Novicka_praktykum_z_biotehnologii_ch1

Цілість стерилізуючого фільтру повинна бути перевірена до застосування і підтверджена одразу ж після використання відповідним методом, таким як випробування на виникнення крапкових пухирців, дифузного потоку або випробуванням під тиском.

При валідації слід встановити час, необхідний для фільтрації відомого обсягу не розфасованого розчину, і різницю тиску по різні сторони фільтру; будь-які суттєві відхилення від цих параметрів під час рутинного ведення виробництва слід записувати і досліджувати. Результати таких перевірок мають бути включені до протоколу серії.

Фільтр не повинен впливати на продукцію шляхом утримування її інгредієнтів або виділення в неї речовин.

Стерилізація фільтрацією може бути виконана у вакуумних або герметичних умовах. Розрізняють гідрофільні, гідрофобні, багаторазового використання та одноразового (шприцеві) фільтри.

Використовують мембранні фільтри з поліпропілену, целюлози, пористої нержавіючої сталі, запеченої тканини, проволоченої сітки, мікроволокна, нейлона, емпрегнованої епоксидною смолою целюлози та ін. Основні сучасні матеріали для виготовлення стерилізуючи мембран є нейлон, фторпласт, полісульфон, ефіри целюлози. Матеріал мембрани повинен бути сумісним з продуктом фільтрації. Продукт не повинен змінювати фільтраційні властивості мембрани, а остання не повинна виділяти у фільтрат будь-які речовини та сорбувати на собі речовини з фільтрату.

Зараз широко застосовуються целюлозні та нітроцелюлозні мембранні фільтри, які мають контрольований розмір пор (12-0,01 мкм, іноді 5 нм). 65-80% поверхні фільтра мають 105 пор на см2.

Принципи проведення стерилізуючої фільтрації.

Система має бути максимально простою.

Розміри системи повинні забезпечувати обмеження потоку пре фільтром перед стерилізуючою фільтрацією.

Стерилізуючий фільтр повинен бути вмонтований у кінцеву точку системи.

Краще використовувати тиск (не вакуум).

Усі клапани поміщати перед фільтром.

Не використовувати сполучень з різьбою.

Проводити тест на цілісність системи до та після фільтрації.

41

Промивати обладнання зразу після використання.

Проводити фільтрацію у максимально чистих умовах..

Стерилізуючи фільтри стерилізуються шляхом автоклавуванням у розібраному або повністю складеному стані на протязі 15 хвилин при 121 °С. Якщо необхідно, після автоклавування фільтр збирають в стерильних умовах ламінарного боксу.

БАКТЕРІАЛЬНИЙ ТЕСТ НА ПІДТВЕРДЖЕННЯ СТЕРИЛІЗУЮЧОЇ ФІЛЬТРАЦІЇ. У процесі фільтрації для отримання стерильного продукту необхідно видалити усі бактерії з розчину. Для проведення цього тесту повинна реалізовуватися найбільш складна ситуація за умов 100% затримування. Для надійного проведення цього тесту важливо, щоб тест-організм був найбільш стійким до обраної дії. Наприклад, спори Bacillus strearothermophilus термічно стійкі та використовуються для доведення надійності роботи автоклавів.

Під час фільтрації найбільш суттєвою характеристикою тесторганізму є його розмір. В якості такого організму був обраний

Pseudomonas diminuta АТСС 1914, якій має розмір ≈ 0,27 мкм.

Мікроорганізм повинен культивуватися в умовах, що зберігають мінімальний розмір та сферичну форму, тобто використовувати мінімальну кількість поживного середовища (сольового лактозного бульону) та не струшувати культуру.

Важливо обрати оптимальну кількість тест-організму для перевірки фільтру. Мала кількість мікроорганізму не дозволить перевірити кожну пору, а надлишок призведе до утворення нещільного шару, якій буде працювати як префільтр. Тому оптимальним є така кількість клітин, яка утворить моношар, що вкриє усю поверхню фільтру - 107 організмів на 1 см2 поверхні фільтра.

В результаті бактеріального тесту отримують кількісне значення для стерилізуючого фільтра у логарифмах значення зменшення (LRV). LRV – це десятковий логарифм відношення числа організмів, що потрапляють на фільтр на 1 см2, до числа організмів, що пройшли через фільтр. Фільтр вважається стерилізуючим якщо LRV≥7 на см2. Це значить, що при потраплянні на фільтр 107 на см2 Pseudomonas diminuta жоден з мікроорганізмів не пройшов через фільтр.

42

КОНТРОЛЬ ЦІЛІСНОСТІ ФІЛЬТРІВ. Перевірка фільтрів на цілісність базується на фізичних явищах, повязанних з процесом взаємодії змоченої рідини та мембрани фільтру.

Дифузійний тест полягає у дифузії затиснутого газу через змочену мембрану елемента фільтру. При цьому затиснуте повітря розчиняється у рідині, що знаходиться у порах мембрани, та виходить на зворотній стороні фільтру. Під величиною дифузії розуміємо певний заданий об‘єм газу, який потрібний для компенсації втрат газу у наслідок дифузії для підтримування постійного тиску. У пошкодженому фільтрі величина дифузії значно перевищує цей параметр для даного типу фільтрів. У якості змочувальної рідини для гідрофільних фільтрів застосовується вода, а для гідрофобних – органічні розчинники (етиловий та ізопропіловий спирти) або їх суміш з водою. У якості газу для тесту використовують затиснуте повітря або азот.

Тест втрати тиску перевіряє герметичність фільтраційної системи за втратою тиску за певний проміжок часу.

Тест на точку пухирця - це поступове підвищення тиску у системі до утворення постійного повітряного потоку. Тиск при якому відбувається вичавлювання води із пори фільтру та утворення постійного повітряного потоку і називається точкою пухирця.

ЗАВДАННЯ.

1.Провести стерилізуючу фільтрацію сироватки крові за допомогою одноразового шприцевого фільтру.

Лабораторна робота № 8.

УМОВИ КУЛЬТИВУВАННЯ ВИРОБНИЧИХ ШТАМІВ

Мета- опанувати методи культивування виробничих штамів у різних умовах культивування.

43

Культивування є основною стадією технологічного процесу мікробного синтезу. Воно визначає кількісні та якісні характеристики виробництва біопрепаратів.

Під час культивування отримують біомасу та продукти метаболізму, які накопичуються у середині клітини та у культуральній

рідині.

Ферментація – сукупність послідовних операцій від внесення у підготовлене середовище посівного матеріалу і до завершення процесу росту клітин або біосинтезу цільового продукта.

Культуральна рідина - складна суміш, яка утворюється після закінчення ферментації і складається з клітин продуценту, розчину невикористаних поживних компонентів і продуктів біосинтезу.

Культивування вимагає оптимізації таких параметрів:

Температура (інтервал робочих Т коливається 25-60оС, точність до 1

оС);

рН ( від 2до 9, з точністю до 0,2 рН);

спосіб перемішування;

концентрацію кисню для аеробів (розхід повітря від 0,15-до 2,5 м3/ м3

середовища /хв);

стерильність;

запобігання розповсюдженню мікроорганізмів-продуцентів у зовнішнє середовище;

час культивування (для отримання біомаси -24 год, первинних метаболітів – 48-72 год, вторинних 72-144год);

Як правило оптимальні умови культивування змінюються при кожному десятикратному збільшенні об‘єму біореактора.

Промислова ферментація процес багатоступеневий.

Процедура розпочинається з виготовлення та стерилізації культурального середовища та обладнання.

Спочатку вирощують висхідну культуру (5-10 мл).

Потім інкубують її у колбі, яку струшують (200-1000мл).

Після цього її переносять у ферментер для посівного матеріалу (10-

100л).

Потім у промисловий ферментер (1000-100000 л).

Збір матеріалу.

44

Якщо продукт локалізований всередині клітини, останні руйнують та видаляють.

Якщо продукт секретується, його виділяють безпосередньо з середовища.

