Побудова калібрувального графіка.

Для розрахунку протеолітичної активності необхідно побудувати калібрувальну криву по тирозину. Потім по калібрувальній кривій вирахувати тирозиновий еквівалент ТЕ, тобто ту оптичну густину, котру дав би 1мкМ тирозину в 1мл стандартного розчину. Цей еквівалент необхідно встановити для кожної нової партії реактиву Фоліна і кожного фотоелектроколориметра.

Для побудови калібрувального графіка готують розчини тирозину з концентрацією 10^-3М. Для цього наважку 181,19мг чистого тирозину розчиняють в 0,2н. розчині хлористоводневої кислоти HCl в мірній колбі 1 л (готують 2 паралельні проби). З цього вихідного розчину готують подальші розведення таким чином:

Розчин 1

В мірну колбу на 50мл вносять 1 мл початкового розчину тирозину і доводять об’єм до мітки 0,2н розчином хлористоводневої кислоти HCl. Концентрація тирозину С₁ при цьому становитиме 0,2∙10^-4М, або 0,02мкмоль/мл.

Розчин 2

2 мл початкового розчину; С₂=0,4∙10^-4М, або 0,04мкмоль/мл.

Розчин 3

4 мл початкового розчину; С₃=0,8∙10^-4М, або 0,08мкмоль/мл.

Розчин 4

5 мл початкового розчину; С₄=1,0∙10^-4М, або 0,10мкмоль/мл.

Розчин 5

7,5 мл початкового розчину; С₅=1,5∙10^-4М, або 0,15мкмоль/мл.

Розчин 6

10 мл початкового розчину; С₆=2,0∙10^-4М, або 0,20мкмоль/мл.

Розчин 7

15 мл початкового розчину; С₇=3,0∙10^-4М, або 0,30мкмоль/мл.

Потім в ці пробірки вносять по 1мл розчину тирозину різної концентрації. Додають в них при постійному перемішуванні по 5мл 0,5 М розчину карбонату натрію Na₂CO₃ і 1мл робочого розчину Фоліну. Контрольний аналіз готують так само, але замість розчину тирозину беруть 1 мл дистильованої води. Реакційна суміш видержується 20 хв.

Інтенсивність кольору досліджуваного розчину визначають по порівнянню з контрольним при довжині світової хвилі 656-670 нм в кюветах з товщиною поглинаючої стінки світло 10 мм. По середнім даним, одержаних в двух аналізах, будують калібрувальний графік

На осі абсцис відкладається кількість тирозину С (в мкмоль/мл), а на осі ординат - відповідні значення оптичної густини.

Протеолітичну активність ПС (в од/г, або од/мл) розраховують по формулі:

ПС=ОД/г, де:

D - оптична густина

4 – відношення об‘ємів реакційної суміші і розчину ферменту після при бавлення ТХО;

1000 – коефіцієнт переводу одиниць на 1г ферментного препарату;

ТЕ – тиризований еквівалент, визначений по калібрувальному графіку;

10 - час гідролізу субстрату, хв;

m- кількість ферментного препарату , який взятого на протеоліз, мг на 1 мл ферментного розчину

Реактиви

1.Універсальний буферний розчин 0,1М

1.1.Розчин А – 0,1 М розчин оцтової кислоти

1.2.Розчин В – 0,1 М розчин ортофосфорної кислоти Н₃РО₄

1.3.Розчин С – 0,1 М розчин ортоборної кислоти Н₃ВО₃

1.4.Розчин їдкого натру NаОН 1N розчин

2.Універсальний буферний розчин 0,01М.

3.Розчин ТХО Cl₃CCOOