2. Окраска препарата по Граму в модификации Синева

- На фиксированный препарат кладут полоску (квадрат) фильтровальной бумаги,

пропитанную 1 % спиртовым раствором кристаллического фиолетового.

- Наливают несколько капель воды, окрашивают 1-2 минуты.

- Снимают полоску фильтровальной бумаги.

- Наливают на препарат раствор Люголя на 1 мин (до почернения краски).

- Сливают раствор Люголя.

- Прополаскивают мазок в 96 % спирте 30 сек - 1 мин. (до отхождения красителя).

- Промывают водой.

- Обесцвеченные элементы и клетки дополнительно окрашивают разведённым

фуксином 30 сек — 1 мин.

- После окраски препарат тщательно промывают и высушивают.

При микроскопии грам «+» клетки сине - фиолетового цвета, грам «-» - розово-красные.

Приложение 2

1. Окраска кислотоустойчивых микробов м. Tuberculosis методом Циль - Нильсена

- На высушенный, зафиксированный на пламени препарат кладут полоску

фильтровальной бумаги.

- Наливают карболовый фуксин Циля (можно заменить окрашенной бумажкой).

- Препарат прогревают над пламенем спиртовки до отхождения паров.

- С остывшего препарата снимают полоску фильтровальной бумаги с красителем.

- Препарат фиксируют жаром.

- Промывают водой.

- Прополаскивают в стакане с 5 % холодным раствором Н₂SO₄ до обесцвечения.

- Промывают водой.

- Докрашивают раствором метиленового синего (3-5 мин.).

- После окраски препарат тщательно промывают и высушивают.

2. Окраска препарата из мочи по Циль - Нильсену в модификации Хузе

В моче наряду с кислотоустойчивым М. Tuberculosis могут встречаться кислотоустойчивые бактерии половой смазки — М. Smegmae, отличающиеся от первых спиртоподатливостью.

Хузе предложил использовать этот признак для их дифференциации. Модификация Хузе повторяет метод Циль - Нильсена, но после обработки мазка холодной 5 % Н2SO4 и промывки водой, дополняется обработкой этанолом (20 сек). М. Tuberculosis к этанолу устойчивы и не обесцвечиваются, оставаясь красными. М. Smegmae под его влиянием эту краску теряют, но при докраске метиленовой синью становятся синими.

Приложение 3

ОКРАСИТЬ МАЗОК ИЗ ДРОЖЖЕИ ПО ПЕШКОВУ (выявление оболочки)

- 1-2 петли дрожжей внести в 1-2 мл 25 % р-р NaCl (гипертонический раствор для извлечения воды из клеток)- 30-40 минут.

- Приготовить мазок, высушить, зафиксировать на пламени спиртовки или в спирт - формоле.

- На фиксированный препарат наливают 10% раствор танина (протрава).

- Сливают танин, осторожно промывают водой.

- Окрашивают препарат фуксином Пфейффера.

- Препарат тщательно промывают водой и просушивают.

Препарат готов для микроскопии - бактерии красного цвета.

Приложение 4

ОКРАСКА НУКЛЕОИДА БАКТЕРИЙ ЯДРОТРОПНЫМ МЕТОДОМ ФЕЛЬГЕНА

- Приготовить препарат из бактериальной культуры или дрожжей.

- Высушить, зафиксировать в жидкости Карнуа.

- Промыть 80 % этанолом.

- Обработать 7 мин. 1 N НСl, подогретой до 60° С.

- Обработать фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа).

- Промыть водой, высушить, микроскопировать с иммерсией.

ОКРАСКА НУКЛЕОИДА БАКТЕРИЙ ПО РОМАНОВСКОМУ – ГИМЗА

- На готовый зафиксированный мазок наносят 2-3 капли готовой краски -эозина с метиленовой синькой на 20-30 минут. Смывают водой, высушивают. Микроскопируют.

На мазке цитоплазма клеток голубая или розовая, нуклеоид — красно-фиолетового цвета.

Приложение 5

ВЫЯВЛЕНИЕ ЗЁРЕН ВОЛЮТИНА ПО НЕЙССЕРУ

- Готовят мазок, высушивают, фиксируют жаром.

- Наливают на мазок 1-2 капли уксуснокислой синьки Нейссера, красят 2-3 минуты.

- Краску сливают, наносят раствор Люголя на 20 сек.

- Смывают водой.

- Наносят раствор везувина (хризоидина) для окраски тела бактерии.

- Смывают водой, высушивают, микроскопируют.

На мазке: тело клетки жёлто коричневого цвета, зёрна волютина от сине-зелёного до

сине-чёрного цвета.

ВЫЯВЛЕНИЕ ЗЁРЕН ВОЛЮТИНА ПРОСТЫМ МЕТОДОМ ЛЕФФЛЕРА

- На готовый зафиксированный мазок наносят 1-2 капли водного раствора щёлочной метиленовой синьки. Красят 3-5 минут.

- Сливают, ополаскивают водой, высушивают.

