Novicka_praktykum_z_biotehnologii_ch1

Техніка користування фазово-контрастним пристроєм така:

1.Звичайний конденсор у світловому мікроскопі замінюють на фазово-контрастний. Диск револьвера мікроскопа повертають так, щоб у віконці з'явилась цифра "0".

2.Замінюють об'єктив 40 х на об'єктив 40 х Ф (фазовий).

3.На предметний столик кладуть препарат (наприклад, "роздавлена крапля" при дослідженні живих бактерій). Установлюють світло за Келером, користуючись об'єктивом 8х.

4.Встановлюють об'єктив 40 х Ф.

5.Замінюють окуляр на допоміжний мікроскоп. Переміщуючи тубус мікроскопа, домагаються чіткого фокусування фазової пластинки об'єктива (має вигляд темного кільця).

6.Повернувши диск револьвера, вмикають кільцеву діафрагму, яка відповідає об'єктиву 40 х ф. При цьому з'являється не лише фазове кільце, а й кільце-щілина діафрагми.

7.За допомогою гвинтів для центрування зміщують кільцеву діафрагму таким чином, щоб вона збіглася з фазовим кільцем.

8.Допоміжний мікроскоп замінюють на окуляр і фокусують препарат.

9.Якщо мікроскопію здійснюють з використанням інших об'єктів, установлюють відповідні кільцеві діафрагми і щоразу проводять центрування, користуючись допоміжним мікроскопом.

ЗАВДАННЯ.

1.Визначити концентрацію мікроорганізмів під час культивування на рідкому поживному середовищі (МПБ) прямим методом.

51

РОЗДІЛ 2.

ВИДІЛЕННЯ ТА ОЧИЩЕННЯ ПРОДУКТІВ БІОСИНТЕЗУ ШТАМІВ СУПЕРПРОДУЦЕНТІВ.

Лабораторна робота №1

МЕТОДИ ДЕЗІНТЕГРАЦІЇ КЛІТИН

Мета: опанувати основні методи дезінтеграції клітин бактеріальної

маси.

Біотехнологічний процес отримання цільового продукту обов‘язково містить стадію виділення та очищення продуктів біосинтезу.

Цільовим продуктом може бути власне клітини або продукти їх метаболізму:

Зовнішньо клітинні, що виділяються у культуральну рідину;

Внутрішньоклітинні, що містяться всередині клітини.

У культуральній рідині після закінчення процесу культивування містяться власне клітини (зокрема, мікроорганізми), продукти метаболізму, залишки поживного середовища, додаткові речовини, що використовуються під час культивування (наприклад, піногасник). Тому, незалежно від кінцевого продукту, на першому етапі виділення необхідно розділити тверду фазу (завісь клітин) від рідкої фази.

Вибір методу виділення нерозчинних речовин (клітин) залежить від:

характеристики культуральної рідини (в’язкість, щільність, концентрація клітин, наявність домішок);

необхідного ступеня очищення цільового продукту.

Для виділення внутрішньоклітинного продукту біосинтезу клітин,

останні необхідно зруйнувати таким чином, щоб цільовий продукт залишився неушкодженим. Найчастіше це досягається методом

дезінтеграції – процесу подрібнення різних матеріалів, руйнації клітин (мікроорганізмів, зокрема) шляхом розриву клітинних оболонок. У

біотехнології дезінтеграція означає процес незворотного порушення цілісності клітин (вірусів).

52

Вибір методу дезінтеграції обумовлено різноманітністю типів клітин: від еритроцитів, які легко руйнуються до клітин деяких бактерій, для руйнування яких необхідна сильна механічна дія. Це обумовлено тими характерними параметрами клітини як: розмір клітини, щільність, міцність, пружність та в‘язкість клітинної оболонки. Для деяких клітин рослин та мікроорганізмів властива виключно висока механічна міцність клітинних стінок, межа міцності яких дорівнює 108 дин/см, це приблизно відповідає межі міцності сталі. Для руйнації таких структур необхідний вплив високої інтенсивності порядку 108с-1 і більше. Такий вплив призводить до небажаних явищ інактивації, модифікації й деградації цільових компонентів, що становить основну проблему штучної інструментальної дезінтеграції.

На процес руйнації впливає навколишнє середовище. Воно виступає як пасивний передавач енергії (механічної, теплової) від дезінтегратора до клітини, або як активний елемент процесу інтенсивної дії на клітинні оболонки (хімічна, хімікоекстрактивна, ензиматична, ензимоосмотична). У це середовище виходять цільові клітинні компоненти де піддаються змінам.

З практичної точки зору для руйнації клітини достатньо розірвати клітинну оболонку різними факторами пошкодження: фізичними, механічними, хімічними, ензиматичними та біологічними. Тому методи

руйнування клітин поділяють за силою дії та методами впливу.

ЗА СИЛОЮ ДІЇ (за Скоупс, 1985 р.) усі методи поділяються на:

способи руйнування за м‘якою дією на клітини, які руйнуються дуже легко (так, принцип дезінтеграції еритроцитів полягає у м‘якій дії осмотичного руйнування клітинної стінки; для руйнування клітин клітинних ліній достатньо одноразове заморожування та відтанення);

способи руйнування клітин з застосуванням дії середньої сили (за допомогою гомогенізатора механічно руйнуються великі клітини більшості тваринних та рослинних тканин);

способи руйнування клітин з застосуванням сильної дії (руйнація міцної клітинної оболонки бактерій за допомогою ультразвуку).

Дезінтеграція різних типів клітин може досягатися:

53

1.фізичними методами:

механічні (екструзія, ультразвук, газодекомпрессія)

немеханічні (осмотичний, тепловий, холодовий шок, заморожування-відтанення, дегідратація-регідратація)

2.хімічними методами:

дія лугів, кислот, солей, детергентів, інгібіторів, органічних розчинників;

3.ензиматичними методами:

дія ферментів (літичні ферменти бактерій, дріжджів, грибів).

4.біологічними методами: дія фагів, бактерицидів.

Для практичного руйнування клітин застосовуються комбіновані методи.

В результаті дезінтеграції отримуємо дезінтеграт, який, після видалення цілих клітин, що залишилися, вже називається без клітинний

екстракт.

Для дезінтеграції фізичними методами застосовують спеціальні прилади — дезінтегратори. За принципом роботи дезінтегратори розрізняють: балістичні, вібраційні, бісерні, ультразвукові, екструзійні та ін. У біотехнологічній промисловості найбільш популярними є балістичні, екструзійні та ультразвукові дезінтегратори.

БАЛІСТИЧНІ ДЕЗІНТЕГРАТОРИ характеризуються тим, що перенесення енергії від робочих органів дезінтегратора до клітини відбувається безпосередньо, під час механічного контакту або через тіла, що перемелюють. Відповідно усі балістичні дезінтегратори поділяються на:

1.Дезінтегратори, що розтирають та чавлять (енергія робочих органів передається клітинам безпосередньо);

2.Дезінтегратори з вільними тілами, що перемелюють (енергія від робочих органів до клітин переноситься опосередковано);

3.Дезінтегратори, які мають агреговані тіла, що перемелюють (енергія від робочих органів до клітини переноситься безпосередньо або опосередковано);

4.Дезінтегратори ударної дії;

5.Колоїдні млини.

54

Приклади балістичних дезінтеграторів наведені у таблиці 4.

						Таблиця 4.
БАЛІСТИЧНІ ДЕЗІНТЕГРАТОРИ МІКРООРГАНІЗМІВ
Тип			Призначення			Корисний
						об’єм
						камери,
						см3
Дезінтегратори, що розтирають та чавлять
Мікроступка ручна			Аналітичні дослідження			3
Лабораторні	ступки		Сухе та вологе розтирання клітин у			20-1000
ручні			присутності абразивних речовин
Механізовані		та	Розтирання дріжджів			150
автоматизовані
ступкові млини		та
агрегати
мікрогомогенгезатор			Руйнація тканин			1-3
Гомогенізатор Поттера			Лабораторні дослідження			1-60
Тканинний			Дезінтеграція тваринних клітин			23
гомогенізатор
Дезінтегратори з вільними тілами, що перемелюють
Мікромлин-ступка		з	Сухе та вологе подрібнення			10
пестом
Кріогенний млин			Руйнація бактерій та спор у			1
			кріогенному стані
Гомогенізатор Л-17			Руйнація дріжджів та бактерій			2х50
Дезінтегратор-насадка			Універсальний		лабораторний	2х100
до центрифуги ЦЛР			дезінтегратор бактерій, дріжджів,			4х100
			грибів та спор
Дезінтегратори, які мають агреговані тіла, що перемелюють
Дезінтегратор			Проточний	лабораторний прилад		100
низькочастотний		з	для дезінтеграції бактерій
пористою перетинкою
		Дезінтегратори ударної дії
Міксери, блендери			Дезінтеграція		заморожених та	100-800
			висушених	мікробних, рослинних
			та тваринних біомас
Кріогенні подрібнювачі			Дезінтеграція біомас у криогенних			500
			умовах

55

УЛЬТРАЗВУКОВІ ДЕЗІНТЕГРАТОРИ. До основних позитивних особливостей ультразвукової дезінтеграції мікроорганізмів слід віднести зручність та відносну легкість організації процесу. Ультразвуковий вплив, що призводить до руйнування мікробної оболонки, обумовлений різноманітними фізичними та фізико-хімічними явищами кавітаційної природи.

Кавітація – утворення та ріст газових пухирців у рідинах,

насичених звуковим полем. Рух пухирців з різною швидкістю супроводжується фізичними ефектами (взаємозв‘язок високо градієнтних потоків, ударних хвиль, локальних стрибків тиску та температури, збудження люмінесценції, народження вільних радикалів).

Лабораторні ультразвукові дезінтегратори мікроорганізмів – прилади універсального призначення з потужністю випромінювання ультразвукових коливань до 150 Вт. Мають змінні робочі наконечники, різноманітних форм та розмірів. Змінні камери,

об‘ємом від 1-100 см3, мають індикатори, регулятори, стабілізатори рівня випромінювання потужності.

РУЙНУВАННЯ КЛІТИН МЕТОДОМ ЕКСТРУЗІЇ.

Екструзія – руйнація клітин за рахунок взаємодії їх з однорідним рухомим середовищем під час виникнення градієнтів швидкості та неоднорідного розподілення тиску. Екструзії може піддаватися рідке та тверде середовище (заморожені суспензії).

Промислові дезінтегратори мікроорганізмів – це автоматизована дезінтеграційна установка з потужністю кільцевого випромінювача до 1 кВт. Призначений для виробництва ветеринарних вакцин на біофабриках. Регуляція протоку та температури біомаси автоматична.

56

Після руйнування тканин отримують гомогенат, після руйнування клітин отримують лізат, після його центрифугуванням та осадження нерозчинного матеріалу отримують екстракт. При отриманні екстракту втрати білка (ферменту) за рахунок утримування рідини осадом не повинні становити 20 %. Бактерії, дріжджі та подібні до них гриби з товстою клітинною стінкою дають осад, об‘єм якого практично дорівнює первинному об‘єму клітинного матеріалу. Це впливає на кількість буферного розчину, якій треба додавати.

ЕНЗИМАТИЧНІ МЕТОДИ РУЙНАЦІЇ КЛІТИН МІКРООРГАНІЗМІВ. Прикладом дезінтеграції за допомогою ферментів бактеріальних клітин є руйнування бактеріальної маси E.сoli лізоцимом яєчного білка:

1.Добову культуру E.сoli на агарі змивають 1мл буферу.

2.До суспензії клітин додають екстрагуючий буфер (20 мМ фосфатносольовий буфер, рН 7,0 + 1 мМ ЕДТА), якій містить 0,2 мг/мл лізоцима яєчного білка та 10 мкг/мл 0,3М дезоксиробонуклеази. Обробка отриманого екстракту дезоксирибонуклеазою поліпшує його якість, завдяки зменшенню в’язкості рідини.

3.Суспензію клітин з буфером перемішують 15 хв при 37 оС

4.Суспензію клітин центрифугують при 15000g 20 хв.

ЗАВДАННЯ.

1.Зруйнувати бактеріальну масу за допомогою ультразвукового дезінтегратора.

2.Зруйнувати бактеріальну масу ензиматичним методом.

Лабораторна робота №2

ОСНОВНІ МЕТОДИ ФРАКЦІОНУВАННЯ І ОЧИСТКИ БІЛКІВ

Мета: опанувати метод очищення білка шляхом висолювання.

57

ОЧИЩЕННЯ БІЛКІВ ШЛЯХОМ ВИСОЛЮВАННЯ.

Висолювання білків пов‘язано з розчиненням солей у розчині, якій містить білки. При цьому важлива природа солі. За здатністю до висолювання аніони солей розміщуються у ряд Гофмейстера: SCN-, I-, ClO4-, NO3-, Br-, Cl- ,CH3COO-, SO42-, PO43-. Щодо ефективності дії катіонів на осадження білків, то моновалентні іони можна розмістити так: NH4+>K+>Na+ .

При виборі солі необхідно враховувати ціну чистого препарату, розчинність та особливості, пов‘язані з нагріванням розчину. Сіль амонію сульфат має усі переваги та не має недоліків при роботі з типовим білком , окрім випадків коли треба працювати при високих рН. Розчинність (NH4)2SO4 мало змінюється у діапазоні 0-30 оС, концентрація насиченого розчину у воді становить 4 М. Щільність цього розчину становить 1,235 г*см-3, а щільність білка дорівнює 1,29 г*см-3. Кількість солі, яку треба додати для отримання необхідної концентрації можна порахувати за допомогою формули, а можна знайти у таблицях. Краще всього працювати при нейтральних значеннях рН (6,0 – 7,5). Фракціонування (NH4)2SO4 має важливу перевагу – він призводить до стабілізації білків. Суспензія білкового осаду у 2 – 3 М розчині (NH4)2SO4 стабільна протягом років. Це звичайний метод збереження комерційних препаратів. Висока концентрація солі попереджає протеоліз та дію бактерій.

У багатьох випадках після фракціонування (NH4)2SO4 використовують більш складні методи – іонообмінну або афінну хроматографію.

Приготування насиченого розчину сульфату амонію. 800,0 г

реактиву амонію сульфату вільного від домішок металів додають до 1000 мл дистильованої води при 35 оС, постійно струшуючи протягом 2 годин (за допомогою шуттеля). Після чого температуру знижують до +4оС (залишають на ніч у холодильнику). Оскількі деякі партії амонію сульфату мають кислу реакцію слід довести рН розчину до нейтрального значення слабким розчином аміаку. З цією метою невелику кількість насиченого розчину розвести у 20 разів дистильованою водою та виміряти рН (якщо міряти концентрований розчин, то можна помилитися більш ніж на 1 ОД рН). Готовий препарат можна зберігати протягом року.

Діаліз. Концентрування білкових розчинів та діаліз тісно пов‘язані між собою.

58

Діаліз – це процес видалення низькомолекулярних речовин, який базується на здатності напівпроникних мембран пропускати низькомолекулярні речовини та іони.

При діалізі небажані низькомолекулярні речовини видаляються із зразка та заміщуються буферним розчином. Під впливом високої концентрації солі або органічної речовини, яка присутня у зразку, вода починає входити у діалізний мішок раніше ніж сіль виходити з нього. Діалізні трубки не пропускають молекули більші за 15000-20000 Да. Усі низькомолекулярні речовини вільно проходять через мембрану поки склад буфера з обох сторін не вирівняється. Треба враховувати, що під час діалізу може проходити протеолітичне розщеплення білків. Для повного виділення із зразка ендогенної солі необхідно замінювати буферний розчин як мінімум 2–3 рази, а об‘єм буфера повинен бути у 1000 разів більшим ніж об‘єм діалізату.

Підготовка діалізних мішків

1.Взяти з упаковки суху діалізну трубку та відрізати її необхідного розміру;

2.Відрізану діалізну трубку зволожити дистильованою водою;

3.Після зволоження трубки з одного кінця зав’язати два вузла (можна зберігати у стерильній дистильованій воді 1–2 дні);

4.Вологий діалізний мішок прокип’ятити у розчині 2 %-го натрію бікарбонату (якщо планується використовувати для нуклеїнових кислот слід додати 1мМ ЕДТА, якій зв’язує солі Mg);

5.Діалізний мішок промити у дистильованій воді (не підсушувати);

6.Підготовлений діалізний мішок можна зберігати у дистильованій воді не більше 4 годин.

Фракціонування нативної сироватки насиченим розчином амонію сульфату

1.Осадження матеріалу слід проводити на холоді при О оС (у чашці з льодом). До 10 мл нативної сироватки ВРХ у центрифужній пробірці (загальний об’єм 25 мл) додати по краплях 5 мл насиченого розчину (NH4)2SO4. Після додавання кожних 0,5 мл реактиву пробірку ретельно

59

струшують. Осад повинен зникати, поки об’єм реактиву не досягне 3 мл.

2. Після повного внесення реактиву матеріал залишити на 12 годин при +4

оС.
3.	Осаджений матеріал у пробірці слід піддати центрифугуванню при
3000 об/хв. 20 хв.
4.	Супернатант (надосадова рідина) відсмоктати	піпеткою та
видалити.

5 До осаду додати розчин(NH4)2SO4 33 % насичення, розмішати.

6.Матеріал у пробірці слід піддати центрифугуванню при 3000 об/хв. 20 хв.

7.Супернатант (надосадова рідина) відсмоктати піпеткою та видалити

8.Осад суспендувати у3 мл 0,9 %-го розчині NaCl.

9.Матеріал внести у підготовлений діалізний мішок. З цією метою у відкритий кінець діалізного мішка вставити скляну лійку, через яку у мішок налити матеріал. Його зручно наливати, коли один кінець діалізного мішка лежить на площині.

10. Діалізний мішок з матеріалом зав’язують бавовняною білою ниткою. У мішку слід залишити вільний простір з розрахунку на збільшення об’єму, якщо концентрація розчинених у зразку речовин висока. Якщо цього не зробити при збільшенні об’єму розчину тиск всередині мішка сильно виросте і мішок розтягнеться. Це може призвести до розриву мембрани або витіканню розчину через вузли.

11.Діалізний мішок з матеріалом помістити у плоскодонну колбу з буферним розчином (кількість розчину розраховується із співвідношення матеріал/ діалізний буфер як 1:10000) та магнітом. Колбу поставити на магнітну мішалку на середні оберти, щоб не утворювалося піни під час перемішування (ознака денатурації білка). Загальний час діалізу становить 48 годин.

12.Через 12 годин буфер у колбі обережно замінити. Провести діаліз 12 год при +4 оС

13.Див. пункт 12

14.Див. пункт 12.

15.Після закінчення діалізу вміст мішка обережно вилити у пробірку. Перевірити повноту діалізу за допомогою розчину барію хлористого. З цією метою в окремому флакончику до невеликої кількості діалізату

60