Биотехнологии 2015 Сборник материалов международного конгресса

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

UDC 57.083.3:621.039.75

INTEGRATEDASSESSMENT OF IMMUNOLOGICALMARKERSATACUTE HEMOLYTICUREMIC SYNDROME IN CHILDREN

BurakouskiA.I., Tishkevich M.N., Baiko S.V., SukaloA.V., Karpovich M.V., Karpenko T.A., YastrebovaA.A.

Institute of Bioorganic Chemistry of NASB, Minsk, Belarus 220141, 5/2 Kuprevich Str.

e-mail: [e-mail]

Integrated assessment of immunological markers at acute hemolytic-uremic syndrome in children will optimize approaches to the diagnosis of this disease and, as a consequence, reduce the incidence, severity and frequency of adverse outcomes.

Keywords: hemolytic-uremic syndrome, pediatrics, biomarkers, diagnostics

Today hemolytic-uremic syndrome (HUS) is one of the important medical and social problems of pediatrics. This is indicated by a constant increase in incidence, high probability of mortality, chronization of renal pathology and the lack of specific diagnostic and treatment methods. It is widely accepted the view of the leading role of immune system in the development of major human diseases, most of which are immune-mediated, including HUS. In recent years, the opportunity to detect a wide range of specific biomarkers in serum and urine (procalcitonin, NGAL. β2-microglobulin, IL-18, aldosterone, etc.) was appeared. This significantly expanded the diagnostic potential of laboratories with suspicion on presence of HUS. Determination of the concentration dependences of these indicators will allow to diagnose the pathology in the early period and the level of damage as well as to apply timely curative and rehabilitative measures for the prevention of chronic disease process development. For this purpose the system of combined diagnostic with parallel tests for several markers is offered that will optimize approaches to the diagnosis of this disease and, as a consequence, reduce the incidence, severity and frequency of adverse outcomes at HUS.

УДК 615.011.4

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА SHIGELLA FLEXNERI 2A

Лёдов В.А., Апарин П.Г.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства 115478, Москва, Каширское шоссе, д.24, корп.2

e-mail: [e-mail]

Исследована пирогенность различных структурных вариантов липополисахаридов Shigella flexneri 2а: выявлены переходные закономерности отличающие низкопирогенные об- разцы, как от пирогенных, так и от апирогенных образцов. Ключевые слова: липополисахарид, Shigella flexneri 2а, эндотоксичность, пирогенность.

Липополисахарид (ЛПС) является одной из наиболее гетерогенных по структуре биомоле- кул. Разнообразие структурных вариантов ЛПС Shigella flexneri 2а выражается в разном коли- честве остатков жирных кислот – ацилов в липиде А, наличием или отсутствием ацетильной группы на О-полисахаридной цепи (О-ПС) в положении 3,4 и в разной длине О-ПС цепи [1]. Исследуемые нами образцы, содержали ЛПС S. flexneri 2а с длинной О-ПС цепью, построенной

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	169

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

восновном из 10–15 тетрасахаридных блоков, с короткой О-ПС цепью – по большей частью 1–7 тетрасахаридных блоков и их смеси – от 1 до 15 тетрасахаридных блоков соответственно.

Эндотоксичность является интегральной иммунобиологической характеристикой молекулы ЛПС, определяющая одновременно его способность к индукции врожденного иммунитета так и токсические характеристики биомолекулы. Наиболее чувствительная оценка эндотоксичности ЛПС in vivo возможна в тесте пирогенности. Тест пирогенности на кроликах широко применяется для оценки эндотоксичности вакцин, прежде всего бактериальных и включен в целый ряд иммунологических и международных фармакопей.

Пирогенность определяли при внутривенном введении кроликам 25 нг каждого исследуемого образца на килограмм веса кролика, растворённых в 1 мл изотонического раствора.

Исследуемые образцы, по результатам пирогенной реакции кроликов на их внутривенное введение, можно разделить на 3 группы: пирогенные – ∑Δt ≥ 3°С; низкопирогенные – 1,2°С < ∑Δt < 3°С и апирогенные – ∑Δt ≤ 1,2°С. Апирогенные образцы оценивались в соответствии со стандартами фармакопеи РФ, где вещества признают апирогенными, если суммарное изменение температуры у 3 кроликов после инъекции не превышает 1,2°С и ни у одного из кроликов температура не повышается более, чем на 0,5°С [2].