- Микроскопируют с иммерсионной системой. На мазке — голубые клетки с синими, почти чёрными зёрнами волютина.

Приложение 6

ВЫЯВЛЕНИЕ КАПСУЛ У БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ БУРРИ - ГИНСА

- На середине предметного стекла смешивают каплю туши любого цвета и каплю взвеси культуры бактерий или материала.

- Отшлифованным краем другого стекла готовят идентично препарату крови.

- Высушивают.

- Фиксируют жаром на пламени спиртовки (можно не фиксировать, это сделает спирт в туши).

- Препарат охлаждают.

- Тушевой препарат окрашивают карболовым раствором фуксина 5-10 минут (при чёрном фоне) или метиленовой синькой 3-6 минут (при красной туши).

- Промывают водой, высушивают.

При микроскопии виден цветной фон, обтекающий бесцветная капсула вокруг, внутри — окрашенная клетка.

Приложение 7

ВЫЯВЛЕНИЕ СПОР У БАКТЕРИИ МЕТОДОМ ОЖЕШКО

- Готовят мазок из культуры на стекле.

- На зафиксированный мазок наливают 0,5 % раствор хлористоводородной кислоты и трижды подогревают (1-2 мин) для протравы.

- Краску с препарата сливают.

- Промывают водой и высушивают.

- Фиксируют жаром на пламени (повторно).

- Препарат красят по способу Циля-Нильсена с соблюдением всех этапов.

На мазке тело клеток голубое, спора красная.

Приложение 8

ВЫЯВЛЕНИЕ ЖГУТИКОВ У КУЛЬТУРЫ ПОДВИЖНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ МЕТОДОМ СЕРЕБРЕНИЯ ПО МОРОЗОВУ:

Готовят З реактива:

1. 1 мл ледяной уксусной кислоты. 2 мл формалина, 100 мл дистиллированной воды;

2. 5 г танина, 1 мл жидкой карболовой кислоты, 100 мл дистиллированной воды;

3. 5 г кристаллического нитрата серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отливают 20 мя в другой сосуд, к оставшимся 80 мл раствора по каплям добавляют раствор аммиака, пока не растворится образующийся осадок и не останется лёгкая опалесценция. Если аммиака будет слишком много, то из отлитых в другой сосуд 20 мл раствора серебра надо добавлять по каплям до получения нужной слабой опалесценции. Для окраски препарата раствор серебра разводят дистиллированной водой 1: 10.

Окраска препарата:

- наливают на 1 минуту реактив № 1

- сливают, промывают препарат водой

- наливают реактив № 2, подогревают на лёгком пламени до отхождения паров (1 мин)

- тщательно промывают водой, 1-2 минуты

- при прогревании обрабатывают препарат реактивом № 3 до появления тёмно- коричневой окраски мазка

- тщательно промывают водой

- высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

Приложение 9

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПОДВИЖНОСТИ БАКТЕРИЙ

I. Метод раздавленной капли.

1. На предметное стекло наносят 1 каплю культуры в МПБ. При её наличии на МПА вначале наносят каплю физиологического раствора и эмульгируют в ней 1 петлю микробов, взятых со среды.

2. Накрывают покровным стеклом, прижимая его к предметному. Капля «раздавливается» между ними.

З. На покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с объективом х90, окуляром х7 при слегка опущенном конденсоре.

В случаях работы с относительно крупными бактериями можно пользоваться сухими объективами х40 и даже х8 и обойтись без иммерсионного масла.

II. Метод «висячей капли» при определении подвижности бактерий выполняется по тому же принципу, но с различием в монтаже камеры.

1. Берут покровное (не предметное) стекло, наносят на него 1 каплю испытуемой микробной взвеси.

2. Накрывают перевёрнутым предметным стеклом с луночкой, но с таким расчётом, чтобы капля оказалась в её центре. Для сцепления стёкол края лунки смазывают вазелином. Капля оказывается висячей над лункой.

З. Микроскопию проводят так же, как в предыдущем методе.

Приложение 10

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ ПОСЕВА

1. Метод Шукевича.

- Испытуемую культуру бактерий засевают в конденсационную воду косячка

МПА, не прикасаясь к его поверхности.

- Ставят в термостат при +37С° на 18-24 часа.

- Учёт результатов ведут по феномену роения, в процессе которого растущая культура ползёт по косячку вверх. Неподвижная культура развивается только в конденсате, а косячок МПА остаётся стерильным.

2. Метод посева в столбик полужидкой среды по Пешкову.

- Испытуемую культуру осторожно бактериальной петлёй засевают в столбик 1-1,5 % МПА.

- Ставят в термостат при +37С° на 18-24 часа.

- Учёт результатов производят по характеру роста:

а) Неподвижные бактерии растут строго по ходу укола.

б) Подвижные бактерии дают рост, напоминающий ёршик с расходящимися в стороны шипами.

Оценка роста проводится визуально.

