Биотехнологии 2015 Сборник материалов международного конгресса

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

Production of native and modified proteins in cells of recombinant Escherichia coli strains is a major stage in biotechnologies of manufacturing diverse commercially valuable products. Despite relative facility of manipulations with E. coli cells, many proteins are produced in the recipient organism as inactive water-insoluble protein aggregates. This obstacle may be largely overcome by engineering chimeric complexes comprising partner proteins in addition to the target protein to increase solubility of the latter [1, 2].

Aim of this study was to design a set of unified vectors encoding various partner proteins enhancing solubility of the target protein.

Performed experiments resulted in a kit of uniform linearized vectors carrying some genes of partner proteins (glutathione-S-transferase, disulphide isomerase, disulphide oxidoreductase, N-utilizing substance A, thioredoxin) and leader sequences of bacterial proteins (Pseudomnas aeruginosa pelB and azurin) suitable for futher studies aiming to improve solubility of the target proteins. All vectors available on 3ʹ and 5ʹpolydeoxynucleotide ends of DNA chain contain identical nucleotide sequences allowing to insert gene coding for the target protein into the vectors by ligase-independent cloning technique.

References

1.  Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study // N.S. Berrow., K. Bussow, Coutard B. et al. //Acta Crystall. Sect. D Biol. Crystall. 2006. Vol. 62. P. 1218–1226.

2.  Chambers S.P., Swalley S.E.Designing experiments for high-throughput protein expression // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 498. P. 19–29.

УДК 615.032.13

ЛИПОСОМАЛЬНЫЕ ФОРМЫ ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТЫ: ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ НА АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ Щелконогов В.А.1, Сорокоумова Г.М.1, Баранова О.А.2, Чеканов А.В.2, Бабушкин А.В.2, Клочкова А.В.2, Соловьева Э.Ю.2, Швец В.И.1

1Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В.Ломоносова, Москва, Россия 119571, Москва, пр. Вернадского, д.86

e-mail: [e-mail]

2Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пиргова Минздрава России, Москва, Россия

Подобраны условия получения липосомальных форм липоевой кислоты, приводящие к формированию наночастиц размером 210 нм, с эффективностью включения субстанции 85% и об- ладающих пролонгированным действием. Показана антиагрегационная активность липоевой кислоты в составе липосом. Ключевые слова: липосомы, липоевая кислота, тромбоциты, арахидоновая кислота.

Данная работа посвящена актуальной проблеме улучшения биодоступности трудно раство- римого в воде антиоксиданта – альфа-липоевой кислоты (ЛК) – путем солюбилизации её липо- сомами, для последующего применения, полученной липосомальной формы ЛК, в комплексной терапии ишемии головного мозга.

Входе работы липосомы получали методом экструзии. Эффективность включения ЛК

влипосомы определяли спектрофотометрически в зависимости от таких факторов как: рН

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	119

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

среды водных растворов, используемых для получения мультиламеллярных везикул; количе - ства липидов, взятых для создания липосом; липидного состава липосом и исходного коли - чества ЛК.

В результате работы были подобраны оптимальным условия, приводящие к получению стабильных липосом размером 210 нм с эффективностью включения ЛК в липосомы 85% и характеризующиеся медленным высвобождением субстанции из наночастиц.

ИсследованиевлияниялипосомальнойформыЛКнаагрегациютромбоцитовчеловека,индуцированную арахидоновой кислотой (АК) и аденозиндифосфатом показало, что липосомы с ЛК (С = 1000µМ) ингибируют агрегацию тромбоцитов, вызванную АК, на 85%. Предполагается, что после дополнительных исследований липосомальную форму ЛК возможно рассматривать как новый препарат в комплексной терапии ишемии мозга.

