Визначення амілолітичної (декстринуючої) активності крапельним методом.

Амілолітична активність визначається крапельним методом візуальним спостереженням за зміною забарвлення крохмалю з йодом при дії на крохмаль амілаз. Вона характеризує властивість каталізувати гідроліз крохмалю до незабарвлених йодом декстринів, обумовлену в основному наявністю у препараті -амілази. При наявності у препараті -амілази і глюкоамілази цим методом визначають сумарну дію всіх амілолітичних ферментів.

За одиницю амілолітичної активності прийнята така кількість ферменту, яка каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до продуктів, незабарвлених йодом, за 1 год при температурі 30⁰С у суворо визначених умовах .

АС визначається числом одиниць у 1 г препарату, культури або 1 мл розчину. АС показує , скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до незабарвлених йодом продуктів 1г препарату, культури або 1 мл розчину за 1 год (в умовах, аналогічних умовам визначення).

Методика визначення АС залежить від гідролізу 1%-го забуференого розчину крохмалю; кінець реакції контролюють візуально за йодною пробою.

Чутливість методу визначається мінімальною кількістю часу, за який можна візуально визначити зміну забарвлення йоду.

Допускають, що швидкість ферментативної реакції прямо пропорційна кількості застосованого ферменту і залишається сталою від 5хв до 1 год, тобто, реакція підпорядковується закону реакції нульового порядку.

Встановлено вплив величини рН і хімічної природи буферу на величину АС.

З ацетатним буфером рН=4,7 величина АС у грибних препаратів у середньому у 1,5 рази вище, ніж при визначенні з фосфатним (рН=4,9), тому рекомендується брати ацетатний буфер.

Прилади, посуд, реактиви

1. Пробірки великі

2. Скляні палички

3. Циліндр

4. Ультратермостат

5. Секундомір

6. Біла фарфорова пластинка

7. Ацетатний буфер.

8. 1%-й розчин розчинного крохмалю.

9. Розчин йоду.

Порядок виконання роботи

Необхідно 25 мл субстрату помістити у широку пробірку, в яку вставлена скляна паличка; 30 мл води і 30 мл витяжки налити у окремі пробірки, поставити їх у ультратермостат і витримати на протязі 10хв при температурі 30⁰С.

Потім у пробірку з крохмалем додати 1-25 мл ферментного розчину у відповідну кількість води так, щоб загальний об’єм реакційної суміші складав 50 мл.

Вміст пробірки перемішати паличкою і відмітити за секундоміром час, коли була додана витяжка до розчину крохмалю у пробірці, поміщеній у ультратермостат .Через кожні 60 с паличкою відбирати пробу у вигляді краплі. Краплю помістити на білу фарфорову пластинку, з’єднати її з краплею робочого розчину йоду і спостерігати за забарвленням. Реакція розщеплення крохмалю є закінченою, коли йод перестає змінювати забарвлення при з’єднанні з краплиною забарвленого розчину на протязі перших 10с. Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, незабарвлених йодом, повинен бути 10-12хв.В іншому випадку аналіз необхідно повторити з більшою чи з меншою кількістю розчину ферменту .

Амілолітична активність ферментних матеріалів

АС=од./г або мл,

де 0,25-кількість крохмалю, яка знаходиться в 25 мл його 1%-го розчину, г;

60- перерахунок на одиницю часу, 1год;

- кількість ферменту, яка бере участь в реакціях, г або мл. Ця величина визначається з урахуванням концентрації вихідної витяжки і наступного розведення; - час, за який пройшло розщеплення крохмалю до незабарвлених йодом продуктів.

Приклад. Вихідний розчин ферменту приготовлений із розрахунку 5г культури гриба на 100 мл забуференої води. Культура дуже активна, тому потрібно додаткове розведення: 20 мл вихідного розчину доведено в мірній колбі до 50 мл дистильованою водою і звідти на аналіз взято 2 мл, тобто, отримали ланцюг розведень.

5г - 100мл - 20мл - 50мл - 2мл.

Для проведення гідролізу 0,25 г крохмалю 2 мл ферментного розчину останнього розведення потрібно 12хв. Тоді

АС= од. АС/г.

У даному випадку, враховуючи всі розведення,

.

При перерахунку на 1г вихідної повітряно-сухої культури.