ПРОМИСЛОВЕ КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ РОЗРІЗНЯЮТЬ:

1. ПОВЕРХНЕВЕ- вирощування промислової культури на середовищі, яке містить тверді частки субстрату. Культивування відбувається у кюветах, які виготовлені з оцинкованої жесті або нержавіючої сталі з перфорованим дном. Заповнені поживним середовищем кювети розміщують на етажерках з невеликим нахилом. Кювети об‘єднують у касети. Цей спосіб не є ефективним і використовується у разі відсутності альтернативного способу культивування. Використовується для отримання деяких ферментів з грибів-продуцентів, які культивуються на нестандартній сировині – відходах, наприклад, пшеничні висівки для отримання протеаз і амілаз, солодові паростки для отримання вітамінів та амінокислот.

Поверхневе культивування буває:

твердофазне – мікроорганізми ростуть на поверхні щільного середовища.

Рідке – мікроорганізми ростуть на поверхні рідкого поживного середовища.

2.ГЛИБИННЕ – мікроорганізми розподіляються у всьому об‘ємі, а компоненти поживного середовища надходять в результаті аерації та перемішування. Це більш ефективний вид ферментації, дозволяє виробляти на одиницю часу та об‘єму більшу кількість цільового продукту.

За режимом культивування буває:

ПЕРІОДИЧНИМ – мікроорганізми вирощують у стерильних умовах без додавання свіжого культурального середовища. Періодичне культивування залежить від кінетичної кривої росту мікроорганізмів:

Лаг-фаза – клітини адаптуються до нових умов (рН, концентрація поживних речовин). Ця фаза спостерігається кожен раз, якщо посівний матеріал отриманий з культури у стаціонарну фазу. Тривалість лаг-фази залежить від часу знаходження у стаціонарній фазі і від відмінностей попереднього і нового середовища.

45

Якщо посівний матеріал отриманий від культури у експоненціальну фазу – ріст почнеться зразу без вираженої лаг-фази.

Експоненціальна фаза характеризується діленням клітин, при цьому питома швидкість росту залишається постійною.

В результаті виснаження лімітуючого субстрату або накопичення продуктів метаболізму, які пригнічують ріст, збільшення клітин припиняється і культура переходить у стаціонарну фазу. Біомаса залишається постійною, метаболізм змінюється. В цей період синтезуються вторинні метаболіти.

Фаза відмирання – енергетичні запаси закінчуються, метаболізм припиняється. Ферментацію зупиняють у стаціонарну фазу.

ПЕРІОДИЧНЕ КУЛЬТИВУВАННЯ З ДОДАВАННЯМ СУБСТРАТУ – до культури періодично додають поживні речовини, а культуральне середовище не видаляють до кінця культивування. У ферментер періодично додають субстрат, а кінцевий продукт збирають лише по завершенню культивування. Додавання субстрату призводить до подовження експоненціальної та стаціонарної фаз, а також до збільшення біомаси та кількості метаболітів.

У стаціонарну фазу мікроорганізми синтезують протеолітичні ферменти, які руйнують усі білки. Тому, якщо метою культивування є отримання білкових продуктів, треба зупинити ферментацію до цієї фази. В залежності від генотипу мікроорганізмів та природи рекомбінантного білка під час періодичної ферментації з додаванням субстрату вихід продукту може зрости на 25-1000% у порівнянні з простою періодичною ферментацією. Періодичне культивування з додаванням субстрату можна використовувати для культивування клітин тварин та комах.

БЕЗПЕРЕРВНЕ КУЛЬТИВУВАННЯ – свіже культуральне середовище надходить у ферментер безперервно, паралельно відводиться така сама кількість клітинної суспензії.

Безперервна культура характеризується стаціонарними умовами – видалення клітин урівноважується їх збільшенням за рахунок поділу. Широке розповсюдження набули такі системи:

Хемостат - сталість хімічних характеристик та складу середовища, у якому знаходяться мікроорганізми Це процес, при якому у культуру з постійною швидкістю безперервно подається свіже поживне середовище,

46

а об‘єм культури підтримується на постійному рівні шляхом безперервного видалення частини культуральної рідини. Базується на твердженні – абсолютна концентрація клітин не залежить від поживних речовин, які знаходяться у середовищі і лише від субстрату, якій лімітує ріст. Середовище складають так, щоб усі поживні компоненти були у надлишку у порівнянні з компонентами, які необхідні для синтезу клітини у необхідній концентрації. Цей єдиний компонент, якого не стає лімітує ріст та контролює величину мікробної популяції у сталому стані.

