МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА № 12
ТЕМА: Иммунитет и естественная резистентность организма к инфекции. Оценка общего реактивного потенциала организма. Факторы резистентности, методы их выявления. Специфический иммунитет
МОТИВАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА:Иммунитет и естественная резистентность организма к инфекции нуждается в детальном и поэтапном изучении. Поэтому, важное значение имеют материальная основа и функции защитных систем.
Естественная резистентность организма во многом определяется состоянием его различных анатомо-физиологических механизмов и находится в тесном взаимодействии с высоко специализированной иммунобиологической системой. Она является первой, а в некоторых случаях единственной, линией обороны от инфекции, в единстве с иммунной системой определяет напряженность сопротивление ей инфекции. Иммунитет - это комплексная система защитных реакций, но первой принимает на себя атаку возбудителей естественная резистентность и её факторы. От неё зависит начало заболевания.
УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ:
Общая: дать представление о видах иммунитета, системе естественной резистентности организма к инфекции, её механизмах.
Конкретная:научить определению факторов неспецифической защиты организма от инфекции
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ И ВВОДНОГО КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ
1.Виды иммунитета макроорганизма к возбудителям инфекционных заболеваний, их классификация: врождённый и приобретённый, естественный и искусственный, активный и пассивный иммунитет, стерильный и нестерильный.
2. Видовой иммунитет и его варианты: абсолютный, относительный, временный (иммунитет новорождённых).
3. Классификация факторов естественной резистентности к инфекциям.
4. Физиологический (барьерная функция покровов, антимикробное действие секретов, выделительная система, антагонистическое действие нормальной микрофлоры, адсорбционная функция тканей, фагоцитоз, антимикробные факторы, лизоцим, бета лизины, комплемент и др.) и патофизиологические (стресс) механизмы неспецифической резистентности.
5. Фагоцитоз. Макро- и микрофаги, их функциональные отличия. Механизмы, определение, этапы фагоцитоза, его оценка (показатели). Завершённый и незавершённый фагоцитоз.
6. Комплементарная система, её состав. Классический и альтернативный пути её активации, функции, определение.
7. Бета-лизины и общая бактерицидность, назначение, определение.
8. Лизоцим, его продукция, действие, определение.
9. Интерферон, его продуценты, функции, определение.
10. Роль персистенции микробов в регуляции защиты от инфекции, факторы, их определение.
11. Значение неспецифической резистентности в подготовке специфической иммунной защиты организма (переработка антигенной информации микробов) и её презентация.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ С ПОЛНЫМ РЕГЛАМЕНТОМ ПРОТОКОЛА ЗАНЯТИЯ
№ |
Наименование учебного элемента (задания) |
Методическое решение |
Регламент протокола |
1. |
Составить классификацию видов иммунитета |
Рекомендуемая литература |
Записать в протокол |
2. |
Составить классификацию факторов естественной резистентности |
Рекомендуемая литература |
Записать в протокол |
3. |
Поставить опыт фагоцитоза и определить ФП, ФЧ, ОФИ, составить схему оценки завершённости фагоцитоза |
Приложение 1
|
Записать в протокол
|
4. |
Изучить технику постановки реакций по определению титра лизоцима, комплемента, бета-лизинов, общей бактерицидности и пути активации комплемента |
Приложение 6
|
Заполнить таблицу и записать в протокол
|
5. |
Используя демонстрационный материал, установить титр всех факторов |
Приложение 2, 3, 4, 5 |
Записать в протокол |
6. |
Тестовый контроль по теме |
Приложение 7 |
|
Приложение 1 опыт фагоцитоза
/по Алексеевой О.Г., Волковой А.П., 1966/
К 0,1 мл З % стерильного раствора антикоагулянта лимоннокислого натрия добавить 0.2 мл крови больного и 0,1 мл 2 млрд взвеси суточной культуры золотистого стафилококка (S.aureus№209P). Смесь тщательно перемешать и инкубировать при 37 С0 30-40 минут. Из кровяно-микробной взвеси приготовить мазок, высушить на воздухе, зафиксировать, окрасить по Романовскому-Гимза в модификации Филипсона: на высохший препарат нанести 11 капель спиртового раствора краски Романовского (1 часть краски и З части этилового спирта), окрашивать до 30 минут, затем препарат тщательно промыть водой, высушить. Микроскопировать с иммерсией.
В мазке следует определить:
1. Интенсивность фагоцитоза — процент фагоцитирующих лейкоцитов в общей их массе (фагоцитарный показатель - ФП).
