Novicka_praktykum_z_biotehnologii_ch1

енцефаломієліту коней, ІНАН, грип коней, сап, японського та венесуельського енцефалітів, атрофічний риніт свиней, трансмісивний гастроентерит свиней, ентеровірусний енцефаломієліт, репродуктивнореспіраторний синдром, інфекційний бронхіт і ларинготрахеїт птиці, вірусний гепатит качок, вірусний ентерит качок, віспа курей, сальмонельоз курей, хвороба Гамборо, хвороба Марека; хвороб кролів – міксоматоз, вірусна геморагічна хвороба; хвороб риб - вірусна геморагічна септицемія, весняна віремія коропа; хвороб бджіл - американський та європейський гнилець; токсини Cl. botulinum, Cl. tetani.

ІІІ група – штами збудників брадзоту, ентеротоксемії, некробацильозу, псевдотуберкульозу, правця, вібріозу, пастерельозу, інфекційної агалактії овець та кіз; ентеровіруси, аденовіруси, трихофітії, мікроскопії, стафілококозів, стрептококозів, диплококозів та інші з невисоким ступенем патогенності.

Робота з мікроорганізмами І, ІІ та ІІІ груп проводяться в спеціально обладнаних лабораторіях, забезпечених усіма засобами охорони праці й безпеки персоналу, що в них працює, відповідають вимогам повної ізоляції та унеможливлюють небезпеку виносу збудників.

Усі штами мікроорганізмів, що використовуються у виробництві імунобіологічних препаратів для ветеринарії в умовах вітчизняних підприємств зберігаються в депозитарії Державного науково-контрольного інституту біотехнології та штамів мікроорганізмів, в спеціальних лабораторіях (музеях) або колекціях живих культур збудників підприємств

– виробників.

Музеї колекцій штамів мікроорганізмів забезпечують:

колекціонування, підтримування та зберігання штамів мікроорганізмів, з якими дозволена робота в цих установах;

облік усіх наявних штамів мікроорганізмів, токсинів та отрут;

вивчення властивостей мікроорганізмів, що необхідні для паспортизації штамів, токсинів і отрут;

контроль за зберіганням і використанням штамів мікроорганізмів у лабораторіях підприємства.

11

З метою забезпечення зберігання унікальних, еталонних і виробничих штамів мікроорганізмів персонал музею штамів мікроорганізмів зобов‘язаний створити належні умови з підтримки й зберігання цих штамів. Музеї штамів мікроорганізмів залежно від виду біологічних агентів, що зберігаються, повинні бути облаштовані протипожежною та охоронною сигналізацією, з гратами на вікнах та мати металеві двері.

Для збереження штамів застосовують різні методи, що мають гарантувати збереження життєдіяльності та характерних властивостей мікроорганізмів.

Методи тривалого зберігання призначені для культури тривалого зберігання - це культура еталонного штаму в умовах тривалого зберігання.

Для тривалого зберігання застосовують:

умови кріоконсервування - зберігання при температурі –40°С , – 70°С, –196°С у рідкому азоті з додаванням 10% глицерину на строк до 5 років (ефективний метод збереження вірусних еталонних штамів);

умови середнього температурного режиму на строк зберігання 6 -

12 міс. Вирощену у напіврідкому середовищі (0,5% м‘ясопептонного агару або напівголодного, 0,4% м‘ясопептонного агару) у пробірках культуру заливають простерилізованою вазеліновою олією на висоту шару 1 см або на скошеному агаризованому середовищі при + 4°С – +8°С в холодильнику (для бактеріальних культур). В умовах сусло-агарового середовища в пробірках великого діаметру при температурі +4°С – +8°С для зберігання дріжджів. В умовах сусло-агарового, середовища Сабура або картопляно-глюкозного середовища в пробірках великого діаметру при температурі +4°С – +8°С для зберігання міцеліальних грибів.

