Биотехнологии 2015 Сборник материалов международного конгресса

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

UDC 617.3:159.9

INCREASE OF EFFICIENCY OFTREATMENT ChCP-CHILDREN BY IMPROVEMENT OFAPSYCHOEMOTIONALCONDITION OFTHEIR PARENTSAND TUTORS Bykovskaja E.Yu., Kuznetsova L.P., Nikitina E.R., Sochilina E.E.

Sechenov Institute of Evolutionary physiology and biochemistry of RAS, St-Petersburg E-mail: [e-mail]

Efficiency of rehabilitation actions for restoration of the ChCP-child depends not only from compensator possibilities of its organism and the complex of medical and pedagogical actions with participation of experts, but also on accuracy of performance of recommendations and degree of adequacy of participation in this process of parents or trustees

Recently, level of passive aggression among relatives of such children has essentially increased. Education in family of the ChCP-child provokes protective, adaptive reorganizations of behaviour among its environment. It is possible to allocate some factors which promote development of is pas- sive-aggressive behaviour: one of the most important factors is severity level of disease of the child, prospect of recover which are foggy; not less important factor leaving from a family of the father or mother; and as the compelled loss of favourite work; alienation of friends; narrowing or full loss of sphere of personal interests (a hobby, readings, playing sports, entertainments); computer and other kinds of dependence. The passively-aggressive behaviour in the development as passes some stages and is connected with acceptance or aversion of the ChCP-child.

Parents of ChCP-children with an uncooperative altitude to qualification and authority of doctors can, some time, hide the anger. But there is a period when the others – healthy children – have already learnt to sit and go, and their child is not present, and there is obvious their strong backlog in mental and impellent development.The stock of subconscious anger more and more accrues, as dialogue with other parents having as sick and healthy children, and the experts actively participating in rehabilitation of the child, is always accompanied for them by the unpleasant and irritating moments.

Eventually people with is passive-aggressive lines have reasons for anger, present or imagined. Usually suppress the anger they can no more than two years, but then the anger starts to find subconscious ways for the expression, not giving itself of the report that do. On politeness change irritability, desire to punish all those who throughout all period of a life of the child participated in its destiny, treatment, rehabilitation, training comes.

It becomes difficult to communicate with such people. Eventually, they become so uncommunicative, that many experts refuse to work with them, and it badly affects on health and development of their children.

We have suggested to spend in addition in frameworks «Ontogenetichesky system of formation of impellent actions at a children’s cerebral paralysis» a complex of actions on improvement of a

psychoemotional condition of parents or trustees of ChCP-children which includes following stages.

1.  The specificity research motivatsionno-potrebnostnoj spheres of the person by Z.Njuttena’s motivational induction [1] and a technique «20 answers to a question « Who I? » M.Kuna [2]. 2.  Actions for creation Own «the Circle of pleasures» which include lectures and a practical train- ing. 3.  Training (carrying out of readings, conversations, lectures). 4.  Improvingly – the sports employment directed on removal of emotional and muscular pressure, including elements of dance, an extension, yoga, auto-training, dialogue.

5.  Flowing (1 time in three months) and the total control (in a year) a psychoemotional condition.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	109

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

6.  In need of consultation of experts: psychologists, neurologists, therapists, psychiatrists and et

al.

For research 12 women (at the age from 23 till 38 years) carrying out leaving and education ChCPchildren (at the age from 5 till 36 months) have been selected. Groups have been generated by a method of “pair design» so that, control and experimental groups were similar on structure of examinees. In each group was on 6 women having one ChCP-child. In control and experimental groups conducted individual lessons with ChCP-children, applied the fixation massage and the ontogenetic gymnastics.

In experimental group, in addition, have suggested mums to participate in a complex of actions for improvement of a psychoemotional condition. In two weeks in experimental group: improvement of mood and a state of health at 5 women (83,3%) and 6 children (100%), desire to be engaged with the child of the house at 6 women (100%) was marked, impellent activity has raised at 6 children (100%), the relation to illness of the child at 6 women (100%) has positively changed.