Приложение 11

ВОПРОСЫ ДЛЯ ТЕСТОВОГО КОНТРОЛЯ УСВОЕНИЯ ТЕМЫ

Указать правильный ответ:

1. Бактерии по своим биологическим свойствам относятся к:

а) эукариотам

б) прокариотам

2. Прокариоты - это микроорганизмы, которые имеют:

а) ядро

б) нуклеоид

3. Какой структурный элемент не относится к постоянным элементам бактерий?

а) спора

б) нуклеоид

в) цитоплазма

г) жгутики

д) клеточная стенка

е) цитоплазматическая мембрана

4. Какой элемент относится только к постоянным структурным элементам бактерий?

а) спора

б) капсула

в) нуклеоид

г) зёрна волютина

5. Какие бактерии имеют много жгутиков по всей поверхности клетки?

а) монотрихи

б) амфитрихи

в) лофотрихи

г) перитрихи

6. Какие бактерии имеют по одному жгутику или пучку жгутиков на концах клетки?

а) монотрихи

б) амфитрихи

в) лофотрихи

г) перитрихи

7. Какие бактерии имеют один жгутик на конце клетки?

а) монотрихи

б) амфитрихи

в) лофотрихи

г) перитрихи

8. Какие бактерии имеют пучок жгутиков на одном конце клетки?

а) монотрихи

б) амфитрихи

в) лофотрихи

г) перитрихи

9. Указать первый этап спорообразования:

а) созревания

б) подготовительный

в) образования оболочки вокруг споры

г) предспоры

10. Укажите методы определения размеров микроорганизмов:

а) центрифугирование с известной скоростью

б) электронная микроскопия

в) измерение величины с помощью окуляр- и объектмикрометра

г) фильтрация через фильтры с известным диаметром пор

д) все выше перечисленные методы

11. Укажите прямой метод определения подвижности бактерий:

а) выявление жгутиков по методу Морозова, Леффлера

б) метод посева на МПА

в) реакция агглютинации

12. Укажите косвенный метод определения подвижности бактерий:

а) метод посева на МПА

б) микроскопия нативного препарата методом «висячая» или «раздавленная» капля

в) выявление жгутиков по методу Морозова, Леффлера

13. В какой цвет окрашиваются грамотрицательные микроорганизмы по Граму:

а) красный

б) синий

в) жёлтый

14. В какой цвет окрашиваются кислотоустойчивые микроорганизмы по Цилю-Нильсену:

а) красный

б) синий

в) жёлтый

15. В какой цвет окрашиваются зёрна волютина по Нейссеру:

а) красный

б) синий

в) жёлтый

16. Укажите дифференцировочный компонент при окраске по методу Грама:

а) генциановый фиолетовый

б) фуксин

в) раствор Люголя

г) вода

д) спирт

17. Грамотрицательные бактерии при окраске по Граму окрасились в синий цвет. Возможная причина ошибки:

а) мазок не обработан раствором Люголя

б) мазок переобесцвечен спиртом

в) мазок недообесцвечен спиртом

г) мазок недоокрашен фуксином

д) мазок слишком долго окрашивался генцианвиолетом

18. Укажите дифференцировочный компонент при окраске по методу Циля-Нильсена:

а) кислота

б) физиологический раствор

г) дистиллированная вода

19. Для выявления кислотоустойчивых бактерий используется окраска по:

а) Бурри

б) Граму

в) Цилю-Нильсену

г) Нейссеру

д) Ожешко

20. Для выявления спор у спорообразующих бактерий используют окраску по:

а) Бурри

б) Граму

в) Цилю-Нильсену

г) Нейссеру

е) Ожешко

21. Для выявления капсул у бактерий используют окраску по:

а) Бурри

б) Граму

в) Цилю-Нильсену

г) Нейссеру

е) Ожешко

22. Каким методом выявляют нуклеоид бактерий?

а) по Граму

б) по Пешкову

в) по Романовскому-Гимзе

23. Каким методом выявляют оболочку бактерий?

а) по Граму

б) по Пешкову

в) по Романовскому-Гимзе

24. Каким методом выявляют клеточную стенку бактерий?

а) по Граму

б) по Пешкову

в) по Романовскому-Гимзе

25. Каким методом выявляют зерна волютина у бактерий?

а) по Граму

б) по Нейссеру

в) по Ожешко

26. По методу Ожешко споры бактерий окрашиваются в какой цвет?

а) синий

б) красный.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Основная:

1. Лекция по теме.

2. Методическая разработка по теме.

3. Борисов Л.Б. — Медицинская микробиология, вирусология, иммунология, - М., МИА. 2005. С. 30 – 40.

4. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.,1982. С. 20 -28.

7. Мотавкина Н.С., Артёмкин В.Д. Атлас по микробиологии и вирусологии. М., 1976. С. 7-

12.

9. Коротяев А.И., Бабичев С.А. медицинская микробиология, иммунология и вирусология. С-Пб, 2002. С. 31-45.

Дополнительная:

1.Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. Под ред. Воробьева А.А., Быкова А.С.- М., 2003. С.21 -29.

2. Медицинская микробиология. Под ред. Королюка А.М., Сбойчакова В.Б. С-Пб, 2002. С.21-29.

25