3.3.5 Метаботропные рецепторы группы III опосредуют гетеросинаптическую депрессию по двум различным механизмам

В предыдущих экспериментах нам удалось показать, что величина гетеросинаптической депресии ТПСТ, опосредованной mGluRгруппыIIIзависит от задержки возникновения тестового ТПСТ после активации глутаматергических терминалей. Таким образом, использованный интервал в 100 мс может отражать лишь одну из точек динамики депрессии. Поскольку снижение тестового ТПСТ зависит от активации глутаматергических метаботропных рецепторов, то его длительность должна определяться активацией G-белок зависимых биохимических каскадов внутри клетки. Исходя из этого, мы решили проверить какой будет величина гетеросинаптической депрессии на разных интервалах времени после высвобождения глутамата и насколько долго существует эта депрессия. Для этого мы систематически изменяли интервал между высокочастотной стимуляцией возбуждающих терминалей и тестовым ТПСТ (Рис. 3.3.6а).

Было показано, что гетеросинаптическая депрессия имеет две фазы развития (Рис. 3.3.6б). Обе фазы подавляются при аппликации MSOP (Рис. 3.3.6в), что указывает на участие в них глутаматергических метаботропных рецепторов группы III. Первая фаза регистрировалась на 100 мс после высокочастотной стимуляции и длилась приблизительно 500 мс. Таким образом, это была сравнительно кратковременная депрессия, чтобы быть связанной с G-белок зависимыми механизмами, такими как

Рис. 3.3.6 Двухфазная динамика гетеросинаптической депрессии, опосредованной метаботропными рецепторами группы III

а, Экспериментальный протокол для исследования динамики гетеросинаптической депрессии. Интервал между серией стимулов коллатералей Шаффера (дист.эл. – красные штрихи) и тестовым стимулом (прокс. эл.) систематически варьировался. Контрольный ТПСТ регистрировался также перед каждой стимуляцией глутаматергических коллатералей. б, Динамика гетеросинаптической депрессии ТПСТ после выброса глутамата при стимуляции возбуждающих терминалей (в присутствии антагониста ГАМК_Bрецепторов CGP35548). Наличие двух фаз депрессии указывает на вовлечение различных механизмов. г, Аппликация MSOP (100 µМ) подавляла гетеросинаптическую депрессию при 100 мс и 2 с – принципиальных точках первой и второй фазы депрессии, указывая на то, что обе фазы зависят от активации mGluR группы III.

изменение концентрации цАМФ (Yatani and Brown 1989). Вероятно в данном случае метаботропные рецепторы активируют цАМФ независимые сигнальные пути (Koulen et al. 1999; Schoppa and Westbrook 1997). mGluR группы III находятся внутри синапса в перисинаптической мембране, следовательно, они оптимально расположены для модуляции выброса нейропередатчика с минимальной задержкой. Вероятно, первая фаза гетеросинаптической депресии ТПСТ представляет собой быстрое снижение выброса ГАМК при повышении внеклеточного глутамата. За первой фазой следовала вторая, более длительная фаза депрессии, которая заканчивалась приблизительно к 3,5 секундам. По всей видимости, она отражает активацию цАМФ зависимых биохимических каскадов в клетке.

3.3.6 Метаботропные рецепторы группы III модулируют частоту спонтанных тпст

При исследовании эффекта аппликации L-AP4 на амплитуду вызванных ТПСТ (Рис. 3.3.1а) мы обнаружили также снижение частоты спонтанных ТПСТ (74 9 % от базовой частоты, p<0,03; отмывка 857 %). Эти данные являются дополнительным свидетельством в пользу того, что mGluR группы III модулируют ГАМКергическую передачу в интернейронах. Однако, в этих экспериментах глутаматергические ионотропные рецепторы были блокированы, что не позволяет сделать заключения каким будет суммарный эффект активацииmGluRгруппыIIIна возбудимость интернейронов.

