Биотехнологии 2015 Сборник материалов международного конгресса

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

Антимикробные пептиды (АМП) – природные соединения, обладающие широким спектром биологической активности. Для некоторых АМП в экспериментах in vitro и in vivo показано наличие выраженного противоопухолевого действия. В данной работе был изучен цитотоксический эффект трех катионных β-шпилечных антимикробных пептидов: ареницина-1 из полихеты Arenicola marina, тахиплезина из мечехвоста Tachypleus tridentatus и гомезина из паука Acanthoscurria gomesiana. С помощью МТТ-теста была измерена величина цитотоксического эффекта и определены значения IC50 для каждого из трех пептидов на панели опухолевых и нормальных клеточных линий человека. Для определения специфичности цитотоксического эффекта изучаемых АМП был проведен гемолитический тест. Терапевтический потенциал АМП определяли путем сопоставления значений IC50 для различных клеточных линий. Было показано, что все три изучаемых АМП оказывают выраженный цитотоксический эффект, ве - личина которого варьирует в зависимости от пептида и типа клеточной линии. Показано, что наибольшую опухолевую специфичность проявляет ареницин-1.

Работа поддержана грантом ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–2020 годы» (соглашение №

14.604.21.0104, уникальный идентификатор RFMEFI60414X0104).

UDC 577.112, 577.181

COMPARATIVE EVALUATION OF CYTOTOXICACTIVITY OFANTIMICROBIAL PEPTIDESARENICIN, GOMESINAND TACHYPLESIN

Kuzmin D.V., Emel’yanovaA.A., Kalashnikova M.B., Panteleev P.V., Balandin S.V., Ovchinnikova T.V.

M.M. Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS, Moscow, Russia 117997, Moscow, Miklukho-Maklaya Street, 16/10

e-mail: [e-mail]

On different cancer and normal cell linesthe therapeutic potential of three cationic β-hairpinantimicrobial peptides: arenicin-1, gomesin, and tachyplesin I was assayed.

Keywords: antimicrobial peptides, cationic β-hairpin peptides, cytotoxic effect, anticancer activ-

ity.

Antimicrobial peptides (AMP) are naturally occurring molecules with a broad spectrum of biological activity. In vivo and in vitro studies revealed evident selective cytotoxicity of several AMP against cancer cells. In this work we investigated the cytotoxic effect of three cationic β-hairpin antimicrobial peptides: arenicin-1 from the polychaeta Arenicola marina, gomesin from the spi-

der Acanthoscurria gomesiana and tachyplesin I from the horseshoe crabs Tachypleus tridentatus. Cytotoxic effect and IC50 value for every antimicrobial peptide were detected in cancer and normal human cell lines using MTT-test. The hemolytic test was used to estimate non-specific cytotoxicity of arenicin-1, gomesin, and tachyplesin I. Therapeutic potential of the peptides under investigation was evaluated by comparison of IC50 values for cancer and normal cell lines. It was shown that all the three antimicrobial peptides displayed cytotoxic activity that varied depending on the type of the AMP and cell line used. Arenicin-1 was the most selective AMP towards cancer cells.

The work was supported by the Federal Targeted Program «Research and Development in Priority Areas of Science and Technology Complex of Russia for 2014-2020” (agreement No.14.604.21.0104, identification code RFMEFI60414X0104).

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	69

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

УДК 57.083.22:578.22:62-9

МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВА ПСЕВДОВИРУСНОГО ВЕКТОРА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ С ЦЕЛЬЮ ПРОВЕДЕНИЯ ДОКЛИНИЧЕСКИХ И КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Веселова К.М., Омельченко Д.О., Урусов Ф.А., Богословская Е.В., Глазкова Д.В.

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, 111123, Москва, Россия, ул. Новогиреевская, д. 3а e-mail: [e-mail]

Разработана платформа и оптимизированы условия для производства лентивирусных частиц, несущих целевые последовательности для генотерапии ВИЧ инфекции, в количестве достаточном для проведения доклинических и клинических испытаний препарата.

Ключевые слова: ВИЧ, производство лентивирусных частиц, генная терапия.

