Novicka_praktykum_z_biotehnologii_ch1

додати 1М BaCl2 (у випадку неповного очищення матеріалу від амонію сульфату випадає осад барію сернокислого BaSO4).

16.Матеріал зберігати у холодильнику для подальших маніпуляцій.

17.Визначити концентрацію очищеного білка.

Визначення концентрації білка біуретовою реакцією

1. Приготування біуретового реактиву. Розчиняють 1,5 г CuSO4 *5H2O та 6,0 г тартрата калія та натрія у 500 мл води. Додають 300 мл 10 %-го NaOH та доводять водою до об’єму 1000 мл.

2. Визначення концентрації білка. До 0,5 мл розчина білка невідомої концентрації (до 3 мг) додають 2,5 мл біуретового реактиву. Розчин витримують 20 хв. Вимірюють оптичну щільність при 540 нм.

Визначення концентрації білка реакцією Лоурі

1. Приготування реактивів

Реактив А. Розчиняють 0,5 г CuSO4 *5H2O і 1,0 г натрію цитрата у 100 мл води. Цей розчин стійкій та зберігається тривалий час.

Реактив В. 20,0 г Na2CO3 та 4,0 г NaOH розчиняють у 1 л води. Реактив С. До 50 мл реактиву В додають 1 мл реактиву А.

Реактив D.До 10 мл реактива Фоліна–Чіокалтеу (готовий реактив замовляється) додають 10 мл води.

2. Визначення концентрації білка. До 0,5 мл розчину білка невідомої концентрації (не більше 0,5 мг) додати 2,5 мл реактиву С, перемішати та залишити на 10 хв. Додати 0,25 мл реактиву D. Розчин ретельно перемішати та залишити на 20 хв. Після появи зафарбування вимірюють оптичну щільність при довжині хвилі між 600–750 нм.

ЗАВДАННЯ.

1.Провести висолювання білків сироватки крові.

61

Лабораторна робота 3.

ХРОМАТОГРАФІЧНІ МЕТОДИ ФРАКЦІОНУВАННЯ БІОМОЛЕКУЛ

Мета: опанувати метод хроматографічного фракціонування біомолекул за допомогою колонкової хроматографії.

Розділення білків проводять шляхом осадження, у розчині та шляхом адсорбції.

Серед лабораторних методів очистки, фракціонування та аналізу структури білків, нуклеїнових кислот та їх компонентів сукупність різних хроматографічних методів займає центральне місце. Жоден інший метод не може порівнятися з хроматографією за широтою кількісного діапазону. Починаючи з препаративних колонок об‘ємом у декілька літрів (на них можна вести фракціонування препарату кількістю декілька грамів) до мікроаналізу амінокислотного складу білка, коли на колонку вносять соті долі мікрограма гідролізату. Поза конкуренцією залишається різноманітність фізико-хімічних параметрів, за якими проводиться хроматографічне фракціонування.

Термін хроматографія (від грец. сhroma – колір і graphoпишу) вперше було використано для опису розділення природних пігментів у результаті різного ступеня їх затримки на фільтрувальному папері. Цей принцип розділення було названо одномерною хроматографією, який зараз широко використовується. Хроматографія базується на тому, що розчинені речовини відстають від фронту розчинника по мірі його проходження по носію. Для проведення хроматографії можна використовувати колонки з носіями (що може бути прирівняне до стопки фільтрувального паперу). Тепер зразок на старті являє собою диск або циліндр, а не тонку лінію. По мірі проходження розчинника по колонці, речовини, які є у зразку, розподіляються залежно від ступеня розчинення. Речовини повністю виділені розчинником, рухаються разом з фронтом розчинника (Rf=1) і вимиваються першими. Речовини, які повністю адсорбувалися носієм (Rf=0) залишаться на старті. Хроматографія можлива лише за умови

62

0≤Rf≤1, коли речовина затримується в результаті часткової адсорбції, але пізніше обов‘язково елююється (виділяється).

Хроматографічні методи об‘єднує в одну категорію одна принципова особливість - у будь-яких підходів можна виявити двофазну систему, у якій одна фаза не рухома, а інша переміщується відносно неї з деякою швидкістю у одному визначеному напрямку.

