательный рассеянный свет, возникающий вследствие отражения от оптических элементов, Плоэм (Ploem) предложил использовать линзы с противобликовым покрытием, которые применяются при микроскопии в металлургии и имеют на передней поверхности объектива четвертьволновую пластинку. В сочетании с видеоусилением простая микроскопия в отраженном свете с эпиосвещением (то есть без использования поляризующих элементов или линз с противобликовым покрытием) может оказаться полезной в следующих целях:

1)для улучшения наблюдения зон прикрепления клеток к стеклу (интерференция отраженного от поверхности света при больших апертурах освещения);

2)для улучшения условий наблюдения интерференционных колец, оконтуривающих структуры, и определения по ним размеров прикрепленных клеток или топологии клеточной поверхности на плоском стекле (интерференция отраженного от поверхности света при малых апертурах освещения);

3)для того, чтобы сделать видимыми в качестве ярких объектов коллоидное золото или другие металлы с размером частиц до 5 нм. Поляризация света при эпиосвещении еще больше улучшает видимость [29, 30].

Во всех этих случаях качество изображения может быть дополнительно улучшено за счет использования объективов с противобликовым покрытием вместе с четвертьволновой пластинкой (Zeiss) [27, 28].

2.5.8. Флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентные изображения обычно требуют усиления, особенно в тех случаях, когда освещенность поддерживается на низком уровне, чтобы уменьшить выцветание. Слабое флуоресцентное изображение, полученное с помощью высокоапертурных объективов, часто можно сделать более ярким за счет усиления видеосигнала в усиливающей телекамере. Рассеянный свет, возникающий вследствие аутофлуоресценции линз или заливочной среды, можно убрать подачей напряжения смещения. Однако свет, исходящий из флуоресцирующих структур, расположенных вне фокуса, не может быть удален так же, как рассеянный свет, поскольку он распределен неравномерно. Часто флуоресцирующие детали лучше видны, когда телевизионный сигнал обращается (негативное изображение).

Флуоресцентные препараты обычно наблюдают с помощью видеоусиления (разд. 3), но это с неизбежностью приводит к уменьшению разрешения по сравнению с изображениями, получаемыми при том же увеличении с помощью VEC-микроскопии. Можно использовать большее оптическое увеличение, но получаемое разрешение теоретически останется тем же самым. В некоторых случаях, особенно при яркой флуоресценции, можно попробовать применить высокочувствительные камеры с высоким разрешением (Newvicon или Ultricon) в режиме постоянного усреднения (в течение одной или более секунд). Хорошее изображение можно также получить путем накопления сигнала в течение нескольких секунд.

Поскольку при флуоресцентной микроскопии видны самосветящиеся предметы, то в формировании изображения значительную роль играют объекты, находящиеся вне фокуса. Однако, если цифровым способом удалить фон, глубину резкости можно ограничить величиной примерно 1 мкм [31]. Этот довольно сложный метод в настоящее время заменяется конфокальной микроскопией [32] (Bio Rad Lasersharp Ltd, Heidelberg Instruments GmbH, Tracor Northern и Zeiss). О конфокальных микроскопах уже упоминалось в гл. 6.

2.5.9. Примеры применения в биологии и биохимии

Для AVEC-микроскопии в дифференциальном интерференционном контрасте наиболее пригодны препараты, которые не содержат окрашенного материала, а также объектов, обладающих высоким контрастом. Наилучшими являются препараты объектов с исключительно низким контрастом или даже невидимые при обычной микроскопии. К ним относятся, например мицеллы, липосомы, структуры, окруженные одиночной или двойной мембраной, коллоидные растворы [33], активно транскрибирующиеся рибосомные гены [34], синаптические и другие мелкие цитоплазматические пузырьки [8, 9], искусственные латексные частицы диаметром 70 нм и меньше (неопубликованные наблюдения), а также элементы цитоскелета — микротрубочки [9, 25] и пучки актина [35, 36]. С помощью AVEC-DIC-микроскопии был открыт процесс скольжения микротрубочек и исследована его зависимость от АТФ, а также изучена кинетика АТФ-транслоказы. С его помощью оказалось возможным следить за событиями на молекулярном уровне, например, сборкой и разборкой микротрубочек [38]. Обзор тех возможностей, которые этот метод открывает для наблюдения на живых клетках, был опубликован Алленом [25].

Поляризационная AVEC-микроскопия позволяет также визуализировать объекты с очень слабым

172