Разделение опытных образцов на 3 группы позволило выявить переходные закономерности отличающие низкопирогенные образцы, как от пирогенных, так и от апирогенных образцов.

Апирогенные образцы могут содержать длинноцепные слабоацетилированные производные ЛПС S. flexneri 2a, так же как и низкопирогенные.

Таким образом, иммунобиологические характеристики ЛПС S flexneri 2a могут быть существенно модифицированы, что открывает возможность использования данных препаратов

вкачестве протективных иммуногенов.

Наиболее важным с нашей точки зрения представляется факт получения апирогенных образцов ЛПС S. flexneri 2a вследствие химической модификации, удовлетворяющим по этому параметру требования Фармакопеи РФ XII.

1.  Kondakova A.N., Vinogradov E.V., Knirel Y.A., Shekht M.E., Markina A.A., L’vov V.L., Aparin P.G., Linder B. Structure of the oligosaccharide region (core) of the lipopolysaccharides of Shigella flexneri types 2a and 5b//Rus. J. Bioorganic Chem. 2010. Vol. 36. № 3. P. 396–399.

2.  Государственная фармакопея РФ XII издание, часть 1. М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. 704 с.

CORRELATION BETWEEN STRUCTURES OF LIPOPOLYSACCHARIDEAND THE PYROGENICITY, FOR EXAMPLE LIPOPOLYSACCHARIDE SHIGELLA FLEXNERI 2A

Ledov V.A.,Aparin P.G.

115578, Moscow, National Research Center Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency

(FMBA of Russia) e-mail: [e-mail]

Investigation of pyrogenicity of different structural variants of Shigella flexneri 2а lipopolysac-

charides (LPS) revealed the transition regularity distinguishing low-pyrogenic samples of LPS from

pyrogenic and apyrogenic LPS.

Keywords: lipopolysaccharide, Shigella flexneri 2а, endotoxicity, pyrogenicity.

170	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

Lipopolysaccharide (LPS) is one of the most heterogeneous structure of biomolecules. A variety of structural variants of Shigella flexneri 2a LPS is expressed in a different amount of fatty acid residues – acyl groups in lipid A, in the presence or absence of acetyl groups at the O-polysaccharide chain (O-PS) at a position 3,4 and in varying the length O-PS chain [1]. We investigated samples of S. flexneri 2a LPS with a long O-PS chain consisting of 10–15 tetrasaccharide units, short O-PS chain consisting of 1–7 tetrasaccharide units or mixtures thereof consisiting of 1–15 tetrasaccharide units.

Endotoxicity is an integral immunobiological feature of LPS molecule, which determines both its ability to induce innate immunity and toxic characteristics of this biomolecule. The pyrogenicity test is the most sensitive assessment of LPS endotoxicity in vivo. Pyrogenicity test on rabbits is widely used to evaluate of vaccines endotoxicity, especially bacterial ones, and included in a number of immunological and international pharmacopoeia.

Pyrogenicity was determined when administered intravenously to rabbits 25 ng of each sample per kilogram body weight of rabbit, dissolved in 1 ml an isotonic solution.

The test samples by the results of pyrogenic reaction in rabbits in response to its intravenous administration can be divided into three groups: pyrogenic – ΣΔt ≥ 3°C; low-pyrogenic – 1.2°C <ΣΔt <3°C and apyrogenic – ΣΔt ≤ 1,2°C. Apyrogenic samples were evaluated in accordance with the standarts of the pharmacopoeia of the Russian Federation (RF) whereby substance is non-pyrogenic if the total change in temperature at the three rabbits after injection does not exceed 1,2°C and none of the rabbits’ temperature does not rise by more than 0,5°C [2].

Separation of test samples into 3 groups revealed the transitional regularity distinguishing lowpyrogenic samples of LPS from pyrogenic and apyrogenic LPS.

Apyrogenic as well as low-pyrogenic samples can contain long-(O-PS)-chain weakly-acetylated derivatives of LPS S. flexneri 2a.

Thus immunobiological characteristics of S. flexneri 2a LPS can be substantially modified, allowing the use of these preparations as protective immunogens.