Для ответа на этот вопрос мы исследовали эффект апликации L-AP4 в условиях, когда ни ГАМКергические, ни глутаматергические рецепторы не были блокированы. В качестве внутриклеточного раствора в этих экспериментах был использован раствор с низкой концентрацией ионов хлора (см. Материалы и методы: раствор основанный на Cs-глюконате). При этом, потенциалы реверсии ГАМКергических и глутаматергических токов были различными и мы могли разделить их без использования антагонистов. Мы поддерживали интернейроны в режиме фиксации потенциала на потенциале реверсии для токов ГАМК_Арецепторов (–60 мВ) или на потенциале реверсии для токов AMPA рецепторов (0 мВ). На рисунке 3.3.7а показано, что синаптические токи, полученные при обоих потенциалах фиксации, одинаково снижаются при аппликации L-AP4, что соответствует данным на фармакологически изолированных ТПСТ и ВПСТ (Рис. 3.3.1). Добавление NBQX (10М) почти полностью подавляло синаптические ответы при –60 мВ, но не приводило к значительному эффекту на синаптические токи при 0 мВ. Этот ток, мог быть подавлен пикротоксином (100М) и бикукуллином (10 µМ). Таким образом, нам удалось одновременно исследовать эффект активации метаботропных рецепторов на ГАМКергические ТПСТ и глутаматергические ВПСТ, не подавляя ни один из них фармакологически.

В тех же самых нейронах мы исследовали частоту и амплитуду спонтанных синаптических токов при разных потенциалах фиксации. При базовых условиях частота глутаматергических спонтанных ВПСТ составляла всего лишь 35 7 % от частоты ГАМКергических спонтанных ТПСТ (Рис. 3.3.7б). L-AP4 (50М) снижал частоту сТПСТ, но оказывал незначительный эффект на частоту сВПСТ (Рис. 3.3.7б). Кроме того, L-AP4 значительно снижал среднюю амплитуду ГАМКергических сТПСТ (873 % от базовых значений; p<0,01; отмывка до 915 % от базовых значений) при этом оказывал лишь незначительный эффект на амплитуду глутаматергических сВПСТ (947 %; p=0,5; отмывка 1049 % от базовых значений). Эти результаты указывают на то, что пресинаптические метаботропные рецепторы группы III снижают спонтанные ГАМКергические токи в интернейронах. Другой вариант представления эффекта аппликации L‑AP4 на спонтанные токи показан на рисунке 6в. Частоты сВПСТ и сТПСТ были нормированы к базовой частоте сТПСТ, а затем построена зависимость отношения частот сТПСТ и сВПСТ до и во время аппликации L-AP4. L-AP4 сдвигало это отношение из области доминирования тормозных токов к границе баланса сТПСТ/сВПСТ, за которой следует область доминирования возбуждающих

Рис. 3.3.7 L-AP4 снижает частоту спонтанных ТПСТ, но не ВПСТ в интернейронах

(подписи к рисунку на следующей странице)

а, Вызванные постсинаптические токи (ПСТ), записываемые при потенциалах фиксации 0 мВ и –60 мВ, соответствующих потенциалам реверсии токов, опосредованных ГАМК_АиAMPAрецепторами, соответственно. Над графиком показан использованный протокол изменения потенциала фиксации и оригинальные записи с одного интернейрона (каждая усреднение по 30 последовательным регистрациям). На графике приведены амплитуды ПСТ (среднееС.О.С.) нормированные к средней амплитуде до добавления L-AP4 (n=7). ПСТ, записанные при –60 мВ, блокировались NBQX (10М), что свидетельствует том, что они опосредованы AMPA/каинатными рецепторами. ПСТ, записанные при 0 мВ, не подавлялись NBQX, но блокировались пикротоксином (100М), что свидетельствует о том, что они опосредованы ГАМКергическими рецепторами.б, Частота спонтанных ПСТ (среднееС.О.С.), записанных при 0 и –60 мВ в тех же самых клетках. Частоты сПСТ были нормированы к частоте сТПСТ при 0 мВ до аппликации L-AP4.в, График зависимости средней частоты спонтанных ТПСТ от средней частоты спонтанных ВПСТ, нормированных к базовой частоте сТПСТ. Белый кружок – контроль, черный – аппликация L-AP4. L-AP4 сдвигает соотношение сТПСТ/сВПСТ в сторону повышения возбудимости. пунктирная линия – линия баланса сТПСТ/сВПСТ.

Все данные получены в присутствии APV.*: p<0,05.

токов. Другими словами, активация глутаматергических метаботропных рецепторов группы III делает интернейроны str.radiatum поля СА1 гиппокампа более возбудимыми.