LIPOSOMALFORMS OF LIPOICACID: PREPARATIONAND STUDYING OF EFFECT ON PLATELETAGGREGATION

Shchelkonogov V.A.1, Sorokoumova G.M.1, Baranova O.A.2, ChekanovA.V.2, BabushkinA.V.2, KlochkovaA.V.2, Solovieva E.Yu.2. Shvets V.I.1

1M.V. Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technologies, 119571, Moscow, Vernadsky prospectus, 86.

e-mail: [e-mail]

2Pirogov Russian National Research Medical University (RNRMU) Ostrovitianov str. 1, Moscow, Russia, 117997

The conditions of obtaining liposomal forms of lipoic acid, leading to the formation of nanoparticles with a size of 210 nm, with the efficiencyof inclusion of a substance at 85%, and with prolonged action were selected. Antiplatelet activity of liposomal forms lipoic acid were shown.

Keywords: liposomes, lipoic acid, platelet, arachidonic acid.

This work is devoted to an actual problem of improvement of bioavailability of difficult soluble antioxidant in water – alpha lipoic acid (LA) – by a solubilization it liposomes, for the subsequent application, the received liposomal form of LA, for the treatment of cerebral ischemia.

In course of the study liposomes were prepared by extrusion. The efficiency of LA inclusion in liposomes was determined spectrophotometrically depending on such factors as: pH of aqueous solutions used for preparing multilamellar vesicles (MLV) ; the amount of lipids taken to obtain liposomes; the lipid composition of liposomes and the initial amount of LA.

As a result of the study the optimal leading to production of a stable liposomes with size 210 nm, with the efficiency of inclusion LA in liposomes 85%, and characterized by slow releaseof substance from the nanoparticles were found.

The investigation of effect liposomal form of LAon the human platelet aggregation induced by ar-

achidonic acid and adenosine diphosphate showed that liposomes with LA (C = 1000μM ) inhibit

platelet aggregation induced by arachidonic acid, 85%. It is supposed that after additional researches liposomal form of LA may be considered as a new drug in complex treatment of cerebral ischemia.

120	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

УДК 547.426.2

РАЗРАБОТКА НОВЫХ КОНЪЮГАТОВ ГЛИЦЕРОЛИПИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 3’-АЗИДО-3’-ДЕЗОКСИТИМИДИНА (AZT) И АМИНОКИСЛОТ

Шульга Н.В., Шастина Н.С.

Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова, Россия 119571, Москва, проспект Вернадского, д.86

e-mail: [e-mail]

С использованием Н-фосфонатного подхода осуществлен синтез новых глицеролипидных производных AZT, конъюгированных по фосфорному центру с остатками аминокислот. Исследование их свойств в модельных буферных и клеточных системах позволит найти пролекарственные соединения с высокой ингибиторной активностью для создания эффективных анти-ВИЧ-препаратов.

Ключевые слова: 3’-азидо-3’-дезокситимидин (AZT), пролекарства, глицеролипиды, анти- ВИЧ-активность

Несмотря на эффективность нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы, в том числе AZT, в терапии ВИЧ, данные препараты имеют ряд недостатков: незначительную мембранотропность, низкую биодоступность из-за первичной деградации в печени, образование резистентных вирусных штаммов. Одним из подходов в преодолении этих проблем является создание их пролекарственных соединений на основе 1,3-диацилглицеринов, что может привести к улучшению доставки препаратов к клеткам-мишеням.

Ранее в нашей лаборатории были разработаны конъюгаты AZT и производных 1,3-диа- цилглицеринов с различными остатками жирных кислот, в которых связывание с анти-ВИЧ- нуклеозидом осуществлялось с помощью функциональных фосфорных связей. Ряд таких соединений проявил высокую антивирусную активность в условиях in vitro. Задачей представленной работы являлся синтез конъюгатов липофильных производных AZT этого ряда с аминокислотами. Маскировка фосфорного центра введением остатка аминокислоты повысит мембранотропность препарата и обеспечит доставку в клетку его монофосфатной формы.

Изучение свойств синтезированных амидофосфатных соединений даст возможность создать препараты с высокой анти-ВИЧ-активностью.

