101. Характеристика и частота врожденной и наследственной патологии. Популяционно-статистический метод, значимость для практического здравоохранения.

НАСЛЕДСТВЕННАЯ ПАТОЛОГИЯ классифицируется по различным критериям, но по основному этиологическому принципу имеет место разделение на следующие формы:

* хромосомные болезни (ХБ) или синдромы. К 2000 году описано более 100 нозологических единиц, при этом известно около 1000 типов хромосомных нарушений, выявляемых у человека;

* генные болезни, в свою очередь делятся на:

- моногенные болезни (МБ), причиной которых служит наличие мутации одного гена. Общее число известной моногенной патологии превышает 4 500 нозологических единиц;

- полигенные болезни (многофакторные, мультифакториальные, болезни с наследственной предрасположенностью) - болезни, обусловленные аддитивным (суммарным) действием генетических и средовых факторов.

Среди основных методов ДНК-диагностики выделяются:

- дозовый блот-гибридизационный анализ;

- анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ);

- полимеразная цепная реакция (ПЦР);

- анализ полиморфизма микросателлитных последовательностей.

Благодаря этим методам у врачей появились уникальные возможности эффективного применения в различных областях медицины самых совершенных технологий.

В настоящее время в ДНК-диагностике выделяют 4 подхода. Они применяются в зависимости от того: известен или не известен ген данного заболевания (1), клонирован или нет этот ген или ДНК-копия его тРНК или кодирующей ДНК (2), известна или нет природа мутации, вызывающей заболевание (3), насколько широко распространена данная мутация в различных случаях данного заболевания в данной популяции, данном географическом регионе (4).

Виды ДНК-диагностики: подтверждающая, пресимптоматическая, носительства, пренатальная. Принципиально различают прямую и косвенную диагностику моногенных наследственных болезней. Прямые методы возможны лишь при условии, что ген заболевания клонирован, известна его экзон-интронная организация или нуклеотидная последовательность полноразмерной комплементарной ДНК. При прямой диагностике предметом анализа являются мутации гена.

Главным преимуществом прямых методов диагностики является почти 100% эффективность. Прямые методы основаны на технологии ПЦР.

Однако в большинстве случаев наследственных заболеваний ген не клонирован или заболевание является генетически гетерогенным, т.е. обусловлено повреждением в разных генах, либо молекулярная организация гена не позволяет использовать прямые гены. Эти трудности могут быть преодолены с помощью косвенных методов ДНК-диагностики, основанных на использовании сцепленных с геном полиморфных маркеров. В этом случае определяется гаплотип хромосомы, несущей мутантный ген в семьях высокого риска, т.е. у родителей больного и его ближайших родственников. Такой подход возможен практически для всех моногенных заболеваний с известной локализацией гена. Основной недостаток косвенных методов диагностики - обязательное предварительное изучение генотипа (гаплотипа) хотя бы одного пораженного родственника. В случае отсутствия пораженных родственников, “доступных” для обследования, проведение диагностики (за редким исключением) становится невозможным.

ПОПУЛЯЦИОННО-СТАТИСТИЧЕСКИЙ МЕТОД

Метод находит широкое применение в клинической генетике, т.к. внутрисемейный анализ заболеваемости не отделим от изучения наследственной патологии как в станах с большим населением, так и в относительно изолированных популяционных группах.

Сущность метода заключается в изучении (с помощью методов вариационной статистики) частот генов и генотипов в различных популяционных группах, что дает необходимую информацию о частоте гетерозиготности и степени полиморфизма у человека. В частности, в гетерозиготном состоянии в популяциях находится значительное количество рецессивных аллелей, что обуславливает развитие различных наследственных заболеваний, частота которых зависит от концентрации рецессивного гена в популяции и значительно повышается при заключении близкородственных браков. Мутации могут передаваться потомству во многих поколениях, что приводит к генетической гетерогенности, лежащей в основе полиморфизма популяций.

Согласно закону Харди-Вайнберга (1980) - в популяции сохраняется постоянное соотношение чатоты генотипов из поколения в поколение, если никакие факторы не нарушают это равновесие.

Формула Харди-Вайнберга:Р - частота, с которой встречается доминантный ген "А";

g- частота, с которой встречается рецессивный аллель "а".

Сумма Р+g всегда равна 1. Соотношение генотипов АА, Аа, аа

выражается формулой: (Р+g)2 =Р2+2Hg+g2.

Статистический анализ распространенности отдельных генов и контролируемых ими признаков в популяционных группах позволяет определить адаптивную ценность конкретных генотипов. Среди людей невозможно найти генетически одинаковых лиц (за исключением монозиготных близнецов, для которых предполагается 100% общих генов), хотя общность генов хорошо прослеживается у близких и дальних родственников.