Введение. в нашей лаборатории была разработана генотерапевтическая лентивирусная конструкция, позволяющая защитить клетки человека от заражения ВИЧ. В данной работе были оптимизированы условия производства, очистки и концентрации суспензии лентивирусных частиц в количестве, достаточном для проведения доклинических и клинических испытаний.

Материалы и методы: лентивирусные частицы нарабатывали с помощью клеток продуцентов HEK293T на 10-слойных клеточных фабриках HyperFlask (Corning) варьируя параметры трансфекции и культивирования клеток. Концентрирование и очистку полученной суспензии лентивирусных частиц проводили с помощью тангенциальной проточной фильтрации (TFF). Титр определяли с помощью флуоресцентной проточной цитометрии (FACS) на трансдуцированных клетках линии SupT1.

Результаты. для получения лучшего титра были подобраны следующие параметры: концентрация реагента для трансфекции PEI (polyethylenimine), общее количество плазмид, соотношение PEI и плазмидных ДНК, плотность засева клеток, состав ростовой среды и оптимальное время сбора частиц. В результате был разработан протокол, который позволяет нарабатывать 5,6 л первичной суспензии лентивирусных частиц в неделю с титром не меньше 5*105 ТЕ/мл с последующей очисткой и концентрированием до 109 ТЕ/мл, что достаточно для проведения необходимых испытаний.

УДК 57.083.22:578.22:62-9

SCALING UPPRODUCTION OF PSEUDOVIRALVECTOR FORANTI-HIV GENE THERAPY AIMED FOR CONDUCTING PRE-CLINICALAND CLINICALTRIALS

Veselova K.M., Omelchenko D.O., Urusov F.A., Bogoslovskaya E.V., Glazkova D.V.

Federal Budget Institution of Science “Central Research Institute of Epidemiology” of The Federal Ser-

vice on Customers’Rights Protection and Human Well-being Surveillance, 111123, Moscow, Russia, No-

vogireevskaya street, building 3а e-mail: [e-mail]

We have developed a platform and optimized conditions for production of lentiviral particles,

containing target sequences for anti-HIV gene therapy, in scale that is enough to conduct pre-clinical

and clinical trials of our drug.

Keywords: HIV, lentiviral particles production, gene therapy.

70	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

Introduction. Lentiviral vector for anti-HIV gene therapy has been designed in our laboratory. In this study we have optimized parameters of production, purification and concentration of lentiviral particles in scale enough for conduction of preclinical and clinical trials.

Materials and methods. Lentiviral particles were produced in HEK293T cells using 10-layer culture HyperFlask (Corning) with various transfection parameters and cultivation conditions. Lentiviral particle suspension was purified and concentrated by tangential flow filtration (TFF). Infectious titer was determined by FACS analysis of transduced cells of SupT1 cell line.

Results. Concentration of transfection reagent PEI (polyethylenimine), concentration of plasmids, PEI/plasmid DNA ratio, cell culture density, growth medium recipe and optimal time for pseudoviral particle collection were determined to achieve the best infectious titer. We have created a protocol based on the results of our research that allows us to produce 5,6Lof primary lentiviral suspension per week with a titer no less than 5*105 TU/mL with further purification and concentration up to 109TU/ mL which is enough for all necessary trials.

УДК 577.21; 615.06

МЕТАЛЛСВЯЗЫВАЮЩИЕ СВОЙСТВА N-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА БЕЛКА CTR1 (NdCTR1)

Орлов Ю.А., Санькова Т.П., Пучкова Л.В.

Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, Санкт-Петербург, Россия 195251, Санкт-Петербург, ул. Политехническая, 29

e-mail: [e-mail]

С целью изучения металлсвязывающих свойств NdCTR1, бактерии E. coli трансформированы рекомбинантной плазмидой, содержащей соответствующий фрагмент гена hCtr1. Показано, чтоклетки, экспрессирующиеNdCTR1, имеют повышенную способность аккумулировать металлы, и наличие этого белкавлияет на выживаемость бактерий, обработанных ионами серебра или меди.

Ключевые слова: метаболизм меди, высокоаффинный импортер меди CTR1, клонирование, выживаемость бактерий.