Fromour point of viewthemost importantisthefactof obtainingthe apyrogenic samplesof S. flexneri 2a LPS due to chemical modification to meet the requirements for this parameter Pharmacopoeia RF XII.

УДК 577.112, 577.181, 577.27

АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ КАК МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФАКТОРЫ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА Овчинникова Т.В.

Федеральное агентство научных организаций (ФАНО России) Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН), Москва, Россия 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

e-mail: [e-mail]

Антимикробные пептиды (АМП) – эволюционно древние молекулярные факторы системы врожденного иммунитета, играющие ключевую роль в реализации защитных механизмов рас- тений и животных. АМП выполняют как прямую эффекторную (антибиотическую, цитотокси- ческую), так и регуляторную (иммуномодулирующую) функции. Эффекторная функция АМП объясняется, как правило, их мембранотропными свойствами. Некоторые АМП способны про- никать через мембрану и воздействовать на внутриклеточные мишени. Исследование механиз-

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	171

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

мов действия природных АМП показывает их роль в качестве эндогенных иммуномодуляторов и открывает путь к пониманию закономерностей функционирования системы врожденного иммунитета.

Ключевые слова: антимикробные пептиды, врожденный иммунитет.

Антимикробные пептиды (АМП) – эволюционно древние молекулярные факторы системы врожденного иммунитета, играющие ключевую роль в реализации защитных механизмов растений и животных. АМП выполняют как прямую эффекторную (антибиотическую, цитотоксическую), так и регуляторную (иммуномодулирующую) функции. Эффекторная функция АМП объясняется, как правило, их мембранотропными свойствами. Избирательность действия АМП может быть обусловлена различиями в липидном составе и трансмембранном потенциале мембран организма-хозяина и клеток-мишеней. Установлено специфичное взаимодействие некоторых пептидов с компонентами клеточных мембран патогенов. Некоторые АМП способны проникать через мембрану и воздействовать на внутриклеточные мишени. Наряду с антибиотической активностью АМП проявляют другие биологические свойства, в том числе стимулируют хемотаксис нейтрофилов, макрофагов, дендритных клеток и дегрануляцию тучных клеток; влияют на индукцию синтеза цитокинов, выброс хемокинов и гистамина; участвуют

врегуляции регенерации тканей и ранозаживлении; увеличивают проницаемость сосудов и стимулируют ангиогенез; связывают и нейтрализуют липополисахарид и другие токсины; ингибируют АКТГ-опосредованный стероидогенез и МСГ-индуцированный синтез альдостерона в надпочечниках. Исследование механизмов действия природных АМП показывает их роль

вкачестве эндогенных иммуномодуляторов и открывает путь к пониманию закономерностей функционирования системы врожденного иммунитета. Комплексные исследования, проводимые в Учебно-научном центре ИБХ РАН, направлены на изучение механизмов антибиотического, противоопухолевого и иммуномодулирующего действия природных АМП и их аналогов. Объектами изучения являются АМП растительного и животного происхождения. Целью проводимых исследований является создание прототипов новых лекарственных средств на основе АМП и биотехнологической платформы для их получения.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда (соглашение № 14-50-00131).

UDC 577.112, 577.181, 577.27

ANTIMICROBIALPEPTIDESAS EFFECTOR MOLECULES OF INNATE IMMUNE SYSTEM T.V.Ovchinnikova

M.M. Shemyakin & Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Miklukho-Maklaya str. 16/10, 117997 Moscow, Russia; [e-mail]

Antimicrobial peptides (AMP) – evolutionarily ancient effector molecules of innate immune

system, playing a key role in protective mechanisms of plants and animals. AMP accomplish a di-

rect effector (antibiotic, cytotoxic) and regulatory (immunomodulatory) functions. Effector function

ofAMPis explained, as a rule, by their membrane-destabilization properties. Selectivity of AMPmay

be related to differences in lipid composition of the membrane and transmembrane potential of host

and target cells. Some AMP specifically interact with the components of cell membranes of patho-

gens. Other AMP can penetrate the membrane and act on intracellular targets. Molecular insight into

mechanisms of action of natural AMP throws light on their role as endogenous immunomodulatory molecules and opens the way to better understanding of innate immune system.