Турбидостат – це культивування де постійна концентрація мікроорганізмів підтримується шляхом регулювання оптичної щільності культури. У разі перевищення встановленого рівня вмикається насос, якій подає свіже середовище.

Cистема безперервного культивування поршневого типу –

дозволяє імітувати періодичне культивування. Використовується лише у лабораторних умовах.

СТЕРИЛЬНЕ ТА НЕСТЕРИЛЬНЕ КУЛЬТИВУВАННЯ.

Ідеальний варіант припускає 100% домінування виробничої культури. Однак, на практиці ця умова не виконується. Реально вдається забезпечити переважний ріст та життєздатність штаму-продуценту. Особливо це має значення на початку ферментації. У подальшому з‘являється стороння мікрофлора і завдання біотехнолога створити умови культивування, які б пригнічували ріст сторонньої мікрофлори. Це так звана нестерильна ферментація, яка насправді не існує, тому що створюються такі умови, які забезпечують домінування виробничого штаму над сторонньою мікрофлорою. Приклад - культивування у безперервних умовах кормових дріжджів, отримання оцтової кислоти при низьких рН, отримання кормового вітаміну В12 та анаеробне бродіння органічних речовин з використанням термофільних мікроорганізмів в температурних умовах 5055оС. також можна збільшити частку посівного матеріалу до 20-25%.

АЕРОБНЕ ТА АНАЕРОБНЕ КУЛЬТИВУВАННЯ. Під час аеробного культивування мікроорганізми потребують кисню у середовищі. Це досягається шляхом забезпечення необхідної концентрації розчиненого кисню у рідкому середовищі, шляхом надходження кисню по трубах (барботерах) з малими отворами по всій довжині. При цьому кисень

47

надходить у середовище у вигляді дрібних пухирців, які розчиняються під дією мішалки.

Інколи використовують анаеробне культивування, наприклад для отримання вітаміну В12.

ЗАВДАННЯ.

1. Провести контроль морфологічних характеристик мікроорганізмів шляхом фазово-контрасної мікроскопії.

Лабораторна робота № 9.

КОНТРОЛЬ ПАРАМЕТРІВ РОСТУ ВИРОБНИЧИХ ШТАМІВ-СУПЕРПРОДУЦЕНТІВ ПІД ЧАС КУЛЬТИВУВАННЯ.

Мета: опанувати методи прямого та непрямого визначення якісних та кількісних характеристик біомаси.

Визначення концентрації мікроорганізмів та клітин під час оптимізації процесів глибинного культивування у біореакторах можливе прямими та непрямими методами.

ПРЯМІ МЕТОДИ визначення концентрації мікроорганізмів

базуються на кількісному аналізі здатності клітин до розмноження на щільному або рідкому середовищі. Життєздатність будь якої культури визначається відношенням числа клітин, здатних розмножуватися на адекватному середовищі до загального числа мікробних клітин. Слід враховувати, що у будь якій популяції існує не менше п‘яти типів клітин:

повноцінні, неушкоджені;

злегка ушкоджені, що швидко відновлюються;

сильно ушкоджені, що повільно відновлюються;

незворотно ушкодженні, проте обмін речовин ще відбувається;

мертві.