In control group improvement of mood and a state of health at 1 woman (16,67%) and 4 children (66,67%), desire to be engaged with the child of the house at 2 women (33,33%) was marked, impellent activity has raised at 4 children (66,67%), the relation to illness of the child at 2 women (33,33%) has positively changed.

Thus, the complex of actions offered by us for parents or trustees of ChCP-children not only promotes improvement of their psychoemotional condition (improves mood and a condition of psychosomatic health, positively influences their relation to illness of the child), constrains development of aggressive behaviour. Promotes introduction, through the parent or the trustee, physical and other exercises, massage in a usual mode of day of the ChCP-childr, improving comfort of his life and by that promoting increase of efficiency of treatment ChCP-children.

1.  Нюттен Ж. Мотивация, действие и перспектива будущего // Под ред. Д.А. Леонтьева. –

М.: Смысл, 2004. – 608 с.

2.  1. Кун М., Макпартленд Т. Эмпирические исследования установок личности на себя // Современная зарубежная социальная психология. Тексты. М.: Изд-во МГУ, 1984. С. 180-187.

УДК 577.15.08+577.152.231

ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТМИКРОТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ТРАНСАЦИЛАЗНОЙ И ГИДРОЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В БЕЛОМ И СЕРОМ ВЕЩЕСТВЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС Грибанов Г.А.1, Миняев М.В.2, Колдунов В.В.

1Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение ВПО Тверской государственный университет, Россия, г. Тверь, ул. Желябова, 33.

E-mail: [e-mail]

2 Государственное бюджетное образовательное учреждение ВПО Тверская Государственная

медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития России, mmb_77@mail. Ru

С помощью разработанной нами ранее высокочувствительной энзиматической методики

(ферментмикротонкослойная хроматография, ФМТСХ) изучены особенности локализации ле-

цитин-холестерол-ацилтрансферазы (ЛХАТ), холестеролэстеразы (ХЭ) в гомогенатах белого и

серого вещества головного мозга крыс. В белом веществе выявлена относительно высокая ак- тивность ЛХАТ, в сером – более выражена активность ХЭ.

110	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

Ключевые слова: ферментмикротонкослойная хроматография, новые энзиматические технологии, лецитин-холестерол-ацилтрансфераза (ЛХАТ), холестеролэстераза (ХЭ), белое и серое вещество мозга.

В настоящее время среди технических возможностей определения активности многих ферментовлипидомнойсетитканейиоргановбольшоезначениеприобретаютхроматографические технологии, включая микротонкослойную хроматографию (МТСХ). Определения активности ферментов липидного обмена всегда были затруднительными, особенно, в связи с необходимостью создания в малом объеме пробы развитой поверхности раздела фаз (липид-вода) (1). Ранее нами (2) были разработаны методические подходы к определению ацилгидролаз, в частности, в отношении эфиров холестерина (ЭХ). Развитая поверхность раздела фаз липид-вода создавалась путем предварительного распределения липидов тонким слоем по поверхности частиц силикагеля на стартовой точке хроматографической пластинки с последующим нанесением буферногораствора(рН7,2)иисточникафермента.Инкубациюмикропластинок(50 × 75мм)проводили в камере оригинальной конструкции [2] в течение 2 ч при температуре 37°С В данном исследовании микроколичества субстратов (холестерин, Х и фосфолипиды, ФЛ) и продуктов лецитин-холестерол-ацилтрансферазной (ЛХАТ) реакции определяли после хроматографического разделения методом сжигания с H2SO4 (3). В качестве источника фермента использовали гомогенаты белого и серого вещества головного мозга белых крыс. В белом веществе головного мозга крыс была обнаружена ЛХАТ активность, составившая 250±29 мкг/мг·ч по приросту ЭХ и снижению количества ФЛ. Аналогичная активность обнаружена и в клеточных линиях нейроглиальных клеток мозга (4). В сером веществе ЛХАТ активность отсутствовала, или была ниже порога чувствительности метода, но при статистическом анализе прироста и убыли компонен - тов реакции была выявлена гидролазная по отношению к ЭХ активность, составляющая 71±25 мкг/мг·ч. Предполагается, что гидролазная активность серого вещества принадлежит холестеролэстеразе [5]. Применение новых энзиматических технологий и полученные с их помощью данные приводят к необходимости пересмотра и переосмысления многих ранее полученных экспериментальных данных о механизмах количественных перестроек липидомов разных органов, тканей, ультраструктур и дает новые возможности для объяснения сложных метаболи - ческих взаимодействий их липидного компонента. В белом веществе головного мозга крыс метаболические взаимоотношения в системе фосфолипиды (ФЛ) – холестерин (Х) – эфиры холестерина (ЭХ) соответствуют формуле ФЛ=> Х=> ЭХ. В сером веществе головного мозга крыс их взаимоотношения иные: ФЛ <= ЭХ=> Х.

Список литературы

1.  Брокерхоф X., Дженсен Р. Липолитические ферменты: – М.: Мир, 1978, 396 с.

2.  Грибанов Г.А., Миняев М.В. – Вопросы медицинской химии, 1992, Т. 38, №2, С. 59–61. 3.  Грибанов Г.А., Сергеев С.А.Вопросы медицинской химии, 1975, №6, С. 652–654.

4.  Collet X., Francone O., Besnard F., Fielding C.J. Secretion of lecithin: cholesterol acyltrans- ferase by brain neuroglial cell lines // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1999. V. 258. No. 1. P. 73–76.

5.  Morinaga N., Maeda A., Mizuno T., Bunya M., Sugihara S., Sugihara A. Synthesis of fatty acid sterol esters using cholesterol esterase from Trichoderma sp. AS59 // Enzyme and Microbial Technology. 2011. V. 48. No. 6-7. P. 498-504.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	111

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

APPLICATION OFAENZYMETHINLAYER CHROMATOGRAPHY FOR DETECTION OFTRANSACYLASEAND HYDROLASEACTIVITY IN WHITEAND GRAY SUBSTANCE OFABRAIN OF RATS

Gribanov G.A1., Minyaev M.V.2, Koldunov V.V.

1Federal public budgetary educational HPE institution Russia, Tver state university, Tver, Zhelyabov St., 33. E-mail: naukoved@tversu.,

2Public budgetary HPE Tverskaya educational institution State medical academy of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, mmb_77@mail. Ru

By means of earlier highly sensitive enzymatic technique developed by us (a enzymethinlayer chromatography, ETLC) peculiarity of localization of a lecitin-cholesterol-acyltransferase (LCHAT), a cholesterolesterase (CHE) in the gomogenate of white and gray substance a brain of rats are studied. In white substance rather high activity of LCHAT is revealed, in gray – activity of CHE is more expressed.

Keywords: enzymethinlayer chromatography, new enzimatic technologies, l lecitin-cholesterol- acyltransferase (LCHAT), cholesterolesterase (CHE), white and gray substance of a brain.

At present among technical capabilities of determination of activity of many enzymes of a lipidome network of tissues and bodies the great value is got by chromatography technologies, including a microthin layer chromatography (MTLC). Determination of activity of enzymes of a lipid exchange always there were difficult, especially, due to the need creations in the small volume of test of the developed interface of phases (lipid water) (1). Earlier we (2) developed methodical approaches to definition acylhydrolise, in particular, concerning the cholesterol ether (CHEt). The developed interface of phases a lipid water was created by preliminary distribution of lipids by a thin layer on a surface of particles of silica gel on a starting point of a chromatographyc plate with the following bring buffer solution (рН 7,2) and an enzyme source. The incubation of microplates (50 × 75 mm) was carried out in the camera of an original design [2] during 2 h at a temperature of 37°C. In present investigation microquantity of substrate (cholesterol, CH and phospholipids, PHL ) and products of LCHAT reaction determined after chromatographyc division by a burning method with H2SO4 (3).As a source of enzyme used homogenate of white and gray substance of a brain of white rats. In white substance of a brain of rats LCHAT the activity which made 250±29 mkg/mg • h a increase CHE and to decrease in quantity of phospholipids (PHL ) was found . Similar activity is found and in cellular lines of neuroglial cells of a brain (4). In gray substance LCHAT activity was absent, or was below a threshold of sensitivity of a method, but in the statistical analysis of a gain and decrease of components of reaction was revealed hydrolase in relation to CHEt activity making 71±25 mkg/mg • h. It is supposed that hydrolase activity of gray substance belongs to a cholesterolesterase [5].Application new the en-

zymatic of technologies and the data obtained with their help result in need of revision and reconsid -

eration of many earlier obtained experimental data about mechanisms of quantitative reorganizations

of lipidom of different bodies, cells, ultrastructures and gives new opportunities for an explanation

of difficult metabolic interactions of their lipid component. In white substance of a brain of rats meta-

bolic relationship in system phospholipids (PHL) – cholesterol (CH) – the cholesterol ether (CHEt)

corresponds to formula : PHL => CH => СHEt. In gray substance of a brain of rats of their relation-

ship others: PHL <= СHEt => CH .

List of references

1.  Brokerkhof X., Jensen of R. Lipolytic enzymes: – M., World, 1978, 396 P.

2.  Gribanov G.A., Minyaev M.V.Questions of medical chemistry. -1992, -vol. 38, No. 2, – P. 59–61.

112 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

3.  Gribanov G.A., Sergeyev S.A.Questions of medical chemistry. -1975, – No. 6, – P. 652–654. 4.  Collet X., Francone O., Besnard F., Fielding C.J. Secretion of lecithin: cholesterol acyltransferase by brain neuroglial cell lines. //Biochemical and Biophysical Research Communications. 1999. –

vol. – 258. – No. 1. P. 73–76.

5.  Morinaga N., Maeda A., Mizuno T., Bunya M., Sugihara S., Sugihara A. Synthesis of fatty acid sterol esters using cholesterol esterase from Trichoderma sp. AS59. //Enzyme and Microbial Technology. 2011. – vol . 48. – No. 6-7. P. 498-504.

УДК 602.6.615.373

НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫЙ ЭФФЕКТ КАРБАМИЛИРОВАННОГО ЭРИТРОПОЕТИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ Калинина Т.И.1, Черемных А.М1., Юрин В.Л.1, Романова Г.А.2, Шакова Ф.М.2

1Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, ФГУП «ГосНИИгенетика», Москва, Россия, 117545, 1-Дорожный Проезд, д. 1 2Федеральное государственное бюджетное научное учреждение НИИ общей патологии и патофизиологии РАН, ФГБНУ „НИИОПП“ РАН, Россия, Москва, 125315, Балтийская ул.,8 e-mail: [e-mail]

Разработана методика и получены карбамилированные формы гибридных белков на основе эритропоэтина: EPO, EPO-TR, EPO-Fс. Полученные белковые препараты не содержали агрегированных форм и не обладали эритропоэтической биоактивностью. На модели двустроннего фототромбоза сосудов префронтальной коры головного мозга крыс показано, что гибридные белки обладают ноотропной и нейропротективной активностью.

Ключевые слова: карбамилирование; гибридные белки; рекомбинантный Epo; Epo-Fc; EpoTR; ишемия мозга; фототромбоз.

В последние годы было показано, что эритропоэтин (EPO) помимо участия в эритропоэзе обладает нейропротекторным действием. С использованием этой функции EPO связываются перспективы лечения таких распространенных патологий как инсульты и хронические нейродегенеративные болезни (Паркинсона, Альцгеймера). Для проявления нейропротекторных эффектов терапевтические дозы EPO в организме должны быть существенно выше, чем для проявления классической гемопоэтической активности. Основные проблемы создания и применения препаратов связаны с «выключением» гемопоэтической активности и оптимизацией нейропротектор- ной/анти-апоптозной функции EPO за счет пролонгации фармакокинетических свойств.

С этой целью нами были получены варианты генно-инженерных гибридов EPO с Fс- фрагментами иммуноглобулинов человека и фрагментом человеческого гликопептида MUC 1-(TR), несущего дополнительные сайты О-гликозилирования. Анализ фармакокинетических свойств показал, что полученные гибридные белки обладают пролонгированным временем по- лужизни (в 2–2,5раза) по сравнению со стандартным EPO.

Быларазработанаметодикакарбамилирования,позволяющаяполучитьпрепаратыбелков,не обладающих эритропоэтической активностью, но сохраняющих нейропротекторные свойства. При использовании разработанного протокола степень модификации белков, составляла более 90%. Полученные препараты карбамилированных белков (EPO, EPO-TR и EPO-Fc) не содер - жали агрегированных форм и не обладали эритропоэтической биоактивностью, что было по - казано по отсутствию способности инициировать пролиферацию клеток UT-7/epo. Результаты,

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	113

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

полученные нами на модели очагового ишемического повреждения – двусторонний фототромбоз сосудов префронтальной коры головного мозга крыс, показали достоверное сохранение выработанного до ишемии навыка и уменьшение объема повреждения, что указывает на но - отропное и нейропротекторное действие использованных гибридных белков. Интересно, что существенно лучшие результаты по нейропротекции были достигнуты при инъекции крысам карбамилированной формы EРО-TR, которая впервые использовалась для снижения степени нейродегенерации. Полученные рекомбинантные EPO-производные могут в перспективе рассматриваться в качестве нейропротекторных белков для создания терапевтических препаратов, обладающих пролонгированным действием.

THE NEUROPROTECTIVE EFFECT OF CARBAMYLATED ERYTHROPOIETINAND ITS DERIVATES

Kalinina T.I.1, Cheremnych А.M.1, Yurin V.L.1, Romanova G.A.2, Shakova F.M.2

1State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms GosNIIGenetika, 1-th Dorozhny, 1, Moscow, Russia.

2Institute of General pathology and Pathophysiology Russian Academia of Medical Science, Baltijskaya, 8, Moscow, Russia.

e-mail: [e-mail]

By the established procedure we synthesized carbamylated erythropoietin (EPO) and EPO fusion protein: EPO, EPO-TR, EPO-Fc. The resulting carbamylated erythropoietin and derivates do not contain aggregated forms and exhibit no erythropoietic activity. With the model of a bilateral focal ischemic infarction of the rat prefrontal cortex, our study indicates that fusion proteins display neuroprotection and anti-amnestic activity.

Keywords: carbamylation; fusion proteins; recombinant Epo; Epo-Fc; Epo-TR; ischemic brain injury ; photochemical thrombosis.

Besides its established function in erythropoiesis, erythropoietin (EPO) is currently also appreciated for its neuroprotective effects. New treatment strategies with erythropoietin offer exciting opportunities to prevent the onset and progression common pathologies such as stroke and chronic neurodegenerative diseases (Parkinson’s,Alzheimer’s).To displaythe neuroprotective effectsof EPO, the therapeutic dose should be substantially higher than that required for classical hematopoietic activity. The main problem here is to create the drug without hematopoietic activity but with optimized neuroprotective/anti-apoptotic function using prolongation of its pharmacokinetic properties.

To this end, the recombinant erythropoietin and erythropoietin fusion proteins with modified Fc fragments and EPO fusion protein containing TR domain from glycoprotein MUC1-(TR) were pro- duced. TR-domain has additional sites for O-glycosilation. Analysis of pharmacokinetic properties revealed that both the in vitro potency and half-life in circulation of EPO bearing TR or Fc fragments were significantly longer (in 2–2,5 times) compared to the standard EPO.

A carbamylation technique was established. The resulting carbamylated erythropoietin and de-

rivates exhibit no erythropoietic activity, but retains the neuroprotective properties. The degree

of protein modification using this protocol was greater than 90%. These carbamylated proteins (EPO,

EPO-TR and EPO-Fc) have no aggregated forms and lack erythropoietic bioactivity that was shown

by the absence of the ability to initiate the proliferation of UT-7 cells/epo.

Treatmentof ratswithEPOandEPO fusionproteinsafterphotothrombosisof cortexresultedin res- toration of passive avoidance response and diminished volume of ischemic damage. Interestingly, our

114 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

study indicates that EPO-Fc and EPO-TR display neuroprotection and anti-amnestic activity, while EPO-TR demonstrates prolonged activity. Thus, these recombinant EPO-fusion proteins offer a number of exciting avenues to develop novel therapeutic drug with prolonged effect.

УДК 577.29

НАСЛЕДСТВЕННАЯ «ТАЙВАНЬСКАЯ» МУТАЦИЯ D7H БЕТА-АМИЛОИДА ВЛИЯЕТ НА ЕГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ИОНАМИ ЦИНКА И НЕЙРОТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Куликова А.А.,1 Митькевич В.А.,1 Кечко О.И.,1 Мезенцев Ю.B.,1,2 Иванов А.С.,2 Козин С.А.,1 Макаров А.А.1 1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, Россия

119991, Москва, ул. Вавилова, д.32 2Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский

институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича», Москва, Россия 119435, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8

e-mail: [e-mail]

Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, бета-амилоид, цинк, димеризация, мутация, агрегация, цитотоксичность.

Согласно «амилоидной гипотезе» агрегация бета-амилоидного пептида (Aβ) лежит в основе развития болезни Альцгеймера. Молекулярный механизм агрегации Аβ остается неясным. Важную роль в этом процессе играют ионы цинка. Наличие модификаций в металл-связываю- щем домене Aβ(1–16) существенно влияет на агрегационные и токсические свойства Аβ(1–42). Недавно была выявлена новая, так называемая «тайваньская» мутация D7H в Аβ(1–16), способствующая формированию токсичных агрегатов Аβ. Мы охарактеризовали взаимодействие Аβ(1–16), содержащего замену D7H (Аβ(1–16)D7H), с ионами цинка, а также цитотоксические свойства полноразмерной формы Аβ(1–42) с этой мутацией. С помощью изотермической калориметрии титрования мы установили, что в отличие от нативной формы Аβ(1–16), которая связывает один ион цинка, Аβ(1–16)D7H имеет два сайта взаимодействия с ионами цинка, причем с первым сайтом связывается один ион Zn2+, а со вторым – два иона Zn2+. Используя метод спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса было показано, что Аβ(1–16)D7H не образует гомодимеры, однако образует высокоафинные стабильные гетеродимеры с Аβ(1–16) в присутствии ионов цинка. Были охарактеризованы цитотоксические свойства Аβ(1–42)D7H на нейро-

нальных клетках человека NSC-hTERT, клетках нейробластомы SK-N-SH и микроглии А-172. Показано, что пептид Аβ(1–42)D7H оказывает более выраженное цитотоксическое действие на клетки NSC-hTERT и SK-N-SH, чем нативный Аβ(1–42), вызывая в них апоптоз. Наиболее вы- раженный токсичный эффект пептид Аβ(1–42)D7H оказывает на клетки NSC-hTERT, в то время как клетки микроглии А-172 были практически не чувствительны к действию данного пептида, что является свидетельством его селективного действия на нейрональные клетки. Таким обра - зом, Аβ, несущий мутацию D7H, может модулировать патогенную олигомеризацию интактного Аβ и усиливать его нейротоксические свойства.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-24- 00100).

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	115

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

FAMILIAL“TAIWANESE” D7H MUTATION OFAMYLOID BETAAFFECTS ITS INTERACTION WITH ZINC IONSAND NEUROTOXIC PROPERTIES

KulikovaA.A.1, Mitkevich V.A.1, Kechko O.I.1, Mezentsev Y.V.1,2, IvanovA.S.1,2, Kozin S.A.1,2, MakarovA.A.1

1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia

Vavilov street 32, 119991 Moscow, Russia

2Orekhovich Institute of Biomedical Chemistry, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russia

Pogodinskaya street 10, 119832 Moscow, Russia. e-mail: [e-mail]