172	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

Keywords: antimicrobial peptides, innate immunity

Antimicrobial peptides (AMP) – evolutionarily ancient effector molecules of innate immune system, playing a key role in protective mechanisms of plants and animals. AMP accomplish a direct effector (antibiotic, cytotoxic) and regulatory (immunomodulatory) functions. Effector function ofAMPis explained, as a rule, by their membrane-destabilization properties. Selectivity of AMPmay be related to differences in lipid composition of the membrane and transmembrane potential of host and target cells. Some AMP specifically interact with the components of cell membranes of pathogens. Other AMP can penetrate the membrane and act on intracellular targets. Along with antibiotic activity, AMP exhibit other biological properties, including stimulation of neutrophils, macrophages, and dendritic cells chemotaxis and mast cell degranulation; induction of cytokine synthesis and chemokines or histamine release; regulation of wound healing and tissue regeneration; increase of vascular permeability and promotion of angiogenesis; neutralization of LPS and other toxins; inhibition of ACTH-mediated steroidogenesis and MSG-induced synthesis of aldosterone in the adrenal glands. Molecular insight into mechanisms of action of natural AMP throws light on their role as endogenous immunomodulatory molecules and opens the way to better understanding of innate immune system. Comprehensive studies conducted in the Science-Educational Center of M.M.Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, aimed at ekucidation of molecular mechanisms of antibiotic, cytotoxic, and immunomodulatory action of natural plant and animal AMP and their analogs.An aim of this study is the development of new drugs based on AMPand their biotechnology production.

The work is supported by the Russian Science Foundation (the agreement No. 14-50-00131).

УДК 615.074

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗУ МАРКЕРОВ БАКТЕРИАЛЬНОГО ВОСПАЛЕНИЯ Серебренникова К.В.1, Самсонова Ж.В.1,2, Осипов А.П.2

1Химический факультет, МГУ им. М.В.Ломоносова, 119991  Москва, Ленинские горы, дом 1, строение 11

2Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС», 119049  Москва, Ленинский проспект, 4

email: [e-mail]

Разработан экспресс-метод определения прокальцитонина в кровина основе принципа латерального проточного иммуноанализа. Описана возможность использования квантовых точек в качестве метки с целью разработки систем мультианализа.

Ключевые слова: прокальцитонин; наночастицы золота; квантовые точки.

В настоящее время одной из актуальных проблем инфекционной диагностики является дис- криминация процессов бактериального или вирусного заражения организма. Одним из новых перспективных маркеров бактериальных инфекций является сывороточный белокпрокальцито- нин. В норме концентрация циркулирующего в крови человека прокальцитонина определяется на уровне 0,01 нг/мл, а при тяжелых бактериальных инфекциях она увеличивается до 20 и даже 200 нг/мл. Раннее и высокоспецифичное увеличение уровня прокальцитонина в ответ на системную воспалительную реакцию различного генеза и сепсис обеспечивает преимущество данного диагностического метода по сравнению с другими, такими, например, как определение

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	173

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

интерлейкинов. Традиционными методами анализа белков в сыворотке являются иммунохимические методы с использованием ферментных, флуоресцентных и других типов меток, однако данные методы трудоемки, требуют специального дорогостоящего оборудования и наличия квалифицированного персонала. На практике часто возникает необходимость проведения анализаво внелабораторных условиях. С этой целью нами былразработанэкспресс-метод определения прокальцитонина в кровина основе принципа латерального проточного иммуноанализа, основными преимуществами которого являются экспрессность ипростота в использовании.

В качестве метки применялись наночастицы коллоидного золота. В процессе работы были получены и охарактеризованы образцы наночастиц золота различных размеров, получены конъюгаты со специфическими моноклональными антителами против прокальцитонина и разработаны методики проведения анализа. Для сравнительной оценки полученных результатов по определению прокальцитонина в сыворотке и цельной крови использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа.

Также в работе была изучена возможность использования квантовых точек в качестве меток для разработки систем латерального проточного иммуноанализа. Основным достоинством квантовых точек по сравнению с органическими флуорофорами является возможность управления цветом их флуоресценции путем изменения размера нанокристалла при использовании источника света с одной длиной возбуждения. Были синтезированы образцы квантовых точек с разным размером ядра и внешней оболочки, охарактеризованы их спектральные и флуорес - центные свойства. Изучены различные методы модификации поверхности квантовых точек для получения ковалентных конъюгатов с антителами различной специфичности для разработки

систем мультианализа.

NEWAPPROACHES TOAN EXPRESSANALYSIS OFTHE MARKERS OF BACTERIAL INFLAMMATION

Serebrennikova K.V.1, Samsonova J.V.1,2, OsipovA.P.2

1Chemistry Department, Moscow State University, 119991  Moscow, GSP-1,11 Leninskiye Gory

2National University of Science and Technology “MISIS”, 119049, Moscow, Leninskiyprospekt 4

email: [e-mail]

The expressmethod for the procalcitonin detection in blood, which is based on the lateral flow immunoassay, was developed. An opportunity of the application of quantum dots as labels to develop multianalysis systems was described.

Keywords: procalcitonin; gold nanoparticles; quantum dots.

The discrimination of processes of bacterial or viralinfection of the body is currently one of the

actual problems of diagnostics of infectious diseases. Serum protein, procalcitonin is one of the new

promising markers of bacterial infections. The concentration of procalcitonin circulating in the blood

of healthy individuals is determined at a level of0,01 ng/ml, but in the case of severe bacterial infec-

tions it increases up to 20 ng/ml or even 200 ng/ml. An early and highly specific increase in the pro-

calcitonin level in response to a systemic inflammatory reaction of various genesis and sepsis diagnos

is provides an advantage of this diagnostic method compared too thers, such as, for example, the detection of interleukins. The traditional methods of protein analysis in serum are immunochemical

174	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

methods with the use of enzymatic, fluorescent and other types of labels. However, such methods are laborious, and require the use of a special expensive equipment and availability of skilled staff. It is often necessary to carry out analyses in field conditions in practice. For this purpose, the expressmethod for the procalcitonin detection in blood, which is based on the lateral flow immunoassay, was developed. The main advantages of this method are rapidity and ease of use.

The nanoparticles of colloidal gold were used as labels. The samples of gold nanoparticles of different sizes were obtained and characterized during this study. The conjugates with specific monoclonal antibodies against procalcitonin were obtained, and new methods of analysis were developed. To estimate comparatively the obtained results on the procalcitonin detection in serum and hole blood the ELISA method was applied.

In addition, an opportunity of the application of quantum dots as labels for the lateral flow immunoassay system development was studied. The main advantage of quantum dots compared to organic fluorophores is anability to control the color of their fluorescence by changing the size of nanocrystal when using a light source with a definite length of excitation. The samples of quantum dots with various core sizes and external shells were synthesized; their spectral and fluorescence properties were characterized. The different methods of the quantum dots surface modification were studied to obtain covalent conjugates with antibodies of various specificity for the development of multianalysis systems.

УДК 57.083.3:616-006

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ В ОПРЕДЕЛЕНИИ HER2 СТАТУСА ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Ястребова А.А., Бураковский А.И., Карпенко Т.А., Тишкевич М.Н., Карпович М.В.,

Прохорова В.И., Красный С.А., Шишло Л.М.

ГНУ «Институт биоорганической химии НАН Беларуси», Минск, Беларусь 220141, ул. Купревича 5/2

e-mail: [e-mail]

Разработка иммуноферментного подхода в определении HER2 статуса при раке молочной железы предоставит точный количественный критерий степени выраженности патологического процесса и эффективности проводимой терапии.

Ключевые слова: HER2, рак молочной железы, ИФА.

В доклинических и клинических исследованиях показано, что гиперэкспрессия HER2 имеет ключевое значение в онкотрансформации и онкогенезе ряда заболеваний, в частности, рака

молочной железы (РМЖ), а также коррелирует с рядом неблагоприятных факторов прогноза, таких как размер опухоли, степень злокачественности и лекарственная резистентность к цито- токсическим агентам. Это обосновывает целесообразность создание новых методов тестиро- вания данного аналита. В качестве альтернативы используемым на сегодняшний день методам (иммуногистохимия и флуоресцентная гибридизация in situ) выступают иммунохимические аналитические тест-системы, в частности, на основе принципов иммуноферментного анализа (ИФА), сочетающего в себе высокую чувствительность и специфичность, что выдвигает его в ряд приоритетных методов современного иммуноанализа.

Принимая во внимание тот факт, что сегодня наблюдается четко сформированная тенден - ция к росту числа случаев заболевания РМЖ, укрепление и оптимизация диагностических и лечебных стратегий является единственно возможным направлением дальнейших действий.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	175

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

Разработка метода ИФА по определению HER2 статуса у женщин с РМЖ позволит с высокой точностью и специфичностью обнаруживать наличие гиперэкспрессии HER2 и, тем самым, диагностировать доклинические стадии РМЖ, а также предоставит исследователям точный количественный критерий контроля степени выраженности патологического процесса, эффективности проводимой терапии и прогнозирования развития и возникновения рецидивов заболевания.

UDC 57.083.3: 616-006

ENZYME IMMUNODETECTION IN HER2 STATUS DETERMINATIONAT BREAST CANCER

Yastrabava H.A., BurakouskiA.I., Karpenka T.A., Tsishkevich M.M., Karpovich M.V., Prokharava V.I., Krasnyy S.A., Shyshlo L.M.

Institute of Bioorganic Chemistry of NASB, Minsk, Belarus, 220141, 5/2 Kuprevich Str.

e-mail: [e-mail]

Development of enzyme immunoassay approach in HER2 status determination at breast cancer provides accurate quantitative criterion of the pathological process severity and the effectiveness of the therapy.

Keywords: HER2, breast cancer, ELISA.

In preclinical and clinical researches it have shown that HER2 overexpression has the key role in oncogenesis and oncotransformation of several diseases, in particular at breast cancer (BC), and correlates with negative prognostic factors such as tumor size, tumor grade and drug resistance to cytotoxic agents. This proves the advisability of new methods creation for the analyte testing. Immunochemical analytical test systems are an alternative to currently used methods (such as immunohistochemistry and fluorescent in situ hybridization). In particular, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) combines high sensitivity and specificity, which puts it in a number of priority methods of modern immunoassay.

Taking into account the fact that today there is a clearly defined trend of BC cases increasing, strengthening and optimization of diagnostic and therapeutic strategies is the only possible way forward.The development of ELISAapproach for the HER2 status determination in women with BC will allow with high accuracy and specificity to detect the presence of HER2 overexpression and thereby diagnose the early stages of BC. It provides researchers with quantitative criterion to control the severity of the pathological process and the effectiveness of the therapy and disease recurrence.

176	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ РЕЛИЗ-АКТИВНЫХ ФОРМ АНТИТЕЛ К ИНТЕРФЕРОНУ-ГАММА МЕТОДОМ ИФА Дон Е.С., Греченко В.В., Похил С.Э., Борщева А.А., Никифорова М.В., Тарасов С.А.

ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг», Москва, Россия. 127473, Москва, 3-й Самотечный пер, д 9.

e-mail: [e-mail]

Разработана методика ИФА для контроля качества препаратов на основе релиз-активной формы антител к интерферону-гамма. Показано, что присутствие релиз-активной формы антител к интерферону-гамма приводит к изменению константы аффинности антител к интерферону гамма по сравнению с контролем.

Ключевые слова: релиз-активные антитела; иммуноферментный анализ; интерферон-гам-

ма.

Препараты, содержащие релиз-активную форму антител давно и с успехом используются в лечении различных заболеваний, однако вопрос разработки новых методик контроля качества таких лекарственных средств не теряет свою актуальность. Было показано, что релизактивная форма антител к интерферону-гамма (РА Ат к ИФНγ) может оказывать влияние на конформационные характеристики своей фармакологической мишени – ИФНγ, поэтому для количественного определения активности РА Ат к ИФНγ был выбран метод ИФА. В качестве особенности методики в пробоподготовку добавлен этап преинкубации моноклональных антител (мАт) к ИФНγ с раствором РА Ат к ИФНγ (раствор лактозы, насыщенной РА Ат к ИФНγ, в фос- фатно-солевом буфере) или с контролем (та же серия интактной лактозы в фосфатно-солевом буфере). Точность, воспроизводимость, линейность, специфичность и робастность методики подтверждены в ходе работы с использованием различных серий препарата Анаферон детский, действующим веществом которого является РА Ат к ИФНγ. Препарат, изменяя конформацию молекулы ИФНγ, статистически значимо по сравнению с контролем изменял константу аффинности мАт к ИФНγ.

UDC 59.083

DEVELOPMENT THEACTIVITYASSAY FOR RELEASE-ACTIVEANTIBODIES TO INTERFERON-GAMMABY ELISA

Don E.S., Grechenko V.V., Pokhil S.E., Borshcheva А.А., Nikiforova M.V., Tarasov S.А.

OOO „NPF „Company Materia Medica Holding“, Moscow, Russia 3-rd Samotechny per, 9, 127473 Moscow, Russia

e-mail: [e-mail]

ELISAtechnique for quality control of drugs based on release-active antibodies to interferon-gam- ma was developed. It was shown that the presence of release-active antibodies to interferon-gamma leads to alteration in the affinity constant of antibodies to interferon-gamma in comparison with the presence of the control. Keywords: release-active antibodies; ELISA; interferon-gamma.

Despite release-active forms antibodies-based drugs successfully use in treatment for various diseases for a long time, the question of development of the new quality controls techniques for such medicines is still relevant in pharmaceutical industry. It was shown that release-active form

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	177

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

of antibodies to interferon-gamma (RAAbs to IFNγ) may influence the conformation characteristics of its pharmacological target – IFNγ, so for the quantitative assessment of RAAbs to IFNγ activity ELISA approach was chosen. As an assay feature the stage of pre-incubation of monoclonal antibodies to IFNγ with RA Abs to IFNγ solution (solution of lactose treated by RA Abs to IFNγ in phosphate buffered saline) or with control (the same lot of intact lactose in phosphate buffered saline) was added. Accuracy, precision, linearity, specificity and robustness of the assay were confirmed during the work using different lots of Anaferon for children, drug which active substance is RAAbs to IFNγ. Anaferon for children by impact on the IFNγ conformation statistically significant (in comparison with control) changed the affinity constant of monoclonal Abs to interferon-gamma.

УДК 577.112.083

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ТРЕХ ИЗОФОРМ ЛИПИДТРАНСПОРТИРУЮЩЕГО БЕЛКА ЧЕЧЕВИЦЫ Финкина Е.И., Богданов И.В., Стукачева Е.А., Мельникова Д.Н., Овчинникова Т.В.

Федеральное агентство научных организаций (ФАНО России) Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН), Москва, Россия 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

e-mail: [e-mail]

Показано,чтоструктурытрехизоформLTPчечевицыLc-LTP1–3стабилизированычетырьмя дисульфидными связями и содержат a-спиральные участки. Продемонстрировано, что все три LTP с приблизительно одинаковой эффективностью связывают жирные кислоты и ингибируют рост фитопатогенных микроорганизмов, имеют схожие с аллергенными LTPиммунологические свойства, но Lc-LTP3 характеризуется менее выраженной иммунореактивностью.

Ключевые слова: липид-транспортирующие белки; изоформы; чечевица; аллерген; перекрестная реактивность; гетерологичная экспрессия; антимикробная активность; связывание липидов.

Известно, что гены, кодирующие липид-транспортирующие белки растений (LTP), организованы в мультигенные семейства. Множественные изоформы LTP из одного растения имеют различные свойства и, как полагают, могут выполнять различные функции. Изоформы аллер - генных LTP, как правило, характеризуются разной иммунореактивностью. Изучение структур- но-функциональных и иммунологических свойств изоформ LTP является необходимым этапом на пути исследования функциональной роли отдельных представителей данного класса белков и создания гипоаллергенных вариантов основных аллергенов, предназначенных для проведе-

ния аллерговакцинации.

Ранее нами была охарактеризована одна из изоформ LTP чечевицы, названная Lc-LTP2.

Данный белок обладает антимикробной активностью и способностью связывать липиды, а так-

же является основным аллергеном чечевицы, зарегистрированным нами в международной базе

данных IUIS под аббревиатурой Len c 3.

Для проведения сравнительного исследования структурно-функциональных и иммунологи-

ческих свойств изоформ LTP чечевицы был разработан биотехнологический способ получения

трех белков Lc-LTP1–3 в клетках E. coli. Рекомбинантные белки экспрессировали в составе ги-

бридных белков и выделяли из растворимой или нерастворимой клеточных фракций.

Несмотря на существенные различия в аминокислотных последовательностях трех изоформ LTPчечевицы, значительной разницы в структурно-функциональных свойствах белков выявле-

178 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015