Для коррекции нарушений обмена меди, создания ее дефицита для растущих опухолей, по - вышения терапевтической эффективности и снижения токсичности противоопухолевых препаратов, используют абиогенные хелаты, имеющие, однако, тяжелые побочные эффекты [1; 2]. В работе изучены металлсвязывающие свойства NdCTR1.

Клонирован фрагмент гена hCtr1[3], кодирующий N-концевой домен белка hCTR1, высоко- аффинного импортера меди, в экспрессирующем бактериальном векторе pGEX-4T-1. Тесты на выживаемостьпроводилититрованиемклеток E. coli,содержащих NdCTR1,обработанныхв те- чение различных промежутков времени 3.5 мкMAgNO3 или 80 мкМCuSO4. Концентрацию ме- талла в клетках измеряли на атомно-абсорбционном спектрометре ZEEnit 650P. Сопоставление индекса выживаемости и динамики накопления металлов показывает, что клетки, экспресси- рующие NdCTR1, одновременно с достоверно повышенной способностью аккумулировать как серебро, так и медь, демонстрируют повышенную устойчивость к длительному воздействию ионов серебра и сниженную жизнеспособность при обработке ионами меди, что позволяет счи - тать NdCTR1 потенциально эффективным биогенным адсорбентомионовтяжелых металлов.

ЛИТЕРАТУРА:

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	71

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

1.  Juarez J.C. et al. Copper binding by tetrathiomolybdate attenuates angiogenesis and tumor cell proliferation through the inhibition of superoxide dismutase // Clin Cancer Res. 2006. V. 12. №16. P. 4974–4982.

2.  Alvarez H.M.et al. Tetrathiomolybdate inhibits copper trafficking proteins through metal cluster formation. // Science. 2010. V. 327. № 5963.P. 331–334.

3.  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U83460

METALBINDING PROPERTIES OF CTR1 N-TERMINALDOMAIN (NdCTR1). Orlov Y.A., Sankova T.P., Puchkova L.V.

Saint-Petersburg state technical university, Saint-Petersburg, Russia 195221, Saint-Petersburg, Politechnicheskayast. 29

e-mail: [e-mail]

In order to study metalbinding properties of NdCTR1, E. coli cells were transformed with recombinant plasmid, containing the appropriate fragment of hCtr1gene. It has been shown that the cells, expressingNdCTR1, better accumulate heavy metal ions and the expression affects bacterial viability under their exposure to silver or copper ions.

Keywords: copper metabolism, high affinity copper importer CTR1, cloning, bacteria viability .

A biogenicchelators are used to correct metabolism of copper disorders, to create its deficiency for growing tumors, to improve the therapeuticefficacy and reduce the toxicity of anticancer drugs. However, they have severe side effects [1; 2]. In this research metalbinding properties of NdCTR1 were studied.

Fragment of hCTR1 gene [3], which codes N-terminal domain of human high affinity copper importer hCTR1, was cloned in bacterial expression vector pGEX-4T-1. Survival tests were carried out by titration of E. coli cells, synthetizing NdCTR1, after their different time-interval exposure to 3,5μMAgNO3or 80 μМCuSO4. Metal concentration in cells was measured byatomic absorption spectrometer ZEEnit 650P. Analysis of metal accumulation dynamics has shown that NdCTR1expressing cells displayed increased copper and silver accumulation abilities. Simultaneously these cells demonstrated higher resistance to long-time silver ionsimpact, than cells without NdCTR1, and lower resistance to copper ions. All these facts allow us to consider NdCTR1 as potential effective biocompatiblead sorbent of heavy metals ions.

References:

1.  Juarez J.C. et al. Copper binding by tetrathiomolybdate attenuates angiogenesis and tumor cell proliferation through the inhibition of superoxide dismutase // Clin Cancer Res. 2006. V. 12. №16. P.

4974–4982.

2.  Alvarez H.M.et al. Tetrathiomolybdate inhibits copper trafficking proteins through metal clus-

ter formation. // Science. 2010. V. 327. № 5963.P. 331–334. 3.  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U83460

72	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

УДК579.674

ВЛИЯНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ОТ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК НА ВОССТАНОВЛЕНИЕ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ Пахомов Ю.Д., Бердюгина О.С., Блинкова Л.П.