According to the “amyloid cascade hypothesis” aggregation of beta-amyloid peptide (Aβ) is the key event in the development ofAlzheimer’s disease.The molecular mechanism ofAβ aggregation remains unknown. Zinc ions play an important role in this process. Moreover modifications of the metal binding domain of Aβ(1–16) significantly affect the aggregation properties and toxicity of full-length Aβ(1–42). Recently, a new “Taiwanese” D7H mutation of Aβ(1–16) that promotes formation of toxic aggregates of Аβ was identified. We have characterized interaction of the D7H mutant of Aβ(1–16) (Aβ(1–16)D7H) with zinc ions, as well as cytotoxic properties of the full-length form of Aβ(1–42), which incorporates this mutation. Using isothermal titration calorimetry, we have found that unlike the native form of Aβ(1–16), which binds one zinc ion, Aβ(1–16)D7H has two sites of interaction with zinc ions. The first site binds one zinc ion and the second – two zinc ions. By surface plasmon resonance spectroscopy we have showed thatAβ(1–16)D7H does not form homodimers, but in the presence of zinc ions it forms stable heterodimers with high affinity to Aβ(1–16). We have characterized the cytotoxic properties of Aβ(1–42)D7H on the human neuronal NSC-hTERT cells, neuroblastoma SK-N- SH cells and microglia A-172 cells. It has been shown that the Aβ(1–42)D7H peptide induced apoptosis of NSC-hTERT and SK-N-SH cells and had a more pronounced cytotoxic effect than the native Aβ(1–42). The strongest toxic effect of Aβ(1–42)D7H peptide has been observed for the NSC-hTERT cells, while microgliaA-172 cells are virtually not sensitive to the peptide, indicating selective effect ofAβ(1–42)D7H on the neuronal cells.Thus, the D7H mutation inAβ(1–42) could modulate pathogenic oligomerization of the intact Aβ and enhance its neurotoxic properties.

This work was supported by the Ministry of Education and Science of the Russian Federation (project № 14-24-00100).

УДК 581:612.017.1:615.272

ВЛИЯНИЕ БИОФЛАВОНОИДОВ ЛОТОСА ОРЕХОНОСНОГО НА ФАГОЦИТАРНУЮ

АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛЛОВ

Ломтева Н.А., Кондратенко Е.И., Касимова С.К., Яковенкова Л.А., Кондратенко К.Н.

ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет», Астрахань, Россия

414000, Астрахань, пл. Шаумяна, 1 [e-mail]

В работе исследовано влияние биофлавоноидов лотоса орехоносного на показатели фагоци-

тарной активности нейтрофилов крови крыс и проведено сравнение с иммуностимулирующим действием экстракта эхинацеи. Анализ полученных результатов позволил выявить наличие

116	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

у экстракта лотоса орехоносного иммунотропных свойств, степень выраженности которых определяется концентрацией экстракта.

Ключевые слова: фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, иммунитет, фагоцитоз, эхинацея, биофлавоноиды, лотос орехоносный.

В работе изучали влияние биофлавоноидов лотоса орехоносного на фагоцитарную активность нейтрофилов. Исследование выполнено на самках белых беспородных крыс. Животные были разделены на группы: 1 – животные, получавшие физиологический раствор; 2 – животные, получавшие экстракт эхинацеи; 3–6 – животные, получавшие экстракты плодов лотоса орехоносного в дозе 50, 100, 200, 400 мг/кг соответственно. Фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали по фагоцитарному числу (ФЧ) и фагоцитарному индексу (ФИ). Полученные данные были подвергнуты статистической обработке.

Полученныерезультатысвидетельствуюто наличииу экстрактаплодовлотосаорехоносного иммуностимулирующего действия в отношении фагоцитарных иммунных реакций, преимущественно ФИ. Увеличение ФЧ показательно только лишь под влиянием больших концентраций (эквивалентных 200 и 400 мг/кг) экстракта плодов лотоса орехоносного. Сравнение влияния на фагоцитоз экстрактов плодов лотоса орехоносного и эхинацеи демонстрировало более интенсивный эффект первого.

UDC 581: 612.017.1: 615,272

EFFECT OF NELUMBO NUCIFERABIOFLAVONOIDS ON NEUTROPHILES PHAGOCYTIC ACTIVITY

Lomteva N.A., Kondratenko E.I., Kasimova S.K., Yakovenkova L.A., Kondratenko K.N.

Astrakhan State University, Astrakhan, Russia 414000, Astrakhan, pl. Shaumyana 1 [e-mail]

We studied the action of Nelumbo nucifera bioflavonoids on the performance of the phagocytic activity of blood neutrophils in rats. In addition, a comparison of it with those under the influence of Echinacea extract, studied immunostimulant. Analysis of the results revealed that Nelumbo nucifera extracts have immunotropic properties and its effects is determinated by the doses of extract.