Не рухома фаза залишається незмінною, заповнюючи порожнину трубки (хроматографічної колонки) або фіксуючись на поверхні скляної або пластикової пластинки (інколи її основу утворює фільтрувальний папір або плівка ацетилцелюлози).

Рухома фаза безперервно оновлюється, вона поступає у систему з одного кінця і залишає її з іншого. Молекули компонентів висхідної суміші речовин розподіляються між двома фазами відповідно до ступенів їх спорідненості до них. На кожній ділянці нерухомої фази цей розподіл намагається досягти динамічної рівноваги, яка безперервно порушується внаслідок переміщення рухомої фази.

У результаті постійного перерозподілу молекул речовини між фазами мігрують у напрямку руху рухомої фази. Розподіл між фазами перебігає незалежно для кожного компоненту суміші речовин. Якщо спорідненість молекул компонентів суміші до двох фаз не однакова, тоді ці молекули мігрують у напрямку рухливої фази – впродовж шляху хроматографічного розподілу (впродовж колонки) з різною швидкістю, що дозволяє фізично відокремити ці компоненти.

Не рухома фаза може бути : рідкою та твердою.

Рухлива фаза може бути: рідкою та газовою.

Для очистки та фракціонування білків, нуклеїнових кислот та їх компонентів використовується переважно рідинна хроматографія. Варіанти рідинної хроматографії різняться за природою споріднення молекул які фракціонуються до хроматографічних фаз, тому хроматографію класифікують за принципом фракціонування.

63

КЛАСИФІКАЦІЯ ХРОМАТОГРАФІЧНИХ МЕТОДІВ ЗА ПРИНЦИПОМ ФРАКЦІОНУВАННЯ

1. Гель-фільтрація

Гель-фільтрація є одним з важливих методів очищення ферментів, якій відрізняється більш м‘яким розділенням білків. У цьому варіанті хроматографії молекули речовини, яка фракціонується не повинні володіти ніяким спеціальним спорідненням до нерухомої або рухливої фаз. Нерухома фаза представлена рідиною, яка знаходиться всередині пористих гранул. Ця рідина ідентична рідині рухомої фази, яка перебігає між цими гранулами. У більшості випадків використання гель-фільтрації для біологічних цілей робочою рідиною є водносолеві розчини, а матеріали гранул гідрофільні.

Перехід молекул речовини з рухомої фази у нерухому та навпаки за рахунок дифузії нічим не стримується. Проте у середині гранул дифузія утруднена через зштовхування молекул речовини, які дифундують з нитками просторової сітки полімеру або стінками пор.

Якщо у складі є великі молекули, які не проходять у пори гранул, то вони будуть виходити з колонки з переднім фронтом рухомої фази. Якщо є дрібні молекули, які вільно дифундують всередину гранул, то вони частину часу будуть знаходитися у нерухомій фазі. Статистично ця частина часу однакова для усіх молекул такого розміру та залежить від співвідношення об‘ємів рідини у нерухомій та рухомій фазах. Таким чином усі дрібні молекули досягнуть кінця хроматографічного шляху майже одночасно та пізніше ніж великі молекули. Це явище було названо «гель-фільтрацією» тому, що як просторову сітку використовували агарозні гелі. Однак ці гелі дуже легко деформуються та для хроматографії під тиском не придатні, тому їх замінюють на пористе скло та селикагель. Широко застосовуються гелі – сефадекси, за допомогою яких можна швидко розділити макромолекули відповідно до їх розмірів.

2. Розподільча хроматографія

Це хроматографічний процес, у якому нерухома та рухома фази представлені двома рідинами, які або не змішуються або змішуються частково. Якщо у цих двох рідинах, які контактують між собою розчинити одну речовину то концентрація цієї речовини буде однакова у цих розчинниках лише за умови, що вони мають однакову розчинну здатність

64

відносно до цієї речовини. Якщо ж вони мають різну розчинну здатність, тоді молекули речовини будуть переходити з однієї рідини у іншу доти, поки не встановиться рівновага, при якій висока концентрація молекул речовини буде у тій рідині, яка має більшу розчинну здатність.