UDC 547.426.2

DEVELOPMENT OF NEW CONJUGATES OF 3’-AZIDO-3’-DEOXYTHYMIDINE (AZT) GLYCEROLIPIDIC DERIVATIVESANDAMINOACIDS

Shul’ga N.V., Shastina N.S.

Moscow State University of Fine Chemical Technology M.V.Lomonosov Russia 119571, Moscow, Vernadsky prospect, 86

e-mail: [e-mail]

Using the H-phosphonate approach the synthesis of new glycerolipidic derivatives of AZT, conju- gated with amino acid residues on the phosphoric center was accomplished. The study of their proper- ties in model buffer and cell systems will enable to search the prodrugs with high inhibitory activity to develop the effective anti-HIV drugs. Keywords: 3’-azido-3’-deoxythymidine (AZT), prodrugs, glycerolipids, anti-HIV activity

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	121

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

Despite the effectiveness of nucleoside reverse transcriptase inhibitors includingAZT in the treatment of HIV, these drugs have a number of disadvantages: low membranotropic properties, poor bioavailability due to the primary degradation in the liver and resistant viral strains formation. One approach to overcome these problems is to create their prodrugs based on 1,3-diacylglycerols which may lead to improved drug delivery to target cells.

Previously, we have developed conjugates of AZT and derivatives of 1,3-diacylglycerols with different fatty acid residues in which anti-HIV nucleoside was linked through the functional phosphorus linkages. Series of these compounds showed high antiviral activity in vitro conditions. The aim of the present work was the synthesis of conjugates of amino acids with AZT lipophilic derivatives of this series. Masking phosphorus center by the introduction of amino acid residue will enhance drug membranotropic properties and ensure delivery its monophosphate form into the cell.

Studies of the properties of the synthesized phosphoramidate compounds will give the opportunity to create the drugs with high anti-HIV activity.

УДК 57.083.3:577.175.534

СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ ФЕРМЕНТОВ БИОСИНТЕЗА И МЕТАБОЛИЗМА ХОЛЕСТЕРИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ

Струшкевич Н.В., ГилепA.A., ПаркХ-В., Усанов С.А.

Государственное научное учреждение «Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси», Минск, Беларусь 220141, Минск, ул. академика В.Ф.Купревича, д.5, корп.2,

e-mail: [e-mail]

Получены данные, которые дают представления об организации активного центра цитохрома Р450 и объясняют механизм взаимодействия холестерина с амино-кислотными остатками активного центра цитохромовP450, метаболизирующих холестерин.

Ключевые слова: ЦитохромP450 (CYP), холестерин

ДлявыявленияструктурныхдетерминантмолекулыцитохромаР450,определяющихстерео-и региоселективностьокисленияхолестеринаиегопроизводных,мыразрешиликристаллическую структуру рекомбинантных гемопротеидов человека – CYP2R1 (витамин D3 25-гидроксилаза), CYP7A1(холестерин7α-гидроксилаза),CYP7B1(оксистерол7α-гидроксилаза),CYP11A1(холе- стерин-десмолаза), CYP11B2 (альдостерон-синтаза) иCYP51A1 (ланостерин 14α-деметилаза), участвующих в биосинтезе и метаболизме холестерина, в свободной и субстрат-связанной формах. Особый интерес уделен митохондриальным гемопротеидам семейства CYP11 и струк-

турным аспектам комплекса цитохрома P450с промежуточным переносчиком электрона – фер-

редоксином, для установления молекулярного механизма межбелкового переноса электронов

от железо-серусодержащего кластера Fe2-S2на железо гема. Впервые будет представлена про-

странственная структура CYP11B2 (альдостерон-синтаза человека) в комплексе с субстратом

и ингибитором. На основе полученных данных предлагается модель альдостерон-синтазы, ко-

торая предполагает высокую гибкость ряда аминокислот вне активного центра. Полученные

данные дают представления об организации активного центра цитохрома Р450 и объясняют

механизм взаимодействия холестерина с амино-кислотными остатками активного центра ци- тохромов P450, метаболизирующих холестерин.

