Novicka_praktykum_z_biotehnologii_ch1

Рис.1. Схема заповнення колонки. Суспензія сорбенту безперервно перемішується у лійці (1), після осадження у буфері (2) адсорбент (3) ущільнюється та затримується диском з пористого скла (4),через який проходить буферний розчин

Після утворення стовбура сорбенту заввишки 5–10 см, кран відкривають так, щоб швидкість витікання рідини становила 30–40 крапель за хвилину. Після повного осадження суспензії слід пропустити буфер через колонку ще декілька годин для її повного ущільнення та зрівноваження. Потім на поверхню стовбура сорбенту поміщують диск фільтрувального паперу.

Хроматографію білків, як правило, проводять на холоду, в спеціально обладнаних приміщеннях при температурі 4–6оС. Фракції білка збирають вручну або автоматично. Концентрацію білка вимірюють за допомогою спектрофотометра (при довжині хвилі 280 мкм) або за допомогою приладу типу Uvicord (LKB, Швеція).

Очищення γ-глобуліна за допомогою колонкової іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі

1.Підготовка іонообмінника. Залити 50,0г порошку ДЕАЕ-целюлози 1000 мл дистильованної води для набухання. Після того як більша частина порошку посяде, відсмоктати надосадову рідину з неосадженими частками порошку (вони забивають колонку та різко знижують швидкість протікання розчинника). Осад знову підіймають у дистильованій воді та після осадження декантують.

2.Підготовка колонки. Якщо не має справжньої колонки, взяти скляний або пластмасовий медичний шприц на 20 мл. Виміряти розмір колонки (h- висота,d-діаметр,v-обєм).

2.1.Закріпити колонку вертикально на штативі.

2.2.На дно колонки помістити диск з паперу завтовшки 3 мм (ватман)

71

2.3.Заповнити колонку іонообмінником – ДЕАЕ-целюлозою. Для цього целюлозу у склянці промити Н2О dest. та заповнити колонку при постійному перемішуванні.

При закритому крані колонки суспензія іонообмінника поступово осідає. Після повного осадження суспензії з метою ущільнення іонообмінника через колонку слід пропустити 100 мл буфера.

2.4.Після заповнення колонки на поверхню сорбенту викласти паперовий диск (см. пункт 2.2.)

2.5. Урівноважуємо колонку. Пропустити 0,5 М NaOH. Вихід NaOH контролювати індикаторним папером. Для визначення об’єму NaOH,

необхідного для активації колонки, слід зробити розрахунки за формулою: S=πr2h де, π –3,14, r– внутрішній радіус колонки, h–висота

іоннообмінника

Наприклад S=3,14*0,752*19,5=35 мл – це один об’єм NaOH.

2.6.Після проходження 1–2 об’ємів NaOH, колонку промити Н2О dest. до рН 8,0-8,5.

2.7.Пропустити 1–2 об’ємів 0,5 М HCl, після чого промити Н2О dest. до рН

6,0.

2.8.Пропустити через колонку 3–4 об’єми 0,02 М фосфатного буфера, рН 6,35. Швидкість протікання 10–15 крап/хв.

3. Проведення колонкової хроматографії.

3.1.Повністю відсмоктати буфер на поверхні іонообмінника у колонці. Досліджуваний матеріал (сироватка кроля оброблена (NH4)2SO4 після

діалізу, см. тема №1) внести на колонку з ДЕАЕ-целюлозою. Білок нашаровувати обережно та дати йому всмоктатися.

3.2.Пропустити через колонку 0,02 М фосфатний буфер, рН 6,35 зі швидкістю протікання 10–15 крап/хв.

3.3.Елюат збирати у флакони по 5 мл. Хроматографію білків слід проводити на холоді (+4+6 оС).

3.4.Концентрацію білка у фракціях визначити за допомогою спектрофотометра (за поглинанням при 280 ммк) або безперервно на приладі типу Uvicord.

3.5.Після закінчення хроматографії матеріалу перекрити кран колонки.

3.6.Іонообмінні целюлози можуть бути використані багаторазово. З

цією метою після кожного експерименту іонообмінник треба

72

регенерувати- пропустити через колонку 0,5 М NaOH, що забезпечує практичне повне видалення зв’язаного з іонообмінником білка. Після чого целюлозу промити дистильованою водою до повного видалення лугу. Після урівноваження ДЕАЕ-целюлози відповідним буфером вона може бути використана вдруге. З часом емність іонообмінників знижується внаслідок руйнації частини іоногенних груп. Тому регенерацію можна проводити не більше 6–8 разів

ЗАВДАННЯ.

