хромосом. В то же время будут даны ссылки на некоторые специальные методы, которые могут оказаться полезными в определенных случаях.

2. Классификация сегментов хромосом

Все сегменты хромосом можно подразделить на четыре группы: гетерохроматиновые сегменты, эухроматиновые сегменты, ядрышковые организаторы и кинетохоры [1]. Их список вместе с соответствующими методами дифференциальной окраски приведен в табл. 9.1. Следует отметить, что с помощью одного метода можно выявить более одного класса сегментов: например, и гетерохроматиновые, и эухроматиновые сегменты отчетливо окрашиваются акрихином (разд. 4.4); так что Q-сегменты могут быть гетероили эухроматиновыми. Для лучшего понимания и интерпретации излагаемого дальше материала будет полезно дать краткую характеристику сегментов каждого класса.

Рис. 9.1. Плохо расправленные хромосомы человека, окруженные значительным количеством цитоплазмы. На таком препарате не получится удовлетворительной дифференциальной окраски.

Таблица 9.1. Классификация сегментов хромосом

Тип сегментов	Основные методы	Другие методы окрашивания
	окрашивания
Гетерохроматиновые	С-окраска	G11; Q-окраска; М-окраска; диста
сегменты		мицин/ДАФИ;
		иммунофлуоресценция с 5-
		метилцитозином
Эухроматиновые сегменты	G-окраска	Т-окраска; различные
	Q-окраска	флуорохромы
	R-окраска
Ядрышковые организаторы	Серебрение ядрышковых	N-окраска
	организаторов
Кинетохоры	Иммунофлуоресценция с	Cd-окраска; серебрение
	использованием сыворотки
	больных CREST-
	синдромом

2.1. Гетерохроматиновые сегменты

Гетерохроматин — это те участки хромосом, которые не деконденсируются в телофазе, а остаются конденсированными в течение всей интерфазы [2]. Этот материал обычно интенсивно окрашивается с помощью С-метода, хотя есть несколько сообщений о том, что гетерохроматиновые области хромосом не являются С-сегментами [3, 4]. Гетерохроматин, как правило, содержит высокоповторяющиеся последовательности ДНК, часто со специфическим составом нуклеотидов [1]. При других методах дифференциального окрашивания выявляются только отдельные субклассы гетерохроматиновых сегментов, часто на основе избирательного сродства красителя к ДНК с различным составом оснований. Для окраски С- методом не характерна какая-либо избирательность в отношении состава оснований ДНК, поэтому им окрашивается большинство гетерохроматиновых районов.

Гетерохроматиновые сегменты представляют собой материал, дополнительный к эухроматину, и количество гетерохроматина (а соответственно величина гетерохроматиновых сегментов) может варьировать. Данное явление, называемое полиморфизмом гетерохроматиновых сегментов, носит, по-видимому, всеобщий характер, что дает возможность иметь маркеры для определения родительской принадлежности гомологичных хромосом

191

и для характеристики различных инбредных линий лабораторных мышей. Никаких фенотипических проявлений этого полиморфизма не найдено, что согласуется с представлениями о генетической инертности гетерохроматина.

2.2. Эухроматиновые сегменты

С помощью дифференциального окрашивания G-, Q- или К-методами у высших позвоночных (рептилий, птиц, млекопитающих) можно выявить серию полос по длине хромосом — эухроматиновые сегменты. Эти сегменты имеют расположение, характерное для каждой пары хромосом и являются незаменимыми маркерами для идентификации хромосом. Сведений об эухроматиновых сегментах у других организмов в литературе очень мало, но не ясно, объясняется это различиями между высшими позвоночными и другими организмами или является следствием технических трудностей.

Таблица 9.2. Свойства эухроматиновых сегментов

G-позитивные сегменты	G-негативные сегменты
Q-позитивные сегменты	Q-негативные сегменты
R-негативные сегменты	R-позитивные сегменты
Пахитенные хромомеры	Интерхромомерные области
Ранняя конденсация	Поздняя конденсация
Поздняя репликация	Ранняя репликация
АТ-богатая ДНК	ГЦ-богатая ДНК
Тканеспецифические гены	Гены «домашнего хозяйства»
Длинные повторяющиеся	(«Housekeeping» genes)
последовательности ДНК	Короткие повторяющиеся
	последовательности ДНК

Природа эухроматиновых сегментов пока точно не установлена, однако известно много корреляций между этими сегментами и другими свойствами хромосом (табл. 9.2). Особенно существенными являются корреляции с характером репликации ДНК, распределением генов и строением пахитенных хромосом.