ФГБНУ, Научно Исследовательский Институт Вакцин и Сывороток им. И.И. Мечникова ФАНО, 105064, Москва, Малый Казённый пер., 5а Москва, Россия.

E-mail: [e-mail]

Показано, что культуральные жидкости (КЖ) после выращивания клеток миеломы мыши (ММ) и клеток CHO стимулируют жизнеспособные некультивируемые клетки (ЖНК) из лио -

филизированных пробиотиков, на основе Bifidobacteriumbifidum(BB) и Lactobacillusacidophilus

(LA).

Ключевые слова: культуральная жидкость, эукариотические клетки, жизнеспособные некультивируемые пробиотические бактерии, восстановление

Введение. Фетальная сыворотка коров (ФСК) и пассаж через организм животного счита - ются наиболее эффективными факторами влияния эукариот на восстановление ЖНК микроорганизмов. Цель исследования – проверка возможности восстановления ЖНК из коммерческих лиофилизированных пробиотиков КЖ от эукариотических клеток CHO и ММ.

Материалы и методы: Для этого полужидкую среду Элликера (ЭЛ), обогащали добавками КЖ, на основе среды DMEM (1, 5, 10%) после 2 дней культивирования клеток ММ (контро -

ли – DMEMи DMEMс 10% ФСК) или КЖ, на основе среды RPMI 1640 с 5% ФСК и 10µg/ml

гентамицинапосле 7 дней культивирования клеток CHO (контроль – среда RPMI 1640 с теми же добавками).Контроль жизнеспособности бактерий в пробиотиках проводили в полужидкой среде ЭЛ без добавок. Посевы инкубировали в течение 7 дней при 30°C. Количество КОЕ/мл учитывали периодически, начиная с 24 часов. Общее число клеток/мл считали в камере Тома. Долю живых клеток в образцах определяли в люминесцентном микроскопе OPTON (Zeiss, Германия) после окрашивания набором люминесцентных красителей Live/Dead (Baclight™, увеличение 8×40). Количество ЖНК определяли по разнице значений КОЕ/мл и числа живых клеток.

Результаты: В популяции ВВ доля живых клеток составляла 81,48%, из них ЖНК – 99,62%. Для испытанных КЖ показана максимальное увеличение КОЕ/мл в 4,1 раза (при 1%CHOпо сравнению с контролем на среде ЭЛ без добавок). В препарате LAвыявлено 82,82% живых клеток, из которых 99,61 ЖНК. Максимальный реанимирующий эффект КЖ на ЖНК в препарате

LA составил 2,24 раза (1% CHOили10% MM).

Выводы: Эффект восстановления ЖНК в коммерческих препаратах BB и LA, зависел от типа эукариотных клеток и концентрации КЖ.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	73

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

UDC: 579.674

INFLUENCE OF CULTURE LIQUID FROM EUKARYOTIC CULTURESCELLS ON RESUSCITATION OFVBNC PROBIOTIC BACTERIA

Yu.D. Pakhomov, O.S. Berdyugina, L.P. Blinkova

FSBSI “Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera”, 105064  MaliyKazenniy per. 5a, Moscow, Russia.

E-mail: [e-mail]

Experimental data revealed that culture liquid (CL)after growing CHO and mouse myeloma cells stimulate VBNC cells from lyophilized probiotic preparations that contain Bifidobacterium bifidum

(BB) и Lactobacillus acidophilus (LA).

Keywords: culture liquid, eukaryotic cells, viable but nonculturable probiotic bacteria, resuscitation

Introduction.Bovinefetalserum(BFS)andpassagethroughanimalorganismareconsideredasthe most effective factors of eukaryotes, promoting resuscitation of VBNC (Viable But Non Culturable) bacteria. The purpose of research was to check capability of CL from CHO eukaryotic cells (EC) and mouse myeloma (MM) to resuscitateVBNC cells from commercial lyophilized probiotics that contain BB or LA.