умови ліофілізації – зберігання еталонних штамів у герметично запаяних ампулах у ліофільно-висушеному стані зі збереженням життєздатності та характерних властивостей – строк зберігання до 5 років. На відміну від широко розповсюдженої методики ведення культур мікроорганізмів, заснованої на необмежених послідовних (лінійних) пересівах, дана схема ведення зводить до мінімуму

12

кількість пасажів еталонної культури, проведених від моменту відновлення ліофілізованого матеріалу до цільового використання. Такий підхід дозволяє знизити ймовірність небажаних мутацій, що призводять до втрати еталонних властивостей штаму або випадкового забруднення. Забракована лінія еталонної культури може бути в будь-який момент замінена на нову. Цей метод дозволяє уникнути необхідності поповнювати запаси культури тимчасового зберігання за рахунок повторних пасажів еталонного штаму через поживні середовища і подовжує ―термін служби‖ культури, отриманої з однієї ампули.

Для тимчасового зберігання культуру еталонного штаму зберігають на відповідному середовищі при +4°С – +8°С - 1-3 місяці.

Пробірки та ампули із тест-штамами мікроорганізмів повинні мати чітке маркування, яке дозволяє ідентифікувати тест-штам, із зазначенням назви, номера тест-штаму мікроорганізму і дати його пересіву чи ліофілізації. Тест-штами мікроорганізмів слід зберігати відповідно до вимог у холодильнику (морозильній шафі) або у вогнетривкій шафі (сейфі) в контейнерах. Ззовні чи з середини шафи (сейфу) та холодильника розміщують список із переліком тест-штамів мікроорганізмів, що зберігаються.

Підтримання унікальних, виробничих та еталонних штамів

мікроорганізмів здійснюють пасажуванням на чутливих моделях або на природно-сприйнятливих тваринах.

З метою зберігання чистоти унікальних виробничих і еталонних штамів мікроорганізмів і запобігання їх контамінації проводять пасажування штамів з дотриманням стерильності в умовах боксу. Одночасно в одному боксі можна пасажувати не більше одного штаму збудника хвороби. Кількість пасажів тестового мікроорганізму на поживних середовищах: з моменту його відновлення до моменту його цільового використання за можливості повинна бути мінімальною. Запаси еталонної культури не повинні поповнюватися за рахунок культури тимчасового зберігання. Контроль еталонного штаму на чистоту і відсутність дисоціації необхідно проводити перед закладанням на тривале зберігання і перед поповненням запасів культури тимчасового зберігання. Для цільового використання придатні культури еталонного штаму, що

13

пройшли з моменту висіву із культури тимчасового зберігання не більше 5

пасажів. Культура еталонного штаму, що пройшла не більше 5 пасажів після висіву з культури тимчасового зберігання та призначена для використання називається культура цільового використання.

З метою контролю зберігання властивостей штамами мікроорганізмів у музеях проводять періодичну перевірку їх відповідності паспортним даним. Паспорт штаму – мікроорганізму (вірусу) –

офіційний документ, що містить повну назву штаму, відомості про походження, коротку характеристику морфологічних, біохімічних та культуральних властивостей штаму, призначення тест-штаму, умови підтримування та культивування.

Відомості про всі штами мікроорганізмів, які надійшли в музеї та їх рух підлягають реєстрації в спеціально прошнурованих і пронумерованих книгах, скріплених печаткою і підписом керівника установи. З цією метою у лабораторіях, що зберігають штами мікроорганізмів необхідно вести такі документи: журнал обліку надходження штамів мікроорганізмів; інвентарна книга виробничих і контрольних штамів мікроорганізмів; журнал обліку руху виробничих або контрольних штамів;книга обліку зараження тварин; книга обліку виділених культур і їх знищення; книга записів результатів перевірки властивостей виробничих або музейних штамів вірусів, бактерій, грибів, токсинів і отрут тваринного походження; паспорт.

ЗАВДАННЯ.

1.Створення запасів культури тимчасового зберігання з культури тривалого зберігання за умов середніх температур. З

пробірки з культурою тривалого зберігання (під маслом або на скошеному агарі), призначеною для поповнення запасів, зробити висіви на щільне або напіврідке агаризоване середовище в пробірках (10–12 пробірок залежно від обсягів роботи). Посіви інкубувати при оптимальній температурі протягом 18–24 годин. Культури, що виросли, зберігати у холодильнику протягом 1–2 місяців.