Серед прямих методів визначення концентрації слід виділити наступні:

Висівання на щільне середовище

48

Електрооптичний

Флюорометричний

Мікрокультуральний

Оптичний (лазерний)

Максимальне розведення

ВИЗНАЧЕННЯ КОНЦЕНТРАЦІЇ МІКРООРГАНІЗМІВ ШЛЯХОМ ВИСІВАННЯ НА ЩІЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ. Розроблені спеціальні прилади для механізації візуального підрахунку клітин, що виросли на чашках Петрі з використанням підсвічування та збільшення, електронним детектором. Аналіз розвитку мікроорганізмів та клітин на агаризованих та інших середовищах використовують не лише з метою виявлення частки життєздатних клітин, а також задля виявлення пошкоджень. Для цього у агарізоване середовище вводять певні речовини та порівнюють характер розвитку мікробної популяції на нормальному та модифікованому середовищі (наприклад, додаючи у середовище солі жовчних кислот виявляють у грам негативних бактерій наявність дефектів у зовнішній мембрані).

НЕПРЯМІ МЕТОДИ дозволяють характеризувати здатність мікробних клітин розмножуватися на підставі їх фізіолого-біохімічних, морфологічних, тинкторіальних та інших властивостей. Використання непрямих методів скорочує час аналізу. Аналіз базується на даних кореляції між кількісними змінами досліджуваної властивості мікроорганізму та рівнем життєздатності або числом життєздатних клітин у культурі, які можна визначити прямими методами. Така кореляція проявляється після екстремальних дій (кип‘ятіння, обробка хімічними реагентами, заморожування), коли відбувається 100% інактивація клітин. Тому результати непрямих досліджень завжди мають місце вірогідності похибки.

Серед непрямих методів визначення концентрації клітин у біомасі слід виділити наступні:

мікроскопічний (циторефрактометричний)

цитохімічний

біофізичний

біохімічний

теоретичний

Мікроскопічний метод визначення концентрації мікроорганізмів

базується на можливості аналізу частки життєздатних клітин за допомогою

49

мікроскопії у темному полі або фазового контрасту у випадку грубої коагуляції їх внутрішньоклітинного вмісту або лізису.

КОНТРОЛЬ МОРФОЛОГІЧНИХ ХАРАКТЕРИСТИК МІКРООРГАНІЗМІВ ШЛЯХОМ ФАЗОВО-КОНТРАСНОЇ МІКРОСКОПІЇ.

За допомогою звичайного світлового мікроскопа можна досліджувати лише висококонтрастні об'єкти, тобто ті, які порівняно з фоном інтенсивніше поглинають світлові хвилі, що йдуть від конденсора. Щоб підсилити цей ефект, об'єкти дослідження, як правило, фарбують. Такі об'єкти називають амплітудними. Іноді виникає необхідність досліджувати малоконтрастні об'єкти, тобто ті, що майже не змінюють, порівняно з фоном, потік світлових променів (у звичайному мікроскопі дослідник їх не бачить або лише відмічає ледь помітне зображення). Неконтрастними є непофарбовані біологічні об'єкти (бактерії, клітини тощо). Вони не змінюють амплітуду світлових променів, що проходять крізь них, а здатні змінити лише фазу останніх (світлові промені, що проходять крізь щільніші ділянки препарату, дещо відстають за фазою від променів, які проходять поряд). Однак відомо, що людське око не в змозі помітити різницю між променями, які різняться лише за фазою.

Зметою "перетворення" фазових об'єктів на амплітудні голландський вчений Церніке (1934) запропонував спеціальну фазово-контрастну мікроскопію.

Промисловість випускає фазово-контрастний пристрій КФ-4, яким можна обладнати звичайний світловий мікроскоп і застосовувати фазовоконтрастну мікроскопію. Він включає фазово-контрастний об'єктив, револьверний конденсор з діафрагмою, допоміжний мікроскоп. До оптичної системи фазово-контрастного пристрою входять фазова пластинка та кільцева діафрагма конденсора.

Фазова пластинка - це кружечок на одній із лінз об'єктива, напилений солями рідких металів. Пластинка напівпрозора, змінює фазу світлової хвилі на 1/4. Це й призводить до перетворення фазової різниці в амплітудну. Кільцева діафрагма - непрозора пластинка, яка має лише кільце, проникне для світлових променів.

Зметою одержання фазово-контрастного ефекту необхідно, щоб кільце фазової пластинки точно збігалося з кільцевою діафрагмою конденсора.

50