Чим вище спорідненість компонента до нерухомої фази, тим повільніше він мігрує впродовж колонки чи пластинки. Рідина нерухомої фази, як і при гель-фільтрації, може бути просто іммобілізована всередині пористих гранул або зв‘язана з волокнами целюлози, що набрякла, або покривати плівкою гранули з суцільного матеріалу та поверхню пор у середині.

Історично склалося, що «нормальним» розподілом фаз називають таке, при якому нерухомою є водна фаза. За рахунок змочування (набухання) вона легко фіксується на гідрофільних матрицях (целюлозі, поліакриламідному або декстриновому гелях, діатомових землях, силікагелі), а у склад рухомої фази тоді входять органічні розчинники. Наприклад, у системі фенол-вода, білки переходять у фенол, а полісахариди та нуклеїнові кислоти у воду.

При зворотному розташуванні фаз, коли на твердій матриці фіксують плівку органічного розчинника, а рухома фаза є водним розчином, розподільчу хроматографію називають хроматографією у зворотних фазах.

Гель-фільтрація та розподільча хроматографія належать до методів розділення у розчинах.

3 Адсорбційна хроматографія

У цьому процесі нерухомою фазою є твердий сорбент. Чим більшу спорідненість має до сорбенту даний компонент суміші, тим повільніше він буде мігрувати за елюентом продовж колонки чи пластини.

4. Афінна хроматографія

Це особливий тип адсорбційної хроматографії. Афінність це міцність

(енергія) не ковалентних взаємодій між рецептором (антигензв’язуючим центром антитіла) та лігандом (антигенною детермінантою). Адсорбція проходить за рахунок біоспецифічної взаємодії між молекулами, які закріплені на матриці (зв‘язані у нерухомій фазі) та комплементарними молекулами (які треба очистити або фракціонувати), які надходять та елююють з рухомою фазою.

65

Відносно слабка зворотна взаємодія між молекулами біополімерів і сорбентом може проходити за рахунок сил біологічного споріднення (таки сили діють між гормоном та рецептором, антигеном та антитілом). Для проведення фракціонування методом афінної хроматографії один з партнерів такої пари хімічно закріплюють на матриці «біоаффінного» сорбента, а сорбцією та елюцією другого партнера керують шляхом зміни умов біологічної взаємодії у результаті введення в елюент солей, сечовини, детергентів.

Серед переваг афінної хроматографії слід виділити надзвичайно високу вибірковість, яка властива лише біологічним взаємодіям. Одна хроматографічна процедура дозволяє очистити необхідний білок у 1000 разів. Очистку білків та нуклеїнових кислот на афінних сорбентах ведуть не на колонках а у об‘ємі – методами центрифугування та декантації. Афінна хроматографія дозволяє вивільняти з суміші біологічних речовин компоненти, які знаходяться у мізерних кількостях, при цьому спосіб зв‘язування речовини з матрицею проходить через ліганд. Цей міцний зв'язок є ідеально м‘яким та не загрожує нативності. До того ж гідролітичні ферменти (протеази, нуклеази) з самого початку відділяються від своїх субстратів чим обумовлюють високий вихід макромолекул препаратів, які очищують.

5. Іонообмінна хроматографія

При даній хроматографії нерухому фазу утворюють молекули (з іоногенними групами) зв‘язані з поверхнею сорбенту ззовні гранул та у їх порах. Затримка молекул речовини з іоногенними групами у нерухомій фазі обумовлена кулонівськими взаємодіями.

У контакті з водним розчинником контріони, які входять до складу іоногених груп, можуть дисоціювати від іоногенних груп, при цьому залишають заряджені, пов‘язані з матрицею іони. Також контріони можуть заміщуватися іншими контріонами або більшими іонами речовини. У висхідному сухому матеріалі сорбенту (іонообмінника) контріони завжди знаходяться у такій кількості, щоб нейтралізувати заряди усіх іонів.

Рухома фаза (елюєнт) при даній хроматографії завжди є рідиною, до головних фізичних параметрів якої належать рН, концентрація та природа розчинних солей.