2.Створення запасів культури тимчасового зберігання з культури тривалого зберігання за умов кріоконсервування.

Температуру кріопробірки з запасів еталонної культури довести до

14

кімнатної температури. Вміст акуратно перемішати, перенести у пробірку з 8–10 см3 поживного бульйону та інкубувати при оптимальній температурі протягом 18–20 годин. Після інкубації з поживного бульйону культуру висіяти у дві пробірки зі скошеним поживним агаром та інкубувати у термостаті при оптимальній температурі. Один із посівів на скошеному поживному агарі використати для контролю чистоти і морфології культури. Другий посів використовують для створення запасів культури тимчасового зберігання.

3. Порядок відновлення ліофілізованої еталонної культури мікроорганізмів. Витягнутий кінець ампули з ліофілізованою культурою протирають етиловим спиртом та нагрівають над полум‘ям пальника. Вологим кінцем стерильного ватного тампона торкаються нагрітої частини, внаслідок чого з‘являються тріщини. Кінець ампули накривають стерильною марлевою серветкою й обламують пінцетом (якщо ліофілізована культура має іншу упаковку, при її розкритті використовують інші асептичні умови).

Потім серветку обережно знімають і разом із залишками скла занурюють у дезрозчин. До ампули вносять необхідний поживний бульйон для регідратації. Вміст ампули перемішують, переносять стерильною пастеровською піпеткою або шприцом у пробірку з поживним бульйоном чи на щільне поживне середовище й інкубують при оптимальній для конкретного тест-штаму температурі протягом 18–48 годин.

Після інкубації з поживного бульйону чи на твердому поживному середовищі проводять висів петлею на 2 пробірки скошеного поживного агару. Посіви інкубують при оптимальній температурі для конкретного тест-штаму.

Одну пробірку з посівом використовують для контролю чистоти та морфологічних властивостей штаму. Другий посів на скошеному поживному агарі використовують для створення запасів еталонної культури тривалого зберігання.

15

Лабораторна робота №3.

СЕЛЕКЦІЯ ШТАМІВ ДЛЯ СТВОРЕННЯ СУПЕРПРОДУЦЕНТІВ ТА ВАКЦИННИХ ШТАМІВ.

Мета: навчитися виділяти штами-мікроорганізми за селекційними маркерами.

Усі процеси життєдіяльності мікроорганізму направлені на безупинний ріст та поділ до тих пір, поки середовище буде містити мінімальні умови для цього. Усі процеси у бактеріальній клітині підпорядковані жорстким правилам економії. Жоден з первинних метаболітів не утворюється більше необхідного. Для промислових завдань генетична програма клітини повинна бути перебудована таким чином, щоб спрямувати потенціал біосинтезу клітини не на самовідтворення, а на виробництво необхідного продукту. Виділення та підбір об‘єкта – важливий етап біотехнологічного процесу. Проте шляхом простого підбору отримати високоактивні продуценти не вдається, тому стратегія селекційної роботи з мікроорганізмами полягає у пошуку природних форм, які володіють корисними якостями для людини (синтез цінної сполуки, висока швидкість росту, здатність до засвоєння дешевих та доступних матеріалів) та створенню на їх базі промислових штамів. Це відбувається шляхом зміни регуляції метаболічної активності мікробної клітини.

Методи сучасної селекції – це сукупність маніпуляцій, за допомогою яких змінюють генетичну програму мікроорганізмів.

Генетичне конструювання in vivo – отримання та виділення мутантів з використанням різних способів обміну спадковою інформацією живих мікробних клітин.

Генетичне конструювання in vitro базується на використанні генетичної інженерії (створення рекомбінантних ДНК). Проте, цей поділ умовний, тому що методи взаємопов‘язані.