102. ДНК-диагностика, показания, методика ПЦР; значение для медико-генетического консультирования.

ДНК-типирование подразумевает определение первичного генетического дефекта. По меньшей мере для 1000 форм на сегодня картированы мутантные гены и для большинства из них установлены типы мутаций. Исследования подобного рода обладают очень высокой достоверностью. Внедрение ДНК-исследований в практику здравоохранения очень важно, так как позволяет существенно повысить эффективность медико-генетического консультирования.

Внутри метода выделяют прямые и косвенные подходы ДНК-диагностики.

Показания. Пренатальная, то есть дородовая ДНК-диагностика плода – это относительно новое направление в репродуктивной медицине. Оно позволяет на ранних сроках беременности подтвердить или опровергнуть у ребенка наличие врожденных генетических заболеваний. Существует несколько видов подобной диагностики, но, к сожалению, не все из них абсолютно безопасны. Будет лучше, чтобы именно врач, основываясь на показаниях, назначил все необходимые исследования, включая ДНК-диагностику.

Прямые методы ДНК-типирования проводятся в том случае, когда известна точная локализация мутантного гена (еще лучше – варианты мутаций). Для исследования достаточно материала от пораженного члена семьи.

1) Метод "блот-гибридизации", предложенный в 1975 году Саузерн. Сущность его заключается в расщеплении ДНК специфическими рестриктазами, "узнающими" определенные нуклеотидные последовательности. После этого полученные фрагменты ДНК разделяют методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле, далее - фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и подвергают гибридизации с олигонуклеотидным зондом, меченым изотопом, который комплементарно связывается с фрагментом ДНК. После отмывки несвязанной с фильтром радиактивной метки проводится экспозиция исследуемого фрагмента на рентгеновской пленке и анализируется полученный результат, что позволяет определить перестройки внутригенных нуклеотидных последовательностей либо тесно сцепленных с мутантным геном.

2) В настоящее время очень широко применяется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод был впервые предложен в 1983г. американским ученым Кэрри Б.Мюллису

Различают три этапа проведения ПЦР:

1) выделение ДНК из исследуемого материала (венозная кровь и другие клетки организма, содержащие хромосомный материал );

2) амплификация, сущность которой заключается в многократном синтезе определенного участка гена;

3) электрофорез аплифицированного фрагмента в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием препарата и анализом характера внутригенной перестройки либо ее исключением.

Метод прост, экономичен, являясь в тоже время высокочувствительным. В России ДНК-типирование проводится при следующих моногенных заболеваниях: хорея Гентингтона, миодистрофии Дюшенна/Беккера, Эрба-Рота, Ландузи-Дежерина спинальные, невральные мышечные атрофии, адреногенитальный синдром, фенилкетонурия, муковисцидоз, мукополисахаридозы и др. (возможна разработка методики исследования любого заболевания, для которого картирован мутантный ген).

Косвенные методы основаны на семейном анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (метод ПДРФ) исследуемых районов ДНК. Он применим в тех случаях, когда известна приблизительная локализация мутантного гена, т.е изучены участки близкосцепленные с предполагаемым геном. Основная сложность заключается в подборе тесно сцепленных с маркером болезни ПДРФ-зондов. Для исследования необходим материал от членов "ядерной" семьи (т.е. пробанда и его родителей). Метод применим для проведения пренатальной диагностики.

Безусловно современные возможности молекулярной биологии не исчерпываются вышеописанными методами и происходит постоянное внедрение новых технологий.

Кроме вышеотмеченных методов применяются также молекулярно-биологические исследования на уровне белков (энзимодиагностика, иммунохимическая диагностика и анализ физико-химических свойств белков) и промежуточных продуктов метаболизма (флюорометрия, хроматография и др.). Лаборатории, позволяющие проводить вышеописанные исследования в России имеются только в федеральных центрах.

Главные цели медико-генетического консультирования заключаются в установлении роли наследственной компоненты в этиологии данного заболевания и прогнозировании риска иметь больных потомков. В распоряжении врачей имеется весь арсенал перечисленных методов генетики человека. Пример с лечением фенилкетонурии диетой, из которой исключен фенилаланин, указывает на то, что лица, страдающие многими наследственными болезнями, в настоящее время не могут считаться обреченными. Большие надежды возлагаются на методы генной инженерии, которая в принципе может позволить заменять патологические аллели нормальными и, возможно, вообще постепенно освободит человечество от многих недугов.