122	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

STRUCTUREAND FUNCTION OF ENZYMES FOR CHOLESTEROLDERIVATIVES BIOSYNTHESISAND METABOLISM

Strushkevich N.V., GilepA.A., Park HEE-WON, Usanov S.A.

Institute of Bioorganic Chemistry NASB, Minsk, Belarus 220141, Minsk, Kuprevicha str. 5/2

e-mail: [e-mail]

The data obtained shed light on structural organization of the hemeprotein active site and allow explain the intrinsic mechanism of cholesterol interaction with the amino acid residues of the active site of cholesterol metabolizing cytochrome P450’s and determine the molecular mechanism of stereospecificity of steroid hydroxylation.

Keywords: cytochrome P450 (CYP), cholesterol

There are 57 CYP genes in human genome expressing hemeproteins with a wide varieties of functions, classified like all CYPs according to the sequence comparisons where families share similarity more than 40% and subfamilies > 55%. The clinical relevance of cytochrome P450s is in its central role in drug metabolism in human organs and tissues as well as outstanding role that hemeproteins play in biosynthesis of low molecular weight bioregulators such as steroid hormones, bile acids and vitamins. Any abnormalities in functioning of cytochrome P450 enzymes result in severe diseases or uncontrolled function of organs and tissues.

To determine the structural determinants that govern the stereo-specific hydroxylation of cholesterol and its derivatives, we determined the crystal structure of human recombinant CYPs 2R1 (vitamin D3 25-hydroxylase), 7A1 (cholesterol 7α-hydroxylase), 7B1 (oxysterol 7α-hydroxylase), 11A1 (cholesterolside chain cleavage),11B2(aldosterone synthase)and51A1(lanosterol14α-demethylase) involved mostly in cholesterol metabolism in ligand-free and ligand-bound forms.

The data obtained shed light on structural organization of the hemeprotein active site and allow explain the intrinsic mechanism of cholesterol interaction with the amino acid residues of the active site of cholesterol metabolizing cytochrome P450’s and determine the molecular mechanism of stereospecificity of steroid hydroxylation.

УДК 615.33(076.5) (075.8)

СОЗДАНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА Воронина Е.В.1, Серегин Ю.А.1, Литвинова Н.А.1, Швец В.И.2, Шукуров Р.Р.1

1ГНЦ РФ ФГУП НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Россия, Москва, 1-й

Дорожный проезд, д. 1, e-mail: [e-mail]

2Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова, Россия, Москва, проспект Вернадского 86

Ключевые слова: моноклональные антитела, фактор некроза опухоли альфа, продуценты, клетки CHO

Рекомбинантные моноклональные антитела к фактору некроза опухоли альфа широко ис- пользуются в качестве биофармацевтических препаратов для лечения аутоиммунных забо- леваний. На рынке в настоящее время присутствует большое число подобных препаратов, и

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	123

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

разработка их российских биоаналогов представляет важную задачу. Одно из таких антител являлось целью описываемой разработки.

Цель исследования. Создать высокопродуктивный штамм-продуцент гуманизированного антитела к фактору некроза опухоли альфа.

Материалы и методы. Сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гены тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела, c использованием векторов pOptiVEC и pcDNA (Invitrogen, США). Для выбора наиболее эффективной комбинации векторов для экспрессии моноклонального антитела в клетках CHO-DG44 проведена транзиентная трансфекция с использованием реагента FreeStyle MAX (Invitrogen, США). Отбор стабильных клонов-про- дуцентов проводили методом предельных разведений. Клетки выбранного пула подвергли воздействию селекционного агента – метотрексата (MTX). Полученный пул клеток, устойчивый к МТХ,клонировалиметодомпредельныхразведений.Отобраликлональныелиниипродуцента и провели их сравнительный анализ на количество секретируемого белка (иммуноферментный анализ, ИФА), содержание легкой и тяжелой цепей (электрофорез с окраской Кумасси) и связывание с антигеном (антиген-специфичный ИФА). Культивирование осуществляли в суспензии в среде без содержания сыворотки с добавлением подпиток различного состава в многолуночных планшетах и колбах объёмом 125 мл.