Эухроматиновые сегменты особенно важны для идентификации как нормальных, так и измененных хромосом и очень ценны для эволюционных исследований, поскольку позволяют идентифицировать гомологичные хромосомы у родственных видов.

2.3. Ядрышковые организаторы

Ядрышковые организаторы — это участки хромосом, содержащие повторяющиеся гены 18S и 28S рРНКОбласти ядрышковых организаторов обычно окрашиваются в препаратах хромосом при помощи серебра, причем известно, что окрашивающийся материал является белком, ассоциированным с ядрышковым организатором [5]. Интенсивность серебрения отражает не только количество рибосомных генов в данном организаторе, но и их активность. У человека окрашивается только 5—9 ядрышковых организаторов из 10 возможных; каждый индивидуум имеет характерное распределение этой окраски. Так же, как в случае гетерохроматиновых сегментов, при окрашивании ядрышковых организаторов выявляется полиморфизм, который может быть полезен для установления родительской принадлежности индивидуальных хромосом [б].

2.4. Кинетохоры

Кинетохоры являются участками прикрепления хромосом к нитям веретена, они располагаются в области первичной перетяжки, или центромеры, хромосом. Разработана методика окраски кинетохоров в стандартных хромосомных препаратах с помощью окрашивания по Гимза или серебром. Но после открытия в сыворотке больных CREST-синдромом связывающихся с кинетохорами аутоиммунных антител [7], предпочтение отдается методу выявления кинетохоров с помощью этой сыворотки и иммунофлуоресцентной техники.

3. Культивирование клеток и фиксация материала для получения хромосомных препаратов

Из-за недостатка места здесь нельзя привести все методики изготовления хромосомных препаратов. Препараты хромосом получают из столь разнообразных источников, что описать методики для всех типов препаратов невозможно. В то же время изготовление хромосомных препаратов является существенной частью процедуры дифференциального окрашивания, и без качественно приготовленных препаратов, как правило, невозможно получить хорошей сегментации. В некоторых случаях в процедуру дифференциального окрашивания входит обработка культивируемых клеток до фиксации.

192

Стандартным источником получения хромосом человека к животных являются культивируемые лимфоциты крови, Обычно порцию крови инкубируют в подходящей культуральной среде в присутствии митогена, обычно фитогемагглютинина (ФГА), который стимулирует репликацию ДНК и деление клеток. Для того, чтобы увеличить долю митотических клеток, незадолго до изготовления препарата в культуру добавляют митостатик, блокирующий клетки в метафазе. Затем клетки обрабатывают в течение нескольких минут гипотоническим раствором (обычно — 0,075 МКС1), чтобы они набухли и чтобы хромосомы диспергировались, после чего фиксируют смесью метанол — уксусная кислота (объемное отношение 3:1). Распластывание хромосом достигается путем раскапывания клеточной суспензии на стекло. Подробные протоколы можно найти у ряда авторов [8—11], типичный вариант приведен в разд. 3.1.

В случае клеток насекомых или растений чаще всего невозможно получить суспензию митотических клеток, так что препаративные методы, применяемые для этих объектов, должны резко отличаться от описанных выше. Для приготовления хромосомных препаратов из клеток насекомых [10] и растений [14] применяется метод раздавливания. Специально разработайная методика дифференциального окрашивания хромосом растений описана Шварзахером и др. [15]. В данной работе указано, какие стадии особенно важны для получения хорошей окраски. Выше уже говорилось, что сохранение остатков цитоплазмы вокруг хромосом препятствует получению хорошей сегментации, но при изготовлении давленых препаратов этого избежать невозможно. Давленые препараты могут с успехом использоваться для окрашивания гетерохроматина на С-сегменты или для окрашивания флуорохромами, но они не позволяют обнаружить эухроматиновые сегменты в хромосомах растений и насекомых. Пока не ясно, обусловлено ли это тем, что на давленых препаратах, где вокруг хромосом сохраняется слишком много цитоплазмы, нельзя провести дифференциального окрашивания для выявления зухроматиновых сегментов, или действительно существуют различия в организации хромосом между высшими позвоночными, с одной стороны, и растениями и насекомыми, с другой стороны.

Препараты мейотических хромосом большинства видов организмов получают методом раздавливания [10]. Для хромосом млекопитающих применяется процедура высушивания на воздухе, в основном сходная с той, которая используется для хромосом культивируемых лимфоцитов. Детали методики изменяются в зависимости от того, какую стадию мейоза необходимо выявить. При использовании более кратковременной гипотонической обработки [16, 17] получаются в основном метафазные пластинки, относящиеся к первому и второму мейотическим делениям, а также некоторое количество пластинок из сперматогониев, находящихся в диакинезе и метафазе. Более длительная гипотоническая обработка [18] приводит к распластыванию пахитенных хромосом, но одновременно к разрушению большинства клеток, находящихся на других стадиях мейоза. Таким образом, прежде чем делать препараты, необходимо решить, какую стадию мейоза вы будете исследовать. Препараты мейотических хромосом могут быть использованы для выявления гетерохроматиновых сегментов, но эухроматиновые сегменты на них не выявляются.

3.1. Методика получения хромосомных препаратов из культивируемых лимфоцитов человека

1. Соберите кровь из вены в стерильный контейнер, покрытый изнутри гепаринатом лития (антикоагулянтом). Слегка перемешайте кровь во избежание свертывания. Важно отметить, что кровь должен брать только специалист, а все процедуры по культивированию нужно проводить в стерильных условиях.

2.Проинкубируйте 0,8 мл крови в течение 72 ч при 37 °С в универсальном флаконе, содержащем 10 мл культуральной среды следующего состава:

среда F 10 (Gibco) 8,0 мл эмбриональная телячья сыворотка 2,0 мл ФГА 0,1 мл

пенициллин, 10000 ед./мл; стрептомицин 10 мг/мл — 0,01 мл

3.За 3 ч до взятия клеток добавьте 0,1 мл раствора, содержащего 10 мкг колцемида/мл, и слегка встряхните флакон для перемешивания.

4.По истечении 72 ч перенесите культуру в коническую центрифужную пробирку на 10 мл и отцентрифугируйте при 200 g в течение 5 мин.

5.Слейте супернатант и добавьте к осадку 10 мл 0,075 М КС1. Перемешайте на мешалке и оставьте на 8—10

мин.

6.Отцентрифугируйте в течение 5 мин при 200 g и слейте супернатант. Добавьте (при интенсивном помешивании) 10 мл свежеприготовленного фиксатора (метанол — ледяная уксусная кислота в объемном соотношении 3:1).

7.Снова отцентрифугируйте, слейте фиксатор и добавьте новый. Процедуру повторите дважды.

8.Снова отцентрифугируйте, слейте фиксатор и добавьте 0,5—1 мл нового фиксатора, чтобы получилась слегка мутная суспензия.

9.Раскапайте суспензию на чистые предметные стекла с высоты в несколько сантиметров. Подышите на стекла, чтобы клетки расправились, и дайте препарату высохнуть.

10.Просмотрите препарат в фазово-контрастном микроскопе, чтобы убедиться в его качестве и плотности расположения клеток на стекле. Если плотность клеток слишком высока или слишком низка, то разбавьте суспензию, добавив фиксатор, или вновь отцентрифугируйте и ресуспендируйте клетки в меньшем объеме,

193

после чего сделайте необходимое количество препаратов.

Поскольку для получения хорошей 'дифференциальной окраски хромосом важно, чтобы хромосомные препараты были хорошего качества, то следует обратить внимание на тщательное выполнение всех деталей методики. Наилучшие результаты получаются при условии, что в препарате вокруг хромосом очень мало цитоплазмы, есть хорошо расправленные, достаточно длинные хромосомы с небольшим числом наложений, или, если возможно, совсем без них. На плохо расправленных препаратах, таких как показанный на рис. 9.1, нельзя получить удовлетворительной дифференциальной окраски; сравните этот препарат с иллюстрациями хорошей сегментации, приведенными в настоящей главе далее (рис. 9.2—9,5). Хорошего качества хромосомных препаратов можно достичь, применяя адекватную гипотоническую обработку и фиксацию. Смесь метанол — уксусная кислота для фиксации должна быть свежеприготовленной, ее нельзя хранить; в процессе фиксации надо использовать столько смен фиксатора, сколько нужно для получения чистых хромосомных препаратов. Трех смен бывает достаточно, но если необходимо, то можно использовать и больше.

Рис. 9.2. Метафазная пластинка лимфоцита человека, С-окраска. Стрелками указаны крупные блоки гетерохроматина на хромосомах 1, 9, 16 и Y

Даже если хромосомы хорошо распределены по стеклу и вокруг них почти нет цитоплазмы, хорошего дифференциального окрашивания невозможно добиться, если хромосомы находятся в слишком сжатом состоянии. В норме хромосомы конденсируются по мере того, как клетка переходит из профазы в метафазу, и в то же время многочисленные сегменты, существовавшие на ранних стадиях митоза, сливаются вместе, в результате чего в метафазе количество сегментов значительно уменьшается. Накопление клеток на стадии метафазы путем применения колцемида и других митостатиков приводит к тому, что во многих клетках хромосомы становятся сильно конденсированными и непригодными для дифференциального окрашивания. Таким образом, необходимо искать компромисс между получением максимального числа метафазных клеток, с одной стороны, и минимальной степенью конденсации хромосом, с другой стороны [10, 11]. В табл. 9.3 приведен перечень характерных ошибок, возможных при изготовлении хромосомных препаратов, и способы их исправления.

Для получения хромосомных препаратов у позвоночных также можно использовать культуры клеток крови, но обычно требуются определенные модификации этой методики [10]. Похожими методами можно воспользоваться и для получения хромосомных препаратов из культивируемых клеток [12]. Другие типы клеток требуют соответствующих условий культивирования и фиксации. Харрисоном [13] описаны методы работы с различными типами раковых клеток. Этот биоматериал печально известен тем, что дает неясные, сильно конденсированные хромосомы, которые трудно дифференциально окрасить.

Как правило, прежде чем дифференциально окрашивать хромосомные препараты каким-либо методом, их нужно выдержать. Наиболее подходящий срок в большинстве случаев составляет при комнатной температуре от 3 дней до одной недели. Более длительное хранение приводит к снижению качества сегментирования, а иногда даже к полной утрате свойства хромосом дифференциально окрашиваться. Тем не менее на стеклах, пролежавших несколько месяцев, можно получить хорошее С-окрашивание (одно из наиболее капризных) — результат, который пока необъясним. Если стекла нужно долго выдерживать перед окрашиванием, их следует хранить при низкой температуре и желательно в эксикаторе. Если, наоборот, хромосомы надо дифференциально окрасить как можно скорее, то препарат можно искусственно «состарить» в течение 16—18 часов при 60 °С.

Таблица 9.3. Характерные ошибки в приготовлении препаратов хромосом из лимфоцитов крови и способы их исправления

Ошибка	Способ исправления
Суспензия фиксированных клеток	Тщательнее перемешивать при первой фиксации
загрязнена бурыми хлопьями гематина
Суспензия клеток на стекле не растекается,	Грязное стекло; промойте стекла кислым спиртом (1%
	194

а остается в виде капли	концентрированной НCl в абсолютном спирте)
Хромосомы плохо расправлены и окружены	Увеличьте время обработки в гипотоническом растворе
цитоплазмой	KCl. Тщательнее перемешивайте при фиксации.
	Используйте больше смен фиксатора (до 6-ти)
Хромосомы плохо расправлены, но	Используйте холодные стекла или стекла, вынутые из
цитоплазмы вокруг них нет и стекло чистое	дистиллированной воды, (не давая им высохнуть), либо
	раскапывайте суспензию клеток с большей высоты
Метафазные пластинки с разломанными и	Слабее дышите или совсем не дышите на стекла.
разбросанными хромосомами	Сократите время гипотонической обработки.
	Раскапывайте суспензию клеток с меньшей высоты
Чересчур конденсированные хромосомы	Сократите время инкубации с колцемидом

4. Стандартные методы дифференциального окрашивания

Стандартные методы дифференциального окрашивания — это те, которые обычно используются для сравнительного исследования хромосом животных: С-, G-, R- и Q-окрашивание, а также серебрение ядрышковых организаторов (Ag — NOR-окраска).

4.1. С-окрашивание

Окрашивание С-методом производится путем погружение стандартных препаратов хромосом последовательно в кислый, щелочной и горячий солевой растворы и последующего окрашивания красителем Гимза. Здесь приводится методика, описанная Самнером [19], различные модификации которой почти всегда используются в качестве основы при С-окрашивании.

Методика

1.Погрузите предметные стекла в 0,2 М НС1 (17,2 мл концентрированной кислоты на литр воды) на 60 мин при комнатной температуре.

2.Быстро ополосните стекла дистиллированной или деионизованной водой.

3.Поместите стекла на 5 мин в 5%-ный раствор Ва(ОН)3, при 50°С. Данный раствор лучше всего получать, нагревая до 50 °С на водяной бане сосуд с 40 мл дистиллированной воды и добавив за несколько минут до

использования 2 г октагидрата гидроокиси бария [Ва(ОН)2-8Н2О] (для растворения сосуд нужно энергично встряхивать). На поверхности неизбежно появится накипь, которую дает ВаСО3. Если она образует отложения на стеклах, мешающие работе, ее можно удалить. Раствор должен быть использован в течение короткого периода времени (не более 60 мин).

4.Тщательно промойте стекла, чтобы удалить с них как можно больше налета.

5.Проинкубируйте стекла в 2 х SSC (0,3 М NaCl + 0,03 М три-натрийцитрата) при 60°С в течение 60 мин. Концентрированный раствор SSC содержит 17,53 г NaCl и 8,82 г три-натрийцитрата на литр.

6.Промойте препараты дистиллированной или деионизованной водой.

7.Окрасьте препараты по Гимза в течение 45 мин. Добавьте 1 мл красителя Гимза в модификации Гарра (Gurr R66, фирма BDH) к 50 мл буфера, рН 6,8, приготовленного из сухого буфера Гарра (BDH).

8.Промойте препараты дистиллированной или деионизованной водой и тщательно промокните насухо.

9.Выдержите препараты в течение нескольких минут для полного высыхания, а затем заключите их в заливочную смесь DPX (BDH) или аналогичную смесь на основе полистирена. На рис. 9.2 показан типичный пример препарата, который получается при окраске данным методом — он содержит темные гетерохроматиновые области и более бледные плечи хромосом.

Как и другие методы дифференциального окрашивания, С-окрашивание можно проводить несколькими способами, так что исходный метод, описанный выше, можно модифицировать. Если хромосомы оказались слишком темными и с нечеткими сегментами, препарат следует подвергнуть более интенсивной обработке (до окраски); напротив, слишком бледное окрашивание указывает на то, что хромосомы обрабатывали чересчур долго. Изменяя продолжительность окрашивания или концентрацию красителя, эти дефекты исправить нельзя. Если удовлетворительных результатов не получается, то лучше всего начать с изменения времени инкубации в

растворе Ва(ОН)2. Если хромосомы слишком темные и С-сегменты выявляются плохо, то продолжительность этой обработки должна быть увеличена. В случае бледного окрашивания продолжительность инкубации в

растворе Ва(ОН)2 следует уменьшить, а для некоторых наиболее чувствительных препаратов хромосом следует также понизить температуру раствора. Например, для мейотических хромосом мыши рекомендуется обработка

4%-ным Ва(ОН)2 в течение 30 с при 37 °С [20].

Если изменений в режиме обработки раствором Ва(ОН)2 недостаточно для получения хороших результатов, то следует сократить время обработки препарата в НС1. Иногда последнюю можно вообще опустить, но в большинстве случаев некоторая обработка кислотой все же нужна. Уменьшение времени инкубации в кислоте с 60 до 30 или 15 мин может привести к улучшению видимой морфологии хромосом за счет того, что они будут меньше расплываться. Кроме того, при этом получается более интенсивная окраска.

Упомянутое выше окрашивание по Гимза в модификации Гарра (Gurr R66) дает хорошие результаты,

195