Materials and methods. Forthatsemi-solid Elliker medium(EL)was supplementedwithDMEMbased CL (1, 5, 10%) after 2 days of MM cells cultivation (controls – DMEM, DMEM with 10% BFS) or RPMI 1640 medium-based CL with 5% BFS and gentamicin (10 µg/ml) after 7 days of CHO cells cultivation (controls – RPMI 1640 with the same additives). Viability tests in probiotics were conducted in EL without supplements. All bacterial samples were incubated for 7days at 30°C. CFU/ ml values were taken periodically, starting from first 24hrs of incubation. Total number of cells was counted in a counting chamber by means of Zeiss microscope (Germany). Portion of viable cells in population was definedwith Live/Dead® dye kit (Baclight™) in luminescent microscope (OPTON, 8×40 times magnification). Number of VBNC cells was calculated as difference between amounts of viable cells and CFU/ml.

Results. BB population contained 82.48% viable cells of which 99.62% were VBNC. For tested CLs increase in colony forming activity was 4.1 times (1% of CHO compared to unsupplemented EL medium).In LA probiotic 82.82% cells were viable of which 99.61 were VBNC. Resuscitating effect of CLs in experiments on probiotic with LA was 2.24times (1% of CHO or 10% of MM).

Conclusion. Effect of resuscitation on VBNC cells of commercial lyophilized probiotics that contain BB or LA by CL depended, on the type of eukaryotic cells and concentration of CL.

74	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

УДК 544.576

ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ГИДРОФИЛЬНЫХ КВАНТОВЫХ ТОЧЕК Панкратов В.А., Гайнбух А.В., Гофтман В.В., Горячева И.Ю.

Научный Исследовательский Саратовский Государственный Университет им. Н.Г. Чернышевского 410012  Саратов, ул. Астраханская, 83

e-mail: [e-mail]

Были синтезированы гидрофобные квантовые точки (КТ) с различным цветом свечения в видимой области спектра. Для биоприменения КТ были гидрофилизованы методом покрытия амфифильным полимером и методом силанизации. Изучены и показаны свойства полученных гидрофильных биометок на основе КТ.

Ключевые слова: квантовые точки (КТ), гидрофилизация, амфифильный полимер, силанизация

Квантовые точки (КТ) представляют собой полупроводниковые нанокристаллы с уникальнымиоптическимисвойствами.В отличиеотширокоиспользуемыхорганическихфлуорофоров, КТ обладают широкой полосой поглощения и узкими и симметричными пиками испускания, что позволяет использовать их для мультипараметрического детектирования, в частности для визуализации биологических или химических процессов [1]; КТ также показывают высокую яркостью и несравнимую фотостабильностью, что позволяет использовать их в длительных экспериментах, например, при наблюдении за поведением тех или иных клеток (или компонен - тов клеток).

Классическим методом получения флуоресцентных КТ является высокотемпературный коллоидный синтез в высококипящем органическом растворителе в инертной атмосфере. Полученные таким методом частицы гидрофобны. Однако для биоприменения необходимыми условиями являются высокая яркость и коллоидная стабильность КТ в водных буферных растворах, а также наличие на поверхности функциональных групп, доступных для связывания с биологическими молекулами [2]. Для придания КТ гидрофильных свойств существует два подхода, один из которых подразумевает замену исходных гидрофобных лигандов на гидро - фильные, а другой – покрытие исходных лигандов амфифильными молекулами.

Вариантом метода замены лигандов является силанизация, когда в роли замещающих лигандов выступают молекулы органосиланов, которые при гидролизе образуют вокруг КТ плотную, прозрачную, химически инертную гидрофильную оболочку [3]. А в качестве амфифильных молекул часто используют полимеры, содержащие гидрофобные звенья и фрагментыПЭГа, которые помимо гидрофильности придают КТ биосовместимые свойства. Оба вышеупомянутых метода применяли для синтезированных методом высокотемпературного коллоидного синтеза КТ структуры CdSe/CdS/ZnS и изучали стабильность полученных растворов в водных средах.

1.  Goryacheva I. Yu., Lenain P., DeSaeger S. Nanosized labels for rapid immunotests.// Trends in Analytical Chemistry. 2013. Vol. 46. P. 30–43.

2.  V. Biju,T. Itoh and M. Ishikawa. Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging.// Chem. Soc. Rev. 2010.№ 39.Р. 3031–3056.

3.  Knopp D., Tang D., Niessner R. Bioanalytical applications of biomolecule-functionalized nanometer-sized doped silica particles.// AnalyticaChimicaActa. 2009. Vol. 647. P. 14–30.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, проект 14-13-00229.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	75

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

STABILITY INVESTIGATION OF HYDROPHILIC QUANTUM DOTS Pankratov V.A., GainbuchA.V., Goftman V.V., GoryachevaI.Yu.

National Research Saratov State University 410012  Saratov, Astrachanskaya str., 83 e-mail: [e-mail]

Quantum dots (QDs) with different emission color were synthesized and transferred to water by means of or silanization either amphiphilic polymer covering methods. Optical properties and stability of obtained hydrophilic QDs were investigated.

Keywords: quantum dots (QDs), hydrophilization, amphiphilic polymer, silanization.

Quantum dots (QDs) are semiconductor nanocrystals with unique optical properties. In comparison with widely used organic fluorophores QDs have wide absorption and narrow emission spectra. This fact allows to use them in visualization methods for multilabeling and multidetection [1]. Moreover high brightness and incomparable photostability of QDs can be used in long-term analysis.

There are different methods to produce QDs. One of the most convenient methods is colloidal synthesis in organic solvent which results in bright stable monodisperse hydrophobic QDs. But water solubility and functional groups available for conjugation are restricted for bioapplication of QDs [2]. There are 2 basic approaches for QDs hydrophilization: ligand-exchange method (including silanization) and covering with amphiphilic molecules (including polymers). Silica coating of QDs usually involves initial ligand exchange with silane molecules such as tetraethoxysilane (TEOS) to form nucleation sites on the QD surface followed by further shell growth by hydrolysis and condensation to form dense transparent stable shell on QDs surface [3]. Meanwhile covering with amphiphilic molecules (for example, polymers) retains initial hydrophobic ligands on QDs surface which leads tohigh quantum yields when usage of PEG-contained polymers increases biocompatibility of QDs and decrease their non-specific sorption.

Both methods mentioned above were applied to as-synthesized CdSe/CdS/ZnS QDs and optical and stability characteristics were received.

1.  Goryacheva I. Yu., Lenain P., DeSaeger S. Nanosized labels for rapid immunotests.// Trends in Analytical Chemistry. 2013. Vol. 46. P. 30–43.

2.  V. Biju,T. Itoh and M. Ishikawa. Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging.// Chem. Soc. Rev. 2010.№ 39.Р. 3031–3056.

3.  Knopp D., Tang D., Niessner R. Bioanalytical applications of biomolecule-functionalized nanometer-sized doped silica particles.// AnalyticaChimicaActa. 2009. Vol. 647. P. 14–30.

The work was financially supported by Russian scientific foundation, project 14-13-00229.

76	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

УДК 577.112, 577.181

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАЛОГА АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА ТАХИПЛЕЗИНА С ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Пантелеев П.В., Иванова Ю.Д., Овчинникова Т.В.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Россия, 117997, Москва, МиклухоМаклая 16/10

e-mail: [e-mail]

С помощью методов направленного мутагенеза и гетерологической экспрессии в бактериальной системе получен ряд аналогов антимикробного пептида тахиплезина. В экспериментах in vitro показано, что один из полученных пептидов обладает более высокой устойчивостью к протеолитической деградации в сыворотке крови по сравнению с исходной молекулой.

Ключевые слова: антимикробные пептиды; тахиплезин; гетерологическая экспрессия; сыворотка крови.

Катионные антимикробные пептиды (АМП) – это ключевые и универсальные для большинства многоклеточных организмов компоненты системы врожденного иммунитета, вносящие существенный вклад в защиту от патогенных микроорганизмов. В последние годы АМП привлекают пристальное внимание исследователей в качестве альтернативных традиционным антибиотикам соединений благодаря способности быстро уничтожать широкий спектр мультирезистентных патогенов. Кроме того, мембранолитический механизм действия катионных АМП даёт основания предполагать меньшую вероятность возникновения резистентности патогенных микроорганизмов. К настоящему моменту АМП нашли применение в клинической практике лишь в качестве препаратов для наружного применения. Системное применение АМП возможно, однако в значительной степени затруднено из-за их протеолитической деградации и связывания с белками крови. На сегодняшний день разработаны несколько подходов для повышения стабильности АМП в присутствии сыворотки крови: введение в структуру АМП D-аминокислот, циклизация пептидного остова, защита N- и C-концевого аминокислотных остатков, а также стабилизация молекулы дисульфидными связями. Настоящая работа посвящена разработке биотехнологического способа получения таких соединений.