Результаты. Максимальный уровень экспрессии моноклонального антитела получен в случае трансфекции клеток комбинацией векторов pOptiVEC-HC и pcDNA-LC. Популяция с максимальной экспрессией моноклонального антитела, выбранная в условиях стабильной транзиентной трансфекции, имела выход 0,6 нг/мл. После амплификации с МТХ на основании скорости роста, жизнеспособности и продуктивности были отобраны 7 лучших клонов, облада - ющие удельной продуктивностью 7–18 пг/клетку/день. С помощью первичного скрининга сред и подпиток в колбах были достигнуты следующие показатели: продуктивность по целевому белку 0,3–1,2 г/л, длительность культивирования 10–14 суток, максимальная клеточная плотность 8–38 млн клеток/мл. При непрерывном культивировании в течение 60 суток удельная продуктивность разных клонов снижалась на величину от 0–70%, при этом только для одного клона уровень экспрессии был полностью стабилен.

Выводы. Использование клеточной линии CHO-DG44 и разработанных генетических конструкцийпозволилодостичьпродуктивностипоцелевомубелкуболее1г/лв неоптимизированных условиях. При этом для одного из продуцентов была показана как высокая продуктивность, так и стабильность экпрессии при длительном культивировании. Необходимо дальнейшая работа по оптимизации условий культивирования для дальнейшего увеличения продуктивности полученного клона-продуцента.

124	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

УДК 615.33(076.5) (075.8)

DEVELOPMENT OF STRAIN-PRODUCING FOR GENERATION OF MONOCLONAL ANTIBODYTO TUMOR NECROSIS FACTORALFA

Voronina E.V.1, Seregin Y.A.1, Litvinova N.A.1, Shvetc V.I.2 Shukurov R.R.1

1Scientific Centre RF, Institute of genetics and selection of industrial microorganisms, Russia, Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1, mail: [e-mail]

2M.V. Lomonosov Moscow State Academy of fine chemical technology, Moscow, Russia

Keywords: monoclonal antibody, tumor necrosis factor alfa, strain-producing, cell CHO

Recombinant monoclonal antibodies (rMABs) are widely used biopharmaceuticals for treatment autoimmune disease. Currently on the market there are a large number of these drugs and the development of Russian biosimilars is an important goal. One such antibody the aim was to describe the development.

Aim of the study. Create strain-producing with the highest possible yield for generation of monoclonal antibody to tumor necrosis factor alfa.

Materials and methods. Expression constructs containing HC and LC genes of monoclonal antibody were synthesized using plasmids pOptiVEC и pcDNA (Invitrogen, USA). In order to select the best combination of vectors for expression of monoclonal antibody in CHO-DG44 cells transient transfection was carried out using a reagent FreeStyle MAX (Invitrogen, USA). Selection of stable clones-producing was performed by the limiting dilution method. Cells of selected pool were exposed to the selection agent – methotrexate (MTX).The resulting pool of cells resistant to MTX were cloned by limiting dilution. Producing clonal lines was selected and conducted a comparative analysis the amount of secreted protein (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), the content of the light and heavy chains (electrophoresis with Coomassie) and antigen binding (antigen-specific ELISA). Cultivation was carried out in suspension in serum-free medium supplemented with different feeds in multiwell plates and flasks 125 ml volume.

Results. The results suggested that maximal transient expression was achieved by using separate plasmids. The highest expression levels in transient transfection were obtained with the use of pOp- tiVEC-HC and pcDNA-LC plasmids combination. After amplification with MTX on the basis of the growth rate, productivity and viability were selected the best clones 7 having the specific productivity of 7–18 pg/cell/day. With primary screening media in flasks and feeds had the following characteristics: the target protein on the productivity of 0.3–1.2 g/l, the duration of the 10–14 days of cultivation, the maximum cell density of 8–38 million cells/ml. During continuous cultivation for 60 days of various clones specific productivity decreased by the amount of 0–70%, with only the level of expression of a single clone was completely stable.