1.Зібрати та підготовити колонку для проведення іонообмінної хроматографії висолених білків сироватки крові.

Лабораторна робота №4.

ЗБЕРІГАННЯ БІОПРЕПАРАТІВ

Мета: Опанувати методику підготовки до ліофілізації білоквмісної рідини.

Матеріал біологічного походження надзвичайно нестійкий, тому потребує стабілізації та консервування. В звичайних умовах тривалість збереження більшості біологічних продуктів досить обмежена (декілька діб). Тому були запропоновані різні способи консервування біопрепаратів:

1.КОНСЕРВУВАННЯ ХІМІЧНИМИ РЕЧОВИНАМИ

(глицерін, формалін, фенол, хлороформ, мертіолят натрію). Консервування деякими хімічними речовинами, нажаль, призводить до незворотних перетворень і, у більшості випадків, не є придатними для консервування живих клітин та мікроорганізмів.

2. КОНСЕРВУВАННЯ НИЗЬКИМИ ТЕМПЕРАТУРАМИ

(охолодження та заморожування). Консервування низькими температурами досить розповсюджений метод стабілізації біологічних препаратів та добрий метод зберігання живих клітин, мікроорганізмів та вірусів. Проте, він не достатньо підходить для тривалого зберігання готових біологічних препаратів, вимагає спеціальних умов транспортування та зберігання.

73

3. КОНСЕРВУВАННЯ ЗНЕВОДНЕННЯМ. Консервування зневодненням або висушуванням є найбільш досконалим з запропонованих методів стабілізації продуктів біологічного походження та дозволяє зберігати продукти в звичайних умовах тривалий час. Під час висушування, крім того, знижується вага продукту, що дозволяє економити на упаковці та транспорті.

Зневоднення – технологічний процес, різноманітний комплекс теплових, дифузійних, біологічних та хімічних явищ.

Препарати біологічного походження являють собою складні об‘єкти висушування та характеризуються низкою показників:

початкова вологість

кінцева вологість

рівно вагова вологість

термічні характеристики

електро-фізичні характеристики

массообмінні характеристики

Усі продукти біосинтезу по відношенню до процесу висушування умовно поділяють на два класи:

1.Продукти, що під час зневоднення потребують збереження життєздатності клітин або їх високої активності (антибіотики, ферменти, вакцини).

2.Продукти, які після висушування повинні зберігати свої біологічні властивості (компоненти сухих поживних речовин, сухі поживні середовища).

На даний час з відомих апаратів для висушування використовуються:

1.сушильні апарати з дисковим та форсуночним розпилювачем,

2.вальцеві сушильні апарати

3.Сублімаційні сушильні апарати.

Препарати біологічного походження складні за своїм складом. Вони містять біологічно активні компоненти, органічні сполуки і велику кількість води. Вологі матеріали в залежності від форм зв‘язку та кількості вологи, що поглинулася, поділяють на:

1.Колоїдні;

2.Капілярно-пористі;

3.Капілярно-пористі колоїдні тіла.

74

Одним з основних параметрів, що характеризує взаємодію води з матеріалом, є енергія зв‘язку. Це робота, яку необхідно провести для виділення з матеріалу одного моля води при постійній температурі.

Чим міцніший зв'язок води з матеріалом, тим менший парціальний тиск рівно вагового пару над матеріалом.

Вода у продуктах біосинтезу може знаходитися як у вільному так і у зв’язаному станах. Міцність зв‘язку вологи з матеріалом залежить від природи субстрату та впливає на собівартість та кінетику процесів висушування.

У біологічних матеріалах значна частина води утримується у субстраті фізико-хімічними зв’язками. Усі форми зв‘язування вологи з матеріалом поділяються на три групи:

1. Вода зв’язана хімічно – вода, яка зв‘язана з матеріалом надміцним хімічним зв‘язком. Вода може бути видалена лише під дією хімічних реакцій або інтенсивному тепловому обробітку. Як правило, під час висушування хімічно зв‘язана вода не видаляється.

2.Вода зв’язана фізико-хімічним зв’язком - це волога, що зв‘язана адсорбційно та осмотично. Адсорбційно зв‘язана волога утримується на поверхні біологічних макромолекул ван-дер-ваальсовими силами. Ця вода міститься у цитогелю та енергія її зв‘язку невелика.

3.Вода, зв’язана фізико-механічним зв’язком – вода, що

знаходиться у порах та капілярах матеріалу.