2. Фагоцитарное число — ФЧ (среднее число поглощённых микробных клеток в одном фагоците).
3. Опсонофагоцитарный индекс по формуле:
ОФИ должен быть больше единицы, что говорит о накоплении антител — опсонинов, помощников фагоцитов.
4. ОФИ можно оценить также по уровню и динамике ФЧ по таблице:
Таблица 1
Определение опсонофагоцитарного показателя по методу и таблице Шриттер — Мурсаловой
Количество микробов, фагоцитированных одним фагоцитом (ФИ)
|
Оценка фагоцитоза по выраженности
|
Количество нейтрофилов с таким фагоцитозом
|
ОФИ
|
0 1-20 21-40 41 и более |
0 + /1/ ++ /2/ +++ /3/ |
0 10 10 5 |
0 10 20 15 |
ИТОГО: 25 45 |
ОФИ, равный 10-24, характеризует слабоположительную реакцию, 25-49 — ясно выраженную, 50-75 резко положительную.
Кроме того, в отношении ОФИ по отношению к возбудителям некоторых инфекций (например, к бруцеллам) есть специальная оценочная шкала
5. а) Оценка завершённости фагоцитарной реакции по индексу завершённости.
Кровяно — микробную взвесь инкубируют при +37Сº 2 часа. После этого из неё готовят мазок, высушивают и отдельно не фиксируют, окрашивают сначала раствором прочного зелёного 20 минут и докрашивают 0,1 % водным раствором азура П.
При этом жизнеспособные клетки окрашиваются в сине-сиреневый цвет.
Определяют ИЗФ – индекс завершённости фагоцитоза рассчитывается по формуле:
.
ИЗФ = Е 30 мин, где
Е 2 часа
Е 30 мин. – общее количество микробных клеток в 100 фагоцитах через 30 минут;
Е 2 часа – общее количество микробных клеток в 100 фагоцитах через 2 часа, то есть после окончания фагоцитоза.
Завершённым должен быть фагоцитоз с не менее 2/3 фагоцитов (~60 % и >).
б) Оценка завершенности фагоцитоза ускоренным методом Мотавкиной Н.С.,
Ховриной М.П. (1962).
Она осуществляется сразу после окончания опыта путем обработки микробо-кровяной (лейкоцитарной) взвеси раствором флюорохрома - акридина оранжевого 1:1000. Мёртвые особи под люминисцентным микроскопом оранжево-жёлтые, живые – зелёные. Расчёт завершённости делают по проценту фагоцитов с поглощёнными микроробами.
Приложение 2
а) ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ЛИЗОЦИМА КЛАССИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
По лизису индикаторной культуры чувствительного микрококка M. lysodeikticus
Ингредиенты |
Разведения сыворотки, слюны | |||||||
|
1:10 |
1:20 |
1:40 |
1:80 |
1:160 |
1:320 |
1:640 |
К. к. |
Физиологический 0,85% раствор поваренной соли |
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
Субстрат (сыворотка) испытуемый
|
1 |
1
|
1 |
1 |
1
|
1
|
1
|
1 до 1 % р-р
|
Тест-культура микрококка (1 млрд мт в 1мл) в каплях |
2 к.
|
2 к.
|
2 к.
|
2 к.
|
2 к.
|
2 к.
|
2 к.
|
2 к. |
Инкубировать 3 часа при +37С° | ||||||||
Учет результатов |
Лизис тест-культуры |
Отсутствие лизиса |
Титр лизоцима в исследуемом субстрате равен 1:40 (максимальное разведение, или минимальное количество,давшее лизис культуры и просветление).
б) ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ЛИЗОЦИМА МИКРОМЕТОДОМ
по Н.С. Мотавкиной, Б.М. Ковалеву, А.С. Шаронову (1979)
В камеру, состоящую из 2 фотопластин и ограничивающей прокладки между ними, внести смесь расплавленной и остуженной до +45С° 2% агарозы икультуры микрококка в концентрации 500 тыс. мт/мл. После застывания агаровогосубстрата, верхнюю пластинку снимают скользящим движением и с помощью пробойника делают лунки, вносят в одну из них испытуемое вещество, в другую - раствор кристаллического лизоцима. Последний служит контролем и вносится в разных концентрациях в равных объемах. Инкубировать 3 часа при +37С° во влажной камере.
По лизису тест-микроба в присутствии кристаллического лизоцима в контроле строится график зависимости диаметра зоны лизиса от концентрации этого вещества. Диаметр лизиса опытных проб сопоставляют с показателями графика и определяют в них активность (титр) лизоцима.
Приложение 3