Conclusion. Using a cell line CHO-DG44 and developed genetic constructs allowed to reach the target protein productivity by more than 1 g/l in the non-optimized conditions. Wherein for one of the producer has been shown a high productivity and stability of expression of prolonged cultivation. Further work is needed to optimize the culture conditions for a further increase in productivity result- ing clone-producing.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	125

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

УДК 661.12:001.891

РАЗРАБОТКА АКТИВНЫХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЙ НА ОСНОВЕ ГИБРИДНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ Е7-БТШ70 Жученко М.А., Гаврилова Н.А., Шамонов Н.А.

Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545, Россия, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1, [e-mail]

Разработан процесс трехстадийной хроматографической очистки гибридных рекомбинантныхонкобелковЕ7вирусапапилломычеловека16и18типов,конъюгированныхс белкомтепловогошока70,полученныхв ходекультивированияштамма-продуцента SaccharomycesCerevisiae SCR-702-E7(16)-HSP70 и SCR-702-E7(18)-HSP70. Показано, что ключевым фактором, позволя-

ющими получить белок, сохраняющим правильную структуру и биологическую активность, является использование металл-хелатной и аффинной хроматографии при его очистке.

Скрининг основных физико-химических свойств препарата, проведенный методом ускоренного хранения, позволил определить оптимальный компонентный состав вспомогательных веществ в активных фармацевтических субстанциях. Показано, что при внесении в составы сахарозы и полисорбата 80 стабильность субстанций значительно возрастает. Так, на основании полученных данных, срок хранения активной субстанции при температуре 2-8°С могут быть увеличены с одной до трех недель, а при хранении при -20°С срок годности может составлять не менее 12 месяцев.

DEVELOPMENT OFACTIVE PHARMACEUTICALINGREDIENTS BASED ON HYBRID RECOMBINANT PROTEINS E7-HSP70

Zhuchenko M.A., Gavrilova N.A., Shamonov N.A.

Scientific Center of Russian Federation Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, 117545, Russia, Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1

[e-mail]

A three-step chromatographic purification process of recombinant hybrid E7 oncoproteins of human papillomavirus types 16 and 18, conjugated with heat shock protein 70 produced during the culturing of the producer strain Saccharomyces Cerevisiae SCR-702-E7 (16)-HSP70 and SCR-702-E7 (18)-HSP70 was developed. It was shown that a key factor allowing to obtain preserving the correct structure and biological activity protein, is the use of metal-chelate affinity chromatography during purification process.

Screening of basic physical and chemical properties of the drug, conducted by accelerated stor-

age, allowed to determine the optimal component composition of exipients in active pharmaceutical

ingredients. It was shown that when substances incorporated in sucrose and polysorbate 80 stability

has significantly increase. Thus, based on the data obtained, the shelf life of the active substance can

be increased from one to three weeks when stored at 2-8°C and can be at least 12 months when stored at -20°C.

126	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

УДК 661.12:001.891

РАЗРАБОТКА ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ, ПРЕДНАЗНАЧЕННОЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ АНОГЕНИТАЛЬНОЙ ОБЛАСТИ, ВЫЗВАННЫХ ВПЧ 16 И 18 ТИПОВ Жученко М.А., Гаврилова Н.А., Кухаренко А.Е.

Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545, Россия, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1, [e-mail]

При разработке готовой формы вакцины для лечения заболеваний аногенитальной области были исследованы процессы сорбции гибридных рекомбинантных онкобелков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, конъюгированных с белком теплового шока 70 на адъюванты TiterMax® Gold,Adjuplex ™ и гидроокись алюминия. Была установлена зависимость интенсивности сорбции от температуры и времени протекания процесса.

В ходе скрининга основных физико-химических свойств вакцины было показано, что использование в качестве адьюванта гидроокиси алюминия позволяет получить стабильную форму вакцины и повысить активность препарата по сравнению с другими тестируемыми вариантами. На основании долгосрочных испытаний стабильности при хранении вакцины на 2-8°С был подтверждён срок годности 12 месяцев, исследования стабильности при увеличении срока годности продолжаются.