За іншими пропозиціями, воду поділяють на вільну та зв’язану. Молекули вільної води слабко взаємодіють з молекулами матеріалу та відокремлені від останнього шаром молекул зв‘язаної води. Вільна вода володіє якостями звичайної рідини. Задля видалення зв‘язаної води потрібна температура та вакуум більші за аналогічні під час видалення вільної води. Залишкова волога у сухих біопрепаратах має складати не більше 1-3% та являє собою міцно зв’язану воду, яка забезпечує стабільність їх структури.

Метод висушування залежить від:

1.Кінцевої кількості вологи у готовому препараті

2.Характеристики сировини, що висушується.

75

Сировина, що потребує висушування характеризується наступними показниками:

дисперсність;

щільність;

в’язкість;

поверхневий натяг;

теплоємність;

теплопровідність;

температуропровідність.

Дисперсність. Продукти та напівпродукти біосинтезу є складними полідисперсними системами. Дисперсність клітин бактерій змінюється у межах від 0,5 – 1,0 мкм. Від дисперсності висхідного матеріалу залежать фізико-механічні та теплофізичні властивості біомаси. Наприклад, інтенсифікація процесу висушування, розрахунок та проектування сепараторів та теплообмінних апаратів залежить від термолабільності висхідного матеріалу, характеристики зв‘язку вологи, в‘язкості, щільності, поверхневого натягу, теплоємності, теплопровідності, проникливості.

Щільність. У більшості випадків біологічні суспензії мають щільність у диапозоні від 1 до 1,1 г/см3. Для визначення щільності використовується піктометричний метод, набір денситометрів, метод гігроскопічного зважування.

В’язкість – це параметр, якій впливає на гідродинаміку біофак торів та теплообміну. Техніка та методика вимірювання в‘язкості біологічних суспензій різноманітні. Найбільш широко використовуються методи капіляра, вантажу, що падає та метод диску, що обертається (ротаційний віскозиметр).

Більшість культуральних рідин для вирощування бактерій та клітин є ньютонівськими рідинами (рідина, в‘язкість якої при постійному тиску та температурі постійна та не залежить від швидкості зсуву).

Поверхневий натяг. Продукти життєдіяльності мікроорганізмів володіють властивостями поверхнево-активних речовин. Показник поверхневого натягу вимірюють методом занурення кільця та відриву краплі.

76

Теплоємність. Теплоємність мікробіологічних препаратів визначається як відношення кількості тепла, що підведено до різниці температур, що була досягнута. Теплоємність біологічної суспензії при збільшені температури знижується частково, проте залишається нижче теплоємності води.

Теплопровідність. Теплопровідність продуктів біосинтезу при підвищенні та зниженні температури зростає. Зміна теплопровідності пов‘язано зі зміною структури упаковки молекул вологи та сухого матеріалу, а різка зміна у області температури 0оС пояснюється фазовим переходом льоду у рідкий стан.

Температуропровідність. Це показник, що характеризує інерційність матеріалу, що висушується під час охолодження та нагрівання. Температуропровідність при різних концентраціях суспензії у межах від -100 оС до 0оС зменшується зі збільшенням температури. Це пов‘язано зі змінами упакування кристалів льоду. Температуропровідність біологічних суспензій у діапазоні від 0оС до + 100оС практично не змінюється.

МЕТОДИ ВИСУШУВАННЯ

Висушування поділяється на природне (на відкритому повітрі) та штучне (у спеціальному обладнанні).

Штучне висушування поділяється на:

сублімаційне (ліофільне);

конвективне;

контактне;

терморадіаційне;

струмом високої частоти;

комбіноване.

Для висушування біологічних препаратів, як правило, використовують методи сублімації, які забезпечують більш м‘яке висушування. Це пояснюється тим, що під час зневоднення біомаси у клітинах можуть проходити суттєві зміни, викликані підвищенням

77

концентрації різних солей та сполук, дією температури, кисню, рН та ін. Ці зміни можуть призвести до утворення нових сполук, інактивації біологічно активних речовин та гибелі клітин.

СУБЛІМАЦІЙНЕ (ЛІОФІЛЬНЕ) ВИСУШУВАННЯ. Починаючи з 1935 р. метод широко використовується під час виробництва імунобіологічних препаратів. Сутність методу полягає у переході вологи з замороженого стану у газоподібний не проходячи рідкої фази.

Висушування продукту методом сублімації володіє низкою переваг перед іншими методами:

вміст вологи у продукті можна довести до 1-3%;

можливість висушування у ємкостях (флакони, ампули) під вакуумом або у атмосфері інертного газу знижує окисну денатурацію продукту;

маса видаленої вологи легко визначається за зниженням ваги продукту.

Обмеження використання цього методу висушування – не можна використовувати при висушуванні продуктів, що потребують переохолодження або під час заморожування утворюють плівку на поверхні, що обмежує вихід парів сублімаційної вологи.

Процес сублімаційного висушування відбувається у чотири стадії:

1.Попереднє заморожування;

2.Первинне висушування (сублімація у вакуумі);

3.Вторинне висушування або вакуумна десорбція;

4.Закінчення процесу висушування.

Основним фактором, що визначає життєздатність мікроорганізмів, якість та збереженість препаратів у період досушування є температура матеріалів. Для мікроорганізмів доступні більш низькі температури досушування.

Біологічні препарати, що необхідно висушувати складні за своїм складом. Вони містять біологічно активні частини,ю різні органічні та неорганічні сполуки та значну кількість води. Під час заморожування та наступного висушування у біологічних препаратах перебігають різні фізико-хімічні процеси.

78

Кінцевий продукт сублімаційного висушування – сухий біопрепарат з невеликою залишковою вологою, кількість якої впливає на якість готового препарату. Надмірно зневоднений біопрепарат не зворотно втрачає свою активність в той час як підвищена залишкова вологість призводить до швидкої втрати активності під час зберігання.

Перед сублімаційним висушуванням біопрепарати попередньо заморожують. Під час зниження температури розчину нижче 0оС починає кристалізуватися чиста вода. Під час подальшого зниження температури кількість льоду буде зростати і розчин затвердіє. Коли температура розчину, що заморожується досягне -21,2 оС уся рідина переходить у тверду фазу (льод). Температура, при якій виникає таке перетворення, називається евтектичною і є різною для різних матеріалів.

Для ліофільного висушування використовуються спеціальне обладнання у якому у певному режимі підтримується два показника – температура та тиск (вакуум).

Попереднє заморожування продукту, що потребує висушування, є самою важливою стадією сублімації.

Попереднє заморожування повинно відповідати таким характеристикам:

Проводити попереднє заморожування нижче евтектичної точки самого низькотемпературного компоненту речовини, що висушується.

Підтримувати оптимальну швидкість заморожування під час забезпечення мінімально можливих впливів на біологічний об’єкт кристалів льоду та електролітів.

Евтектична точка. Для будь якого складного розчину існує евтектична температура, при якій виникає повне заморожування матеріалу а у замороженій масі не буде вільної вологи. Для визначення евтектичної точки заморожування будь якого розчину використовують ефект різкого збільшення його спротиву під час переходу рідини у твердий стан. Він за своїми характеристиками аналогічний діелектрику та може бути визначений за допомогою прибору для вимірювання питомого спротиву з одночасним виміром температури.

Для більшості біопрепаратів евтектичні температури коливаються у діапазоні -25 до -70 оС.

79

Якщо забезпечено повне попереднє заморожування матеріалу, що висушується, можна створювати вакуум для другої стадії – сублімації льоду.

Якщо вакуум підводиться до неповністю замороженого або переохолодженого матеріалу, тоді спостерігається ефект його спінювання, що різко знижує якість препарату.

Таке значення евтектичної температури складних біологічних розчинів пов‘язано з ефектом коллапса, що виникає, коли матеріал охолоджують нижче евтектичної точки.

Ефект колапсу проявляється у тому, що заморожена система втрачає здатність до повної кристалізації. Температура колапсу не повинна обожнюватися з евтектичною температурою. Вона не залежить від швидкості заморожування та концентрації низькотемпературної розчиненої речовини.

Швидкість заморожування. Температура та швидкість заморожування вологи у складних розчинах залежить від зв‘язку вологи з матеріалом, а процес утворення льоду впливає на структуру сухого каркасу матеріалу. Оптимальною швидкістю заморожування вважається швидкість 1 мм/хв. При такому режимі заморожування починається з боку основи посудини з біопрепаратом та поширюється через шар рідини. При цьому забезпечується утворення оптимальної структури кристалів льоду та вільний вихід води з льодяної матриці.

ЗАХИСНІ СЕРЕДОВИЩА ВИСУШУВАННЯ.

Склад середовищу у якому відбувається висушування біопрепарату відіграє найбільшу роль при ліофільному висушуванні. Речовини, що використовуються під час висушування називаються кріопротектори.

Кріопротектори за відношенням до мембранного апарату клітини поділяють на:

1.Ендоцелюлярні (що проникають у середину клітини);

2.Екзоцелюлярні (що не проникають). Вони адсорбуються на зовнішній оболонці клітини та знижують її проникливість для води та біологічно активних речовин, сповільнюють процеси утворення внутрішньоклітинного льоду, захищають від механічних пошкоджень кристалами льоду.

80