Кчислунаиболееактивныхиустойчивыхк действиюпротеазАМПживотногопроисхождения относятся молекулы, образующие стабилизированную дисульфидными связями β-шпилечную структуру. В данной работе с помощью методов направленного мутагенеза и гетерологической экспрессиив бактериальнойсистемебылполученряданалоговβ-шпилечногоАМПтахиплезина

из подковообразного краба Tachypleus tridentatus. Исследование протеолитической деградации АМП проводилось путем их инкубации с разбавленной сывороткой крови человека. На началь- ном этапе методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии в структуре тахиплезина были выявлены наиболее чувствительные к протеолизу пептидные свя- зи. На основе полученных данных были получены и протестированы модифицированные ана- логи тахиплезина. Показано, что высокая стабильность целевого АМП может быть достигнута путем защиты N-концевого лизина добавлением остатка пироглутаминовой кислоты, а также путем замены аргинина в положении 17. В результате был получен рекомбинантный аналог, обладающий вдвое меньшей антибактериальной активностью по сравнению с исходной молеку- лой, но устойчивый к деградации в сыворотке крови в течение 24 часов.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда (соглашение № 14-50-00131).

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	77

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

UDC 577.112, 577.181

BIOTECHNOLOGICALPRODUCTION OFANTIMICROBIALPEPTIDE TACHYPLESIN ANALOG WITH HIGH STABILITY IN SERUM

Panteleev P.V., Ivanova Yu.D., Ovchinnikova T.V.

Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, MiklukhoMaklaya str. 16/10, 117997 Moscow, Russia

e-mail: [e-mail]

In this work we have obtained a set of analogs of β-hairpin antimicrobial peptide tachyplesin by directed mutagenesis followed by expression of the target molecules in bacterial cells. One of the analogs was significantly more stable in human serum in vitro in comparison with the original molecule.

Keywords: antimicrobial peptides; tachyplesin; heterological expression; blood serum.

Cationic antimicrobial peptides (AMP) are essential components of innate immune system of the majority of multicellular organisms. AMP substantially contribute to protection against pathogens. In recent yearsAMP attracted attention as possible alternatives to conventional antibiotics due to their rapid efficacy towards a broad range of multiresistant pathogens, the membranolytic mode of action and the consequent low rate of resistance development. Development of AMPfor clinical use has thus far been limited to topical applications. Systemic administration is also possible but not practicable due to proteolytic degradation of AMP and their binding to blood proteins. Many design strategies have been employed to date to increase serum stability of AMP including modifications with unnatural amino acids such as D-isomer amino acids, head-to-tail backbone cyclization, N- and C-terminal capping, and stabilization of target molecules by disulfide bridges. Here we report biotechnological production of AMP analogs with high stability in serum.

Among the most potent and stable to proteolysisAMPof animal origin are peptides with β-hairpin structure stabilized by disulphide bonds. In this work we have obtained structural analogs of β-hairpin antimicrobial peptide tachyplesin from horseshoe crab Tachypleus tridentatus by directed mutagenesis followed by expression of the target molecules in bacterial cells. The proteolysis was performed by incubation of the peptides in diluted human serum. Initially we have determined the most susceptible to proteolysis peptide bonds in the original molecule with the use of high-performance liquid chromatography and mass spectrometry methods. Based on these data, several modified analogs were designed and tested. The increased stability was achieved by capping of the N-terminal lysine with pyroglutamic acid and replacing arginine at the position 17.As the result, we have obtained promising recombinant analog which was two-fold less active against tested bacterial pathogens than the original peptide but stable in human serum within 24 hours.

The work is supported by the Russian Science Foundation (the agreement No. 14-50-00131).

78	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015