Keywords: phagocytic index, phagocytic number, immunity, phagocytosis, Echinacea extract, bioflavonoid, Nelumbo nucifera extract.

In this paper we studied the effect of Nelumbo nucifera bioflavonoids on the phagocytic activity

of neutrophils. The study was performed in female albino rats. The animals were divided into groups: 1 – the animals receiving saline; 2 – animals receiving the extract of Echinacea; 3–6 – animals re- ceiving Nelumbo nucifera fruit extracts in a dose of 50, 100, 200, 400 mg/kg. Phagocytic activity of neutrophils was investigated by phagocytic number (FN) and phagocytic index (PI). The data were subjected with statistical processing.

The results indicate of immunostimulatory action against phagocytic immune responses of Nelumbo nucifera extract, mainly FI. Image FN indicative only under the influence of large con- centrations (equivalent to 200 and 400 mg / kg) fruit Nelumbo nucifera extract. Comparison of the effect on phagocytosis of Nelumbo nucifera extract and Echinacea demonstrated more intense effect of Nelumbo nucifera.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	117

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

УДК 579.6:602.6:577.113:579.842.11

СОЗДАНИЕ НАБОРА ЛИНЕАРИЗОВАННЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ РАСТВОРИМОСТИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ Радевич Д.С., Щеколова А.С., Рымко А.Н., Квач С.В., Зинченко А.И.

Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси, Минск, Республика Беларусь

220141, г. Минск, ул. Купревича, д. 2, e-mail: [e-mail]

Впервые сконструирован набор унифицированных линеаризованных плазмидных векторов, несущих гены ряда белков-партнеров, обеспечивающих повышение растворимости и экскрецию рекомбинантных белков в периплазматическое пространство.

Ключевые слова: Escherichia coli, линеаризованный вектор, белок-партнер.

Продукция природных и модифицированных белков в клетках рекомбинантных штаммов Escherichia coli является основным этапом биотехнологического получения многих хозяйственно важных продуктов. Несмотря на удобства работы с клетками E. coli, многие белки продуцируются в них в форме неактивных водонерастворимых белковых агрегатов. Данное препятствие в значительной степени может быть преодолено путем создания химерных конструкций, содержащих кроме целевого белка также белки-партнеры, позволяющие увеличить его растворимость [1, 2].

Целью настоящей работы явилось создание набора унифицированных векторов, кодирующих различные белки-партнеры, повышающие растворимость целевого белка.

В результате получен набор унифицированных линеаризованных векторов, несущих гены ряда белков-партнеров (глутатион-S-трансферазы, дисульфид-изомеразы, дисульфидоксидоредуктазы, N-утилизирующей субстанции A и тиоредоксина) и лидерных последовательностей бактериальных белков (азурина и pelB Pseudomnas aeruginosa), пригодных для дальнейшего изучения повышения растворимости целевых белков. Все полученные векторы на 3’- и 5’-концах кодирующей цепи содержат идентичные последовательности, что позволяет встраивать ген, кодирующий целевой белок, во все векторы набора методом лигазо-независимого клонирования.

Литература

1.  Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study // N.S. Berrow., K. Bussow, Coutard B. et al. //Acta Crystall. Sect. D Biol. Crystall. 2006. Vol. 62. P. 1218–1226.

2.  Chambers S.P., Swalley S.E.Designing experiments for high-throughput protein expression // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 498. P. 19–29.

CONSTRUCTINGASET OF LINEARIZED VECTORS TO ENHANCE SOLUBILITY

OF RECOMBINANT PROTEINS

Radevich D.S., ShchokolovaA.S., RymkoA.N., Kvach S.V., ZinchenkoA.I.

Institute of Microbiology, Belarus National Academy of Sciences, Minsk, Belarus 220141, Minsk, Kuprevich str., 2; e-mail: [e-mail]

A set of uniform linearized plasmid vectors carrying genes of some partner proteins enhancing

solubility and secretion of recombinant proteins into periplasmatic area was originally constructed. Keywords: linearized plasmid vector, partner protein, Escherichia coli

118	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015