66

Речовини, які піддаються фракціонуванню повинні нести на собі електричний заряд, або мати здатність до іонізації. Затримка молекул речовини у нерухомій фазі обумовлена їх зв‘язуванням з поверхнею твердого гідрофільного матеріалу суцільних або пористих гранул, які знаходяться у контакті з рідким елюентом. При цьому варіанті затримка виникає не за рахунок молекулярної адсорбції (як при адсорбційній хроматографії), а за рахунок електростатичної взаємодії заряджених іонів. На усіх зовнішніх та внутрішніх поверхнях твердих гранул впродовж ниток полімерів та гелів, які утворюють просторову сітку рівномірно розподілені ковалентно зв‘язані з цими поверхнями іоногенні групи. У водному елюенті, який їх омиває, вони дисоціюють і утворюють сітку однойменно заряджених нерухомих іонів. Молекули компонентів суміші, яку треба фракціонувати, здатні іонізуватися при розчинені та зв‘язуватися з нерухомими іоногенними групами силами електростатичної взаємодії. При цьому ці молекули фіксуються у нерухомій фазі. Одним словом, білок повинен витіснити противоіони (іони протилежного знака) та зв‘язатися з матрицею.

Цей зв'язок зворотний: іони одних компонентів можуть заміщуватися на інші або витісняти контріонами іоногенних груп сорбента. Виникає обмін іонів, тому сорбенти називаються іонообмінниками.

Чим більше в умовах елюції сумарний заряд компонента суміші, тим сильніше його взаємодія з іонообмінником і тим повільніше він мігрує впродовж колонки.

Залежно від електричного заряду іонообмінники поділяють на:

аніоніти – іоногенні групи зарядженні також як і анод (позитивно) і зв‘язують з рухомої фази негативно заряджені аніони. Їх ще називають основними (при замочуванні сухих аніон обмінників у воді вони її залужнюють за рахунок зв‘язування з обмінником протонів);

катіоніти – іоногенні групи, як катод (заряджені негативно),зв‘язують з розчину позитивно зарядженні катіони. Вони є кислими обмінниками

МАТЕРІАЛИ МАТРИЦЬ СОРБЕНТІВ ТА ОБМІННИКІВ

67

Матрицею називають тверду основу нерухомої хроматографічної фази. Вона має вигляд суцільних або пористих гранул, які являють собою просторову сітку лінійних полімерів.

Серед органічних природних полімерів слід виділити такі:

Целюлоза –це лінійний полімер, поліцукрид, який характеризується високим ступенем гідрофільності та має схильність до утворення водневих зв‘язків між нитками полімеру. Наявність гідроксильних груп дозволяє легко модифікувати целюлозу, а завдяки її хімічній інертності вона не вступає у реакції з білками та нуклеїновими кислотами. Використовують як саму целюлозу та і її похідні – ДЕАЕ-целюлозу та карбоксиметилцелюлозу (КМ-целюлозу).

Агароза –поліатомний спирт, поліцукрид. Має центральну роль при гель-фільтрації та афінній хроматографії. Агароза надзвичайно гідрофільна, а її полімерні нитки схильні утворювати водневі зв‘язки. Гелі агарози (сефарози) чутливі до температури, тому їх не можна автоклавувати, а при висушуванні виникає незворотна деструкція гелю.

Декстран – поліцукрид, лінійний полімер на основі глюкози. Це поліатомний спирт з високим ступенем гідрофільності. Гелі на основі декстрана називаються сефадекси. Сефадекси відносно м‘які і легко утискаються, а у водних розчинах сильно набрякають. Вони переносять висушування та автоклавування. При замочуванні не потребують спеціальної обробки.

Серед неорганічних та органічних синтетичних носіїв слід виділити такі:

Поліакриламідий гель (ПААГ) –утворюється під час полімеризації водного розчину акриламіду і метиленбісакриламіду ТЕМЕДом. Завдяки зшивкам, які розташовані на відстані декількох мономерних одиниць утворюється хаотично зв‘язана просторова сітка. Між пучками полімерних ниток утворюються великі пустоти, які заповнюються рідкою фазою гелю.

Сефакріли- торгову назву «Sephacryl» отримала матриця, яку розробила фірма «Pharmacia» для гель-фільтрації. Вона поєднує якості сефадексів та ПААГ, має форму жорсткого гелю, пористість якого легко контролювати.