DEVELOPMENT OFTHERAPEUTIC VACCINE FOR THE TREATMENT OFANOGENITAL DISEASES CAUSED BY HPV TYPES 16AND 18

Zhuchenko M.A., Gavrilova N.A., KuharenkoA.E.

Scientific Center of Russian Federation Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, Russia, Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1

[e-mail]

In the development of vaccine formulation for treating diseases of the anogenital region were conducted sorption studied with hybrid recombinant E7 oncoproteins of human papillomavirus types 16 and 18, conjugated with heat shock protein 70 and TiterMax® Gold, Adjuplex ™ and aluminum hydroxide adjuvants.The temperature and the process time dependence on sorption intensity were set.

During the screening of basic physico-chemical properties of the vaccine it has been shown that the use of aluminum hydroxide as adjuvant provides vaccine stability and enhance the activity of the drug as compared with other tested variants. On the basis of long-term storage stability test the vaccine was confirmed shelf life of 12 months on 2-8°C, the stability studies with increasing shelf life continues.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	127

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

СЕКЦИЯ «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

SECTION “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

УСТНЫЕ ДОКЛАДЫ

ORALREPORTS

УДК 577.112.083

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НОВОГО ЛИПИД-ТРАНСПОРТИРУЮЩЕГО БЕЛКА ГОРОХА PISUM SATIVUM L.

Богданов И.В., Финкина Е.И., Овчинникова Т.В.

Федеральное агентство научных организаций (ФАНО России) Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН), Москва, Россия 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

e-mail: [e-mail]

Из гороха посевного Pisum sativum выделен и охарактеризован новый липид-транспорти- рующий белок, названный Ps-LTP1. Разработан биотехнологический способ получения рекомбинантного аналога нового LTP гороха. Показано, что Ps-LTP1 обладает антимикробной активностью в отношении фитопатогенных микроорганизмов. Продемонстрировано, что PsLTP1 имеет схожие с аллергенными LTP структурно-функциональные и иммунологические свойства.

Ключевые слова: аллергия; липид-транспортирующие белки; горох посевной; рекомбинантный белок.

В последние десятилетия отмечается выраженный рост частоты встречаемости аллергических заболеваний во всем мире. В связи с этим актуальной задачей является обнаружение и изучение свойств новых растительных аллергенов. Липид-транспортирующие белки (LTP) составляют один из широко распространенных в растительном царстве классов белков, представители которого часто являются причиной развития аллергических реакций различной степени тяжести.

Ранее нами в семенах гороха посевного Pisum sativum было обнаружено подсемейство из трех новых липид-транспортирующих белков, названных Ps-LTP1–3. Были установлены их полные аминокислотные последовательности и структуры кДНК, кодирующие предшественники новых LTP. Для изучения структурно-функциональных и иммунологических свойств одного из новых LTP была разработана методика выделения природного Ps-LTP1 из семян гороха.

Процесс выделения включает ряд последовательных стадий, а именно: экстракцию, диализ, те-

пловую обработку, двухстадийную ультрафильтрацию, катионообменную хроматографию и две

стадии ОФ-ВЭЖХ. Создана генно-инженерная конструкция для экспрессии Ps-LTP1 в составе

гибридного белка, содержащего тиоредоксин, и разработан биотехнологический способ полу-

чения рекомбинантного аналога Ps-LTP1 в клетках E. coli. Целевой рекомбинантный белок был

очищен в результате последовательного проведения металлохелатной хроматографии, диализа,

реакции расщепления гибридного белка бромцианом, повторной металлохелатной хроматогра-

фии и ОФ-ВЭЖХ.

Показано, что рекомбинантный Ps-LTP1 содержит восемь консервативно расположенных

остатков цистеина, формирующих четыре дисульфидные связи. Структура Ps-LTP1 характе- ризуется высоким содержанием α-спиральной структуры. В результате проведенного исследо-

128 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015