Виявити зміни генетичної програми мікроорганізму, отримані незалежно яким конструюванням, можна лише за відбором мутантів. Наприклад, щоб виявити колонію Lac- (нездатність зброджувати лактозу)

16

серед колоній E. coli дикого типу (Lac+) необхідно продивитися 100000 клонів.

Клон - (від грец. klon – гілка нащадків) – популяція клітин або організмів, що походять від загального предка шляхом безстатевого розмноження.

Коли неможливо провести прямий відбір мутантів, досліджують колонії на індикаторних чашках, застосовують тест-культури мікроорганізмів, метод відбитків (реплік). За необхідністю вирощують кожну окрему колонію та визначають у культуральній рідині активність синтезованої речовини.

Метод індикаторних чашок полягає у вирощуванні окремих колоній у чашках з середовищем з індикатором, якій виявляє різницю рН між колоніями, які метаболізують або ні певні вуглеводи. Мутанти різняться за коліром колоній та фенотипом (на агарі з трифенілтетразолієм колонії, які не зброджують лактозу, набувають червоного коліру, а колонії які зброджують залишаються незафарбованими). Інколи вносять субстрати, які змінюють прозорість середовищ – навколо колоній мутантів утворюються прозорі зони.

Метод тест-культур вимагає використання ауксотрофів та чутливих до антибіотиків культур. Характеристику мутантів проводять за зоною росту або пригнічення, а також структурою, формою та прозорістю колоній. Отримання та вдосконалення штамів-продуцентів амінокислот вимагає перевірки великої кількості мутантів. Ефективність селекції тим вища, чим більший об‘єм матеріалу, що піддається відбору. Між тим під час «відбору у ручну», коли виділяються окремі колонії та перевіряються в умовах ферментації в колбах на гойдалках, вірогідність находження високоактивних штамів обмежується кількістю матеріалу. Тому попередня оцінка активності штамів-продуцентів амінокислот дозволяє виключити заздалегідь безперспективні мутанти, і відповідно, скоротити кількість варіантів, що потребують кінцевої перевірки.

Принцип дії методу тест-культур базується на явищі синтрофізму, коли під час сумісного висіву на мінімальне поживне середовище навколо колоній продуцентів утворюються зони росту мікробів, які потребують відповідні амінокислоти. Розмір зон знаходиться у прямій залежності від

17

кількості амінокислоти, що синтезується. Колонії, що утворюють найбільші зони, використовують для подальших перевірок за допомогою більш складних та точних способів оцінки - ферментацією у колбах та ферментерах. Для використання цього методу у селекції штамівпродуцентів амінокислот необхідною умовою є наявність відповідних тест-культур, ауксотроф них за певними амінокислотами.

Метод відбитків, запропонований Ледерберг Д, Ледерберг Е, 1952р. Сутність методу полягає у відборі мутантів, що здатні рости на різних середовищах:

1.Чашки Петрі із звичайним середовищем засівають культурою мікроорганізму, таким чином щоб на ній виросло 50-200 колоній.

2.Стерильний оксамит або фільтровальний папір натягують на металевий циліндр з діаметром, що відповідає чашці Петрі, та закріплюють. Чашки з колоніями прикладають до поверхні оксамиту.

3.Потім до цього оксамиту з відбитками колоній прикладають чисті чашки з різними середовищами.

4.Після культивування на них утворюються колонії у аналогічному розташуванні. На чашках з мінімальними середовищами можна виявити ауксотрофні мутанти. Різні модифікації цього метода використовуються для виділення мутантів з поживними потребами, а також мутантів чутливих до фізичних, хімічних та біологічних факторів (температура, фаги, антибіотики).

Метод відбитків можна модифікувати застосуванням безпосередньо у середовищі антибіотиків, які убивають ростучі клітини. Наприклад,

ауксотрофний мутант E. сoli за треоніном не росте на мінімальному середовищі без треоніну. В таких умовах пеніцилін буде вбивати лище прототрофні клітини. Якщо необхідна мутація виникла спонтанно з частотою 10-7, тоді достатньо передивитися декілька тисяч колоній, які вижили після обробки пеніциліном, щоб знайти колонію необхідної мутації.

Якщо це стосується спороутворюючих мікроорганізмів, частку ауксотрофних мутантів можна підвищити прогріванням культур, які проростають у мінімальному середовищі. Прототрофи, які проростуть при

18

нагріванні загинуть, а ауксотрофи, які перебувають у вигляді спор, виживуть та проростуть на збагаченому середовищі.

Міцеліальні гриби для виділення ауксотрофних мутантів використовують метод збагачення при фільтруванні. Під час культивування на мінімальних середовищах прототрофні клітини поділяються та утворюють великі частки, які затримуються фільтром, а клітини, які не діляться промиваються у фільтрат.

Ауксотрофні мутанти представляють значний інтерес для селекції промислових мікроорганізмів. Наприклад, гомосеринові ауксотрофи глутаматпродукуючих коринеподібних бактерій Corynebacterium glutamicum є ефективними продуцентами лізіну. Мутації ауксотрофності можуть підвищувати вихід цілевого продукту, змінюючи регуляцію його біосинтезу. Розповсюджений метод отримання продуктивних штамів – виділення ауксотрофів та відбір псевдоревертантів, які несуть регуляторні мутації. Ауксотрофні мутанти використовують під час отримання рекомбінантних штамів у генетичних схрещеннях. Вміст мутантів у мікробній популяції можна збільшувати шляхом мутагенезу. Вибір мутагену визначається типом мутації, яку бажано отримати, а також ефективність мутагену по відношенні до даного організму. Досягнення молекулярної генетики дозволили проводити відбір продуцентів за стійкістю їх до структурних аналогів цільового продукту. Метод базується на регуляції ферментів за принципом зворотного зв‘язку кінцевого продукту біосинтетичного шляху. Підвищення концентрації метаболіту інгибує активність ферменту, який приймає участь у синтезі метаболіту, або репресує синтез цього ферменту. Наприклад, за наявності глюкози та NH4+ клітини багатьох бактерій синтезують усі необхідні для життєдіяльності азотмісні сполуки. Якщо у середовище додати певну амінокислоту, то її синтез швидко припиняється. В цих умовах виживають лише де які клітини - мутанти з порушеною регуляцією активності та синтезу ферментів. Бажані ті мутанти у яких фермент зберіг функціональну активність, але втратив чутливість до інгибуючої дії кінцевого продукту або його аналога. Синтез ферменту стійкий до надлишку продукту або його аналога. Подібні мутації призводять до

19

появи зверхпродуцентів, які синтезують цільовий метаболіт у аномально високих концентраціях.

Якщо необхідно досягти накопичення не кінцевого, а проміжного продукту біосинтетичного шляху тоді використовують мутантів, у яких заблокований наступний за інтермедіатом етап синтезу. Такий мутант ауксотрофен - росте лише при додаванні у середовище культивування речовини, яка є продуктом блокованої реакції.

В селекції продуцентів ферментів важливе значення має отримання конститутивних мутантів. З цією метою можна використовувати метаболізуючи аналоги субстратів, не здатних викликати індукцію. На чашках, де такі сполуки є єдиним джерелом вуглецю та енергії утворюються колонії лише мутантів, які синтезують відповдні ферменти конституітивно.

Мутанти, стійки до пеніциліну, бацитрацину, поліміксину, ністатину, кабіцидіну можуть бути селективно отримані на середовищах, які містять інгибуючи концентрації цих антибіотиків. В них часто спостерігається зміна проникності клітинної мембрани, яке підвищує їх продуктивність. Так, стійки до пеніциліну мутанти Cor. glutamicum продукують на 15-20% більше лізину, ніж висхідні чутливі штами. Мутанти Cephalosporium acremonium стійкі до ністатину, кабіцидину виділяють у середовище більше 10 г/л цефалоспорину С. Мутанти Trichoderma reesei стійкі до кабіцидіну секретують підвищену кількість целюлози.

ЗАВДАННЯ.

1.Відібрати клони на різних чашках (наприклад, відбір клонів, що синтезують α- інтерферон).

20