68

Полістирольні смоли – полімери на основі стирола для сорбційної іммобілізації використовують мікропористі та макропористі (розмір пор 10–1000 нм). Макросітчасті полістироли подібні склу, вони мають стабільну структуру пор не набухають у воді, стійкі до механічної дії.

Поліамідні смоли – це група різних гетероланцюгових полімерів з амідною групою, яка повторюється. До головної переваги носіїв цього типу є можливість створення їх у вигляді гранул, порошків, волокон, мембран, трубок. Широко використовуються полімери на основі N- вінілпирролідона, які характеризуються біологічною інертністю та стійкістю до дії біологічного середовища.

Макропористі кремнеземи –до носіїв цього типу належать силікагель, силохром та макропористе скло. Ці носії мають жорстку сітку з певним розміром пор, яка хімічно інертна, стійка до механічної дії та мікроорганізмів. Висока вартість кремнеземних носіїв та їх модифікації обмежують їх використання у промисловості.

Природні алюмосилікати – глини, цеоліти, пориста кераміка мають високу щільність поверхневих груп. На останніх відбувається зв‘язування білкових молекул за рахунок як електростатичної взаємодії так і водневих зв‘язків.

АДСОРБЦІЙНА ЄМНІСТЬ ІОНООБМІННИКІВ

Кількість білка, яку може зв‘язати іонообміник класичного типу (на основі целюлози) залежить від розмірів білкових молекул – чим дрібніші молекули білка, тим вищий ступінь адсорбції. Великі молекули приєднуються лише до поверхні часток іонообмінника.

Загальна ємність пов‘язана з розміром внутрішнього об‘єму частки, який доступний для білків та залежить від розміру пор.

ЕЛЮЦІЯ АДСОРБОВАНОГО БІЛКА

Розрізняють два загальних метода елюції (видалення з колонки з обмінником) білків:

69

зміна рН буфера до значення, при якому зв‘язування білка з адсорбентом послаблюється (для аніонообмінників використовують більш низькі значення рН, а для катіонообмінників – більш високі);

підвищення іонної сили, що викликає послаблення електростатичної взаємодії між білком та адсорбентом. Для цього використовують сольові градієнти – звичайні методи елюції білків з іонообмінників. Для отримання градієнта використовують хлориди К та Na. Сіль може безпосередньо витискати білок. Так, хлорид-іони в ДЕАЕ-сорбентах займають позитивно заряджені центри зв‘язування та блокують приєднання до них білків.

КОЛОНКОВА ХРОМАТОГРАФІЯ – це головний метод розділення ферментів та інших білків, якій дозволяє використовувати різні сорбенти.

Успішне проведення іонообмінної хроматографії залежить від правильної підготовки іонообмінника. Спершу порошок сорбенту поміщують у воду для набухання у високій склянці. Після осадження більшої частини порошку, у надосаді залишаються дрібні не осаджені частинки іонообмінника, які необхідно відсмоктати, тому що вони забивають колонку та різко знижують швидкість протікання розчинника.

Адсорбенти різняться за ємністю по відношенню до різних білків, тому розміри колонок, які використовують для розділення, варіюють у широких межах. У лабораторії повинні бути колонки різної ємності (від 1 см3 до 2 л) та різної форми. Колонки повинні бути оснащені спеціальними приладами для вирівнювання верхньої та нижньої поверхонь носія, щоб потік рідини, якій проходить зверху до низу колонки не порушувався на кінці колонки. При роботі з малими об‘ємами можна використовувати пастерівськи піпетки з тампоном зі скляної вати, шприц з перфорованим пластиковим диском на дні або звичайну скляну трубку з гумовим корком та фільтром з пористого диску. Бажано,щоб колонка була обладнана скляним краном, припаяним до дна колонки.

Колонку фіксують строго вертикально і заповнюють буфером. Зверху на колонці через гумову манжету закріплюють лійку об‘ємом 300–400 мл. Необхідно слідкувати, щоб у колонці не було пухирців повітря. Суспензію сорбенту у невеликому об‘ємі буферного розчину вносять у колонку і, при закритому крані, дають їй вільно осісти. Колонку слід заповнювати сорбентом одразу при постійному помішуванні суспензії (рис.1).

70