Novicka_praktykum_z_biotehnologii_ch1

7.Розливання. Середовище розливають у скляні пляшки об‘ємом у 2-3 рази більшим ніж об‘єм середовища. Усі пляшки з середовищем обов‘язково маркують (підписують водостійким маркером назву та дату виготовлення середовища).

8.Стерилізація. Середовища стерилізуються залежно від складу в умовах автоклаву, кип‘ятінням або фільтрацією.

Таблиця 1.

Деякі можливі відхилення, що виникають під час приготування поживних середовищ

Параметри

відхилення

Відхилення рН

Неповне розчинення

Причини виникнення відхилень

Перегрів, неповне перемішування, тривала стерилізація, використання лужного скла, неочищена вода, розплавлення вдруге, гідроліз інгредієнтів, тривале збереження в умовах високих температур (≥25 0С).

Відхилення від інструкції з нагріву агаризованого середовища, неповне перемішування, мала ємність для приготування середовища (осад може бути важливим компонентом середовища, як наприклад у вісмут-сульфіт агарі)

Потемніння

М’який гель

Перегрів середовища, погане перемішування, недостатня кількість води для розчинення.

Неповне розчинення агару, недостатнє перемішування, недотримання інструкції по відновленню сухого середовища, кислотний гідроліз агару, надмірне розведення сухого середовища.

Втрата ростових та	Повторне плавлення, надмірне нагрівання,	неповне
диференціюючих	перемішування, надмірне розведення	сухого
властивостей	середовища, невідповідний розчинник та ін.

Нехарактерний колір середовища

Токсичність для мікроорганізмів

Непридатність сухого середовища, неякісний посуд (залишки миючих засобів), неочищена вода.

Неякісний посуд (залишки миючих засобів), неочищена вода, підпалювання середовища.

31

		Невірна/недостатня	стерилізація	готового
	Контамінація	середовища, недотримання асептичних умов
		додавання окремих (стерильних) компонентів
	мікроорганізмами
		середовища, або під час розливання та фасування
		готового середовища.

Зберігання готових поживних середовищ. Найкраще використовувати свіжовиготовлені середовища. Проте, за необхідністю більш тривалого збереження, середовища у пляшках можуть зберігатися у захищеному від світла та прохолодному (12-16°С) місті до 6 місяців. Строк збереження готових поживних середовищ залежить від їх складу.

Середовища заборонено заморожувати!

Під час приготування поживних середовищ можуть виникнути певні помилки (таб.1).

ЗАВДАННЯ:

1.Розглянути види субстратів та вимоги до сировинної бази.

2.Опанувати метод приготування рідкого середовища МПБ згідно рекомендацій виробника.

3.Опанувати метод приготування твердого середовища МПА, згідно рекомендацій виробника.

4.Опанувати метод рН-метрії поживних середовищ.

5.Опанувати методи стерилізації шляхом автоклавування та фільтрації.

Лабораторна робота №6

МЕТОДИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ В БІОТЕХНОЛОГІЇ ОТРИМАННЯ ІМУНОБІОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ

Мета: оволодіти різними методами стерилізації, зокрема, поживних середовищ.

32

Важливим елементом у процесі виготовлення кінцевого імунобіологічного препарату є стерилізація – знищення усіх форм життя (зокрема, живих мікроорганізмів) у стані вегетації та спокою.

Стерилізації обов‘язково піддають усі матеріали, захисний одяг, інструменти, посуд, поживні середовища, пакувальні матеріали, що використовуються у процесі виготовлення стерильних імунобіологічних препаратів. Усі потоки можуть стерилізуватися термічним, радіаційним, хімічним, фільтраційним та комбінованими методами. Дія усіх стерилізуючих агентів базується на інактивації внутрішньоклітинних речовин, необхідних для росту та репродукції клітин.

Стерилізація радіацією. Радіаційна стерилізація використовується, головним чином, для стерилізації матеріалів і продукції, що чутливі до нагрівання. Багато лікарських засобів і деякі пакувальні матеріали чутливі до радіації, отже цей метод припустимий лише у випадку відсутності шкідливого впливу на продукцію. Тому цей метод використовують для стерилізації невеликих об’єктів (хірургічний інструмент, перев’язочний матеріал). Під час процесу стерилізації слід вимірювати дозу випромінювання. Для цих цілей слід використовувати дозиметри, показання яких не залежать від інтенсивності випромінювання, але забезпечують кількісну реєстрацію дози випромінювання, поглиненою стерилізованою продукцією.

Хімічний метод стерилізації базується на використанні речовин, які володіють дезінфікуючими властивостями. Основна проблема цього методу полягає у видаленні стерилізуючого агенту з поживного середовища. Це досягається шляхом розкладення агентів з утворенням нетоксичних для виробничої культури продуктів.

Термічний метод. Найбільш часто у технологічному процесі виготовлення стерильних імунобіологічних препаратів використовують термічний метод стерилізації. Він базується на згубному впливі на живі клітини високих температур. Стерилізація досягається фламбуванням (обробкою відкритим полум‘ям), сухим гарячим повітрям, кип‘ятінням та насиченою парою. Для стерилізації посуду, матеріалів, одягу,

33

інструментів, поживних середовищ та розчинів найкраще зарекомендував себе метод обробки парою під тиском за допомогою автоклавів.

Конструктивно автоклави бувають декількох видів: що

обертаються, гойдаються, горизонтальні, вертикальні та у вигляді колони. Автоклав-стерилізатор оснащується механічними, електромагнітними або пневматичними змішувачами, контрольновимірювальними приладами для вимірювання та регулювання тиску, температури та інших показників. У порівнянні з стерилізацією сухим повітрям автоклавування більш ефективно у зв‘язку з тим, що теплоємність водяної пари у 3600 разів більша ніж теплоємність сухого повітря за однакової температури. Проте, обов‘язковою умовою ефективної стерилізації є одночасне поєднання температури, тиску, часу та водяної пари. Основою будь якого стерилізатора є герметична камера, у якій відбувається процес стерилізації та парогенератор. У простих автоклавах елементи нагрівання розміщенні безпосередньо у стерилізуючій камері, що частково заповнена водою для створення пари. Дія цих автоклавів побудована за принципом скороварки. Пара, що утворюється під час кипіння води, витискає повітря через клапан, що розташований у верхній частині камери. Для уникнення корозії від хлору звичайної водопровідної води для роботи автоклаву необхідно використовувати дистильовану воду.

Згідно європейського стандарту prEN 13060/1-4 автоклави поділяються на три класи:

Автоклави класу «В» - мають функцію попередньої вакуумізації та функцію вакуумного висушування, можуть стерилізувати будь-які форми медичних виробів та тканин: великі, порожнисті, запаковані у пакувальні матеріали будь якого типу (інструменти, білизна, одяг, посуд).

Автоклави класу «S" – призначені для стерилізації гладеньких або порожнинних інструментів в упакуванні або без упакування.

Автоклави класу "N" – призначені для стерилізації металевих інструментів безпосередньо у лотку та не запакованих тканинних матеріалів без порожнин та щілин.

Найчастіше стерилізуються автоклавуванням поживні середовища

34

Співвідношення температури та тиску у автоклаві представлені у таблиці 2.

	Таблиця 2.
Тиск насиченої пари у автоклаві, кПа	Температура, ° С
34,47	108
68,95	116
103,42	121
137,90	127
172,37	131
206,84	134
1 атм.=101,325 кПа

СТЕРИЛІЗАЦІЯ РОЗЧИНІВ ТА СЕРЕДОВИЩ. Вибір методу стерилізації середовищ залежить від складу останніх. Деякі складники середовищ допускається використовувати без стерилізації (наприклад, етиловий спирт), а деякі середовища не потребують стерилізації автоклавуванням, їх можна використовувати зразу після кип‗ятіння (наприклад, середовище для вирощування представників родини Enterobacteriaceae, що містить бріліантовий зелений, особливо чутливе до нагрівання, тому після приготування, його швидко охолоджують та захищають від яскравого світла).

Проте, більшість середовищ потребує стерилізації. Стерилізація поживних середовищ парою використовується у двох режимах: cтатичному в умовах автоклаву та стерилізація з перемішуванням.

Режими стерилізації поживних середовищ залежать від складу останніх (таб.3). Час нагріву стерилізаційної камери автоклаву (від 20 до

121 оС) залежить від конструкції останнього та контролюється манометром.

Час досягнення необхідної температури у масі поживного середовища

залежить від об‘єму контейнеру та щільності завантаження автоклаву. Цей час контролюється термопарою та складає для ємностей 100 см3 – 12 хв, 500 см3 – 18 хв, 1000 см3 – 22 хв. Середовище нагрівається до тих пір поки ТоС середовища в середині ємності стане рівною ТоС пари. З цього моменту починається процес стерилізації. Щільність завантаження автоклаву напряму впливає на час нагрівання середовища до температури

35

пари. Так, час нагріву середовища у поодинокому флаконі об‘ємом 100 см3 складає 12 хв, але у такому ж самому флаконі за умов щільного завантаження автоклаву час нагріву збільшується до 30 хв.

			Таблиця 3.
Режими стерилізації поживних середовищ
Поживні середовища	Режим стерилізації
	Температура, оС		Час, хв
Прості	121	20
Складні:
з вуглеводами, молоком,	110	15
желатиною
білкові (сироваткові та яєчні)	80-85	60	хв, 3 дні
з ущільнювачем		підряд
	95	60 хв одноразово
білкові без ущільнювача	58	60	хв, 3 дні
		підряд

Після витримування (безпосередньої стерилізації) настає час охолодження, який залежить від конструкції стерилізатора та щільності його завантаження. У звичайних автоклавах етап охолодження триває 2-3 години, проте скорочувати цей час штучно небажано. Звичайні автоклави не оснащені спеціальною системою охолодження і остигання рідин відбувається природнім шляхом під час відчинення дверцят автоклаву. Оскільки температура та тиск взаємопов‘язані, під час відчинення автоклаву тиск у камері знижується до атмосферного, а рідина, що має температуру 121оС, не встигає охолодитися та виявляється перегрітою. Це призводить до бурхливого спінювання рідини у пляшках або навіть до вибуху останніх. Для запобігання ефекту «пізнього закипання» рідини повинні бути охолодженими до безпечної температури. Це особливо важливо для ємностей, що мають більше 1000 см3.

Контроль ефективності стерилізації є одним з ключових етапів приготування середовищ. Неправильно вибраний режим стерилізації або не відрегульована робота автоклаву може призводити до перегріву поживних середовищ. Короткий період дії високої температури викликає більший летальний ефект та невелику хімічну деградацію середовища, ніж

36

тривале прогрівання за нижчими температурами. Перегрів поживних середовищ супроводжується зміною рН, потемнінням, утворенням осаду, послабленням міцності гелю та погіршенням біологічних властивостей середовища. Стерилізація середовищ, що мають значення рН, відмінні від нейтрального, небажана, тому що такі середовища чутливі до перегріву. За умов високих температур відбуваються незворотні зміни: агар гідролізується та втрачає міцність гелю, вуглеводи карамелізуються та ін. Тому середовища рекомендується стерилізувати при нейтральному значенні рН, а після цього доводити рН до необхідного значення за допомогою стерильних розчинів кислоти або лугу. Перед стерилізацією усі компоненти середовища повинні бути розчинені, агаризовані середовища необхідно стерилізувати зразу після розплавлення агару, не дозволяючи йому застигнути. Небажано стерилізувати у великих ємностях (більше 2000см3), тому що виникає ризик локального перегріву.

Якість стерилізації перевіряється використанням термота біоіндикаторів. Перші, у вигляді смужок, наклеюються на пакувальний папір і реагують на температуру у середині камери зміною кольору (таб.4). Їх використовують для контролю автоклавування посуду та інструментів.

Таблиця 4.

Речовини, які застосовуються для хімічних тестів під час обробки в паровому автоклаві (стерилізаторі) або сухим жаром

Найменування	Точка плавлення, оС	Режим, кгс/см2
речовини
Бензонафтол	110	0,5
Антипірин	112-115	0,75
Сірка	119	1,1
Бензойна кислота	120-121	1,1
Безводна фталієва	126	1,5
кислота
Сечовина	132	2,0
Глюкоза	146	Сухим жаром
Сахароза	160	Сухим жаром
Винна кислота (1,2 -	170-180	Сухим жаром
диоксиянтарна)

Під час автоклавування рідин (поживних середовищ) необхідно використовувати рідкі ампульні біоіндикатори, що містять дозовану

37

кількість терморезистентної тест-культури B. stearothermophilus, яка є міжнародним референтним індикатором у відповідності до стандарту EN 556.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕННЯ БАКТЕРІОЛОГІЧНОГО КОНТРОЛЮ РОБОТИ АВТОКЛАВУ.

1.Для бактеріологічного контролю роботи автоклаву використовують заздалегідь підготовлені біологічні зразки ґрунту.

2.Пронумеровані зразки грунту, загорнуті в пергаментний та фільтрувальний папір, закладають у стерилізаційні коробки в матеріал, що стерилізується, разом з максимальними термометрами. У кожну коробку поміщають не менше трьох проб грунту. По дві проби закладають зовні коробок у верхній та нижній частинах стерилізаційної камери автоклаву.

3.Режим стерилізації під час контролю реєструють у протоколі, де записують місце розміщення проб грунту, максимальних термометрів та їх показання, а також результати бактеріологічних досліджень.

4.Після закінчення роботи, проби грунту в той же день відправляють до бактеріологічної лабораторії. Бікси зі стерилізованим матеріалом, де були термометри й проби грунту, підлягають повторній стерилізації.

5.У бактеріологічній лабораторії, із дотриманням асептичних умов, кожну пробу засівають у дві широкогорлі пробірки: в першу з 20см3 м'ясопептонного цукрового бульйону, в другу - 20 см3 напіврідкого м'ясопептонного агару. Під час посіву розгортають зовнішню обгортку із фільтрувального паперу, стерильними ножицями обрізають куточок пакета

інад полум'ям пальника висипають грунт у пробірки. Посіви витримують у термостаті при температурі 37оC протягом 7 діб. Одну пробу грунту (контрольну) залишають у лабораторії і засівають її після посіву дослідних проб.

6.З пробірок, в яких є ріст, проводять посів на м'ясопептонний агар для підтвердження росту спорової культури. Ріст вегетативних форм (коків, сарцин) не враховують, вважаючи, що їхня мікрофлора внесена в процесі посіву.

7.При наявності росту спорової культури, хоча б в одній пробірці, бактеріологічний контроль повторюють. Коли ж і при повторній роботі виявляються нестерильні проби, припиняють використовувати автоклав

38

для стерилізації і проводять ретельну перевірку технічного стану автоклава, контрольно-вимірювальних приладів, термостійкості мікрофлори, яка міститься у пробах грунту, і знову проводять бактеріологічний контроль ефективності стерилізації в цьому автоклаві.

ПРИГОТУВАННЯ БІОПРОБ ДЛЯ БАКТЕРІОЛОГІЧНОГО КОНТРОЛЮ РОБОТИ АВТОКЛАВА.

1.Грунт, який беруть з городу, клумби, в садку, висушують при кімнатній температурі, подрібнюють у ступі і просівають через дрібне сито або один шар марлі (поза приміщенням бактеріологічної лабораторії).

2.Зразки грунту, вагою по 3 г кожна, загортають послідовно в пергамент, а потім у фільтрувальний папір (як лікарський порошок).

3.Зразки грунту, не менше трьох від наявного зразка, поміщують в автоклав, розташовуючи їх на кришці порожньої стерилізаційної коробки (для попередження змочування конденсатом).

4.Після продувки доводять тиск пари в автоклаві до 0,11 МПа (1,1 кгс/см2) (температура 120±1оC) і через 5 хвилин випускають пару. Підіймання тиску проводять максимум протягом 8 хв., випускання - 3 хв. Обмеження часу піднімання тиску й випускання пари потрібно для зменшення часу дії пари на мікрофлору проб грунту до і після експозиції.

5.Після обробки проб грунту їх піддають бактеріологічному дослідженню так, як вказано в п.4 і 5 «Методики проведення бактеріологічного контролю».

6.Якщо при експозиції в 5 хв. у всіх пробірках з засіяними пробами грунту немає росту, то при наступній перевірці експозицію скорочують до 3 хвилин. Коли й при цій експозиції всі проби грунту виявляються стерильними, цей зразок грунту вважають непридатним для контролю роботи автоклавів.

7.Грунт, який вміщує термостійкі сапрофіти, підсушений і просіяний, зберігається в банках з притертими корками при кімнатній температурі в темному місці. Термін використання його для бактеріологічного контролю роботи автоклавів становить 6-7 місяців. Через 3-4 місяці належить перевірити збереження термостійкості мікрофлори в цьому грунті.

ЗАВДАННЯ

1.Перевірити якість стерилізації парового автоклаву за допомогою термоіндикаторів у вигляді смужок або окремих речовин.

2.Приготувати біопроби грунту для бактеріологічного контролю роботи автоклаву.

39

Лабораторна робота №7.

ФІЛЬТРАЦІЯ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ, ЯКІ НЕ МОЖУТЬ БУТИ ПРОСТЕРИЛІЗОВАНІ У КІНЦЕВІЙ ПЕРВІСНІЙ УПАКОВЦІ

Мета: опанувати фільтраційний метод стерилізації компонентів середовищ, які чутливі до інших методів стерилізації.

Стерилізуюча фільтрація – це процес проходження потоку через фільтровальний матеріал, під час якого відбувається затримка організмів.ю в результаті чого поток рідини звільняється від забруднення.

Стерильний продукт – продукт, що не містить життєздатних мікроорганізмів, в тому числі патогенних.

Стерилізуюча фільтрація використовується лише для газів та рідин.

Фільтраційний метод стерилізації застосовується для стерилізації рідин, що містять термолабільні компоненти. Тільки одна фільтрація не може розглядатися як достатня, якщо можлива стерилізація у остаточній первісній упаковці. Беручи до уваги наявні методи, слід віддавати перевагу стерилізації паром. Якщо продукція не може бути простерилізована у кінцевій первісній упаковці, то розчини або рідини можуть бути профільтровані через стерильний фільтр із номінальним розміром пор 0,22 мкм (або менше) або через фільтр із аналогічною спроможністю затримувати мікроорганізми у попередньо простерилізовану первісну упаковку. Такі фільтри можуть видаляти більшість бактерій і цвілевих грибів, але не всі віруси і мікоплазми. Тому повинна бути розглянута можливість доповнювати процес фільтрації термічною обробкою деякого ступеня.

Внаслідок того, що під час стерилізуючій фільтрації порівняно із іншими процесами існує потенційний додатковий ризик, безпосередньо перед наповненням може бути доцільна друга фільтрація через додатковий стерильний фільтр, затримуючий мікроорганізми. Останню стерилізуючу фільтрацію слід здійснювати якомога ближче до місця наповнення.

Здатність фільтрів відділяти волокна повинна бути мінімальною.

40