2.4 Записи и анализ ответов на ионтофоретические аппликации

Метод ионтофореза использовался для локальной аппликации агониста, чтобы исследовать фармакологические свойства рецепторов и при этом исключить влияние пресинаптического звена синаптической передачи. Для ионтофореза растворы агонистов (ГАМК 200 мМ; CACA 200 мМ и изогувазин 200 мМ) приготавливались на основе раствора Рингера, после чегоpHкорректировался до 7.4. Растворы хранились замороженными. Перед началом каждого эксперимента таким раствором заполнялась ионтофоретическая пипетка (аналогичная пейч-кламповскому электроду), сопротивление которой было 5 МΩ. Затем ионтофоретический электрод устанавливался поблизости от регистрируемой клетки в районе ее дендритов (Рис. 2.5). Ток в пипетку подавалсяcпомощью усилителяAxoclamp 2B(AxonInstruments,

Рис. 2.5 Схема регистрации ионтофоретических токов на примере интернейрона поля СА1 гиппокампа

а, Расположение регистрирующего (рег. эл) и ионтофоретического (ионт. эл) электродов в str.radiatum поля СА1 среза гиппокампа. Ионтофоретический электрод располагался по возможности ближе к клетке, чтобы аппликация агониста могла достигнуть рецепторов на ее проксимальных дендритах.б, Фотография, показывающая регистрирующий электрод, расположенный на интернейроне str.radiatum поля СА1 среза гиппокампа, и с ним рядом ионтофоретический электрод (покрашен в голубой цвет).

UnionCity, Калифорния). Ток удержания агониста был -100 нА, ток инъекции 150-250 нА. Длительность аппликации 0,1-1 секунда. Для избежания десенситизации ГАМКергических рецепторов между аппликациями давался интервал не меньше 30 секунд. Поскольку инъекция агониста сопряжена с подачей электрического тока, есть вероятность, что этот ток будет стимулировать пресинаптические аксоны и приводить к синаптическому выбросу медиатора. Для избежания этого все эксперименты с ионтофоретической аппликацией проводились в присутствии тетродотоксина (блокатораNa⁺каналов). Токи на ионтофоретическую аппликацию регистрировались и анализировались также, как и синаптические токи, вызванные электрической стимуляцией терминалей.

2.5 Записи и анализ токов с outside-out patch

2.5.1 Приготовление outside-out patch

Для этого метода использовались электроды с более высоким сопротивлением (8-10 МΩ), чем для whole-cell(4-5 МΩ). Внеклеточный раствор и раствор в электроде были такими же, как и в режиме whole-cell. После образования гигасила и прорыва мембраны, клетки стабилизировались в течение 1-2 минут в режиме фиксации потенциала на –60 мВ (Рис. 2.6а). Для получения мембранных пейчей использовались только клетки, в которых наблюдалась стабильная спонтанная активность. Затем электрод отрывался от клетки, при этом наблюдалось изменение формы тока на гиперполяризующий сдвиг потенциала -5 мВ (рис. 2.6в). Кроме того, ток компенсации становился близким к нулю, что указывало на плотный контакт пейча и кончика электрода. Все это означало образованиеoutside-out(внешняя сторона наружу) пейча на кончике электрода. Если этого не происходило, то такие препараты не использовались. С одной клетки удавалось получать по 5-6 пейчей. Поскольку внешняя сторона мембраны в этих препаратах оказывалась направленной наружу, то аппликация агонистов ионотропных рецепторов вызывала в них открытие каналов и, соответственно, ток. Длительность записи с одного пейча составляла в среднем 20-30 минут.