- •Научные консультанты:
- •Сокращения и глоссарий
- •Введение
- •Обзор литературы
- •1.1 Торможение в гиппокампе
- •1.1.1 ГамКергическая синаптическая передача
- •1.1.2 ГамКергические рецепторы
- •1.1.3 Разнообразие форм торможения
- •1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического торможения
- •1.2 Взаимодействие между глутамат и гамКергической системами
- •1.2.1 Гетеросинаптические взаимодействия
- •1.2.2 Критерии гетеросинаптической депрессии
- •1.2.3 Метаботропные рецепторы группы III в гиппокампе
- •1.2.4 Каинатные рецепторы в гиппокампе
- •1.3 Механизмы фокального эпилептогенеза
- •1.3.1 Исследования эпилептогенеза
- •1.3.2 Критерии развития эпилептиформной активности
- •1.3.3 Возбуждающие механизмы в эпилептогенезе
- •1.3.4 Тормозные механизмы в эпилептогенезе
- •1.4 Постановка цели и задач исследования
- •2. Материалы и методы
- •2.1 Срезы гиппокампа
- •2.1.1 Приготовление и растворы
- •2.1.2 Рабочая установка для поддержания срезов и манипуляторы
- •2.1.3 Идентификация клеток с помощью световой микроскопии
- •2.2 Регистрация и анализ полевых потенциалов
- •2.3 Записи и анализ токов (потенциалов) в режиме фиксации потенциала (тока) с одиночных нейронов
- •2.3.1 Электроды и внутриклеточные растворы
- •2.3.2 Проведение регистраций и сохранение данных
- •2.3.2 Анализ спонтанных и вызванных ответов в режиме фиксации потенциала
- •2.4 Записи и анализ ответов на ионтофоретические аппликации
- •2.5 Записи и анализ токов с outside-out patch
- •2.5.1 Приготовление outside-out patch
- •2.5.2 Система быстрой аппликации веществ
- •2.5.3 Определение биофизических свойств рецепторов с использованием анализа токов, полученных с outside-out пейчей
- •2.6 Модели эпилептогенеза in vivo
- •2.6.1 Электрический киндлинг
- •2.6.2 Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный киндлинг
- •2.7 Использованные вещества
- •2.8 Статистический анализ
- •3 Результаты исследованИй и их обсуждение
- •3.1 Нетипичные фармакологические свойства гамКергических рецепторов в гиппокампальных интернейронах
- •3.1.1 Различная чувствительность ионотропных гамКергических рецепторов к пикротоксину в интернейронах и пирамидных клетках
- •3.1.2 Ионные каналы ионотропных гамКергических рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках имеют различную проводимость
- •3.1.3 Ионотропные гамКергические рецепторы как в интернейронах, так и пирамидных клетках чувствительны к агонисту гамкс рецепторов
- •3.1.4 Пентобарбитал по-разному модулирует гамКергические токи, вызываемые аппликацией caca (50 м)
- •3.1.5 Тпст в интернейронах, регистрируемые в присутствии 100 м пикротоксина, обладают повышенной чувствительностью к антагонисту гамкс рецепторов
- •3.1.6 Токи, опосредованные гамКергическими рецепторами, в присутствии 100 м пикротоксина возникают за счет характерной Cl-/hco3- ионой проводимости
- •3.1.7 Эффект аллостерических модуляторов гамка рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.8 Сравнение эффективности антагонистов гамка и гамкс рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.9 Интернейроны содержат рецепторы, обладающие нетипичными фармакологическими свойствами
- •3.1.10 Нетипичные гамКергические рецепторы и традиционные типы рецепторов (гамка и гамкс)
- •3.1.11 Возможная субъединичная композиция нетипичных гамКергических рецепторов в интернейронах
- •Заключение
- •3.2 Регуляция возбудимости нейронов гиппокампа за счет гамКергического тонического торможения
- •3.2.1 Базовый тонический гамКергический ток специфичен для интернейронов, но не пирамидных клеток
- •3.2.2 Увеличение внеклеточной концентрации гамк ведет к возникновению тонического тока в пирамидных клетках и повышению в интернейронах
- •3.2.3 Температурная зависимость тонического гамКергического тока и фазических спонтанных тпст
- •3.2.4 Возможная роль тонического торможения в эпилептогенезе
- •3.2.5 Заключение
- •3.3 Модуляция гамКергической передачи в гиппокампе метаботропными рецепторами
- •3.3.1 L-ap4 подавляет и тормозные, и возбуждающие синаптические токи в интернейронах
- •Демонстрирующих отсутствие метаботропных рецепторов группы III на терминалях коллатералей Шаффера, оканчивающихся на пирамидных клетках са1.
- •3.3.2 Синаптически высвобождаемый глутамат снижает тпст
- •3.3.3 Глутамат опосредует гетеросинаптическую депрессию тпст
- •3.3.4 Изменения в эффективности обратного захвата глутамата влияет на гетеросинаптическую депрессию
- •3.3.5 Метаботропные рецепторы группы III опосредуют гетеросинаптическую депрессию по двум различным механизмам
- •3.3.6 Метаботропные рецепторы группы III модулируют частоту спонтанных тпст
- •3.3.7 Возможные молекулярные механизмы депрессии тпст при активации mGluR группы III
- •3.3.8 Последствия активации mGluR группы III для общей возбудимости нейрональной сети поля са1
- •3.3.9 Гетеросинаптическая депрессия, опосредованная метаботропными гамкb рецепторами
- •3.3.10 Заключение
- •3.4 Каинатные рецепторы модулируют гамКергическое торможение в гиппокампальных интернейронах
- •3.4.1 Каинат увеличивает частоту и амплитуду спонтанных тпст в интернейронах
- •3.4.2 Каинат увеличивает вероятность генерации антидромных потенциалов действия в интернейронах
- •3.4.3 Каинат вызывает спонтанные аксональные потенциалы действия
- •3.4.4 Спилловер глутамата активирует аксональные каинатные рецепторы
- •3.4.5 Последствия аксональной деполяризации, вызываемой каинатными рецепторами, для гамКергической передачи
- •3.4.6 Каинат усиливает вызванные тпст в интернейронах
- •3.4.7 Каинат приводит к увеличению гамКергического тонического тока
- •3.4.8 Последствия усиления гамКергической передачи в интернейронах, вызываемой каинатными рецепторами, для возбудимости нейрональной сети
- •3.4.9 Заключение
- •3.5 Оказывают ли метаботропные рецепторы группы III и каинатные рецепторы противоположное действие на гамКергическую передачу?
- •3.6 Механизмы развития пачечной активности в гиппокампе
- •3.6.1 Кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия создают долговременное снижение порога развития пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа
- •3.6.2 Развитие пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа не зависит от активности нейронов поля са3
- •3.6.3 Окклюзия развития пачечных разрядов в поле са1 в ответ на кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия в моделях эпилептогенеза in vivo
- •3.6.4 Является ли пачечная активность в поле са1 гиппокампа эпилептиформной?
- •3.6.5 Способность пирамидных нейронов поля са1 генерировать пачечные разряды сопровождается повышением возбудимости этих клеток
- •3.6.6 Роль nmda рецепторов и l-типа кальциевых каналов в повышение возбудимости пирамидных клеток и генерации пачечных разрядов
- •3.6.7 Заключение
- •Заключение
- •Клеткоспецифичность гамКергического торможения в гиппокампе
- •Клеткоспецифичность модуляции гамКергического торможения в гиппокампе
- •Возбудимость и торможение в эпилептогенезе
- •Эффектов веществ влияющих на гамКергические механизмы, описанные в данной диссертационной работе, представлена втаблице 4.1 (см также Рис. 4.1). Выводы
- •Список рисунков
- •Список литературы
2.5.2 Система быстрой аппликации веществ
Быстрые концентрационные изменения концентрации агониста на внешней стороне пейча производились с помощью так называемой “пипетки быстрой аппликации” (Colquhoun et al. 1992). Эта пипетка изготавливалась из Θ-капилляров, содержащих внутреннюю перегородку. Внешний диаметр был 1,5 мм; толщина стенок
Рис. 2.6 Схема регистрации токов сoutside-outпейча с использованием системы быстрой аппликации
а, Экспериментальная последовательность получения токов с outside-out пейча при быстрой аппликации агониста (1 мс). Сначала клетка идентифицировалась по морфологическим признакам, и пейч-кламповский электрод позиционировался над ней (а1). Затем между электродом и клеткой образовывался контакт с высоким сопротивлением (гигасил), после чего мембрана под электродом прорывалась –wholecellmode(а2). После этого электрод отрывался от клетки с участком мембраны, который образовывал outside-out пейч. Этот пейч устанавливался в поток раствора (контрольного/отмывающего), исходящий их одной камеры двухкамерной пипетки (а3). В другой камере находился раствор агониста (ГАМК, 1 мМ). Эта пипетка была смонтирована на двух пьезокристаллах, меняющих изгиб в зависимости от подаваемого на них тока. При подаче короткого импульса пипетка смещалась, направляя раствор агониста на пейч, затем возвращалась обратно.б, Фотография двухкамерной пипетки с размещенном в потоке раствора электродом с outside-out пейчем под микроскопом (калибровка – 40 мс). Для дополнительного контроля всех стадий приготовления outside-out пейча использовался мониторинг тока, регистрируемого в режиме фиксации потенциала в ответ на 20 мс сдвиг потенциала на -5 мВ. Стадияма1,а2иа3соответствуют изменения формы токав1,в2ив3.
0,2 мм; внутренней перегородки 0,15 мм. Пипетки вытягивались на программируемом вытягивающем устройстве фирмы SutterInstruments(USA) модельP-87. Диаметр кончика был 230-250 μм. С обратной стороны в отсеки капилляра вводились тонкие нейлоновые трубочки, которые присоединялись к гравитационной системе подачи растворов. Пипетка приклеивалась к пластинке, состоящей из двух пьезокристаллов, которые при подачи на них электрического тока изгибались. Таким образом, достигалась возможность смещать кончик пипетки в пространстве очень быстро и на различные интервалы времени. В один отсек пипетки подавался контрольный раствор, в другой раствор агониста (Рис. 2.6).
Outside-outпейч, полученный с нейрона, вводился в контрольный раствор рядом с границей раствора, содержащего агонист. Пьезокристалл, перемещающий двухканальную пипетку, присоединялся к стандартному электрическому стимулятору. При этом величина стимула соответствовала амплитуде смещения границы растворов, а длительность стимула – длительности смещения. Первый параметр не имел значения для формы или величины тока. Ток в пейче определялся концентрацией агониста, длительностью аппликации (1 мс), числом и свойствами каналов и рецепторов.
Растворы
Для быстрой аппликации использовались растворы, отличные от нормального раствора Рингера. Это было связано с тем, что они не карбогенизировались (чтобы избежать образования пузырьков) и формулировались для стабилизации пейча. Контрольный раствор на основе HEPESсодержал (в мМ): NaCl (140), CaCl2(2), KCl (1.5), MgCl2(1), HEPES (10) (pH доводилась до 7.2, осмолярность до 295 мОсм). Раствор агониста (ГАМК 1 мМ) делался на основе контрольного раствора в который, кроме ГАМК добавлялось дополнительно 10 мМNaCl(pH доводилась до 7.2, осмолярность до 295 мОсм). Из-за разницы ионных концентраций при аппликации раствора агониста на открытый кончик электрода в нем возникал ток. Рост и затухание этого тока, определялись скоростью обмена растворов на кончике электрода. Это использовалось для рассчета 10-90 % времени обмена между контрольным и раствором агониста на пейче. Время обмена измерялось в конце каждого эксперимента, после того как разрывался пейч. Оно составляло в среднем 0,2 мс, что является удовлетворительным для использованной длительности аппликации (1 мс).
Токи, регистрируемые с outside-outпейчей, полученных с интернейронов и пирамидных клеток, использовались для сравнительного анализа биофизических свойств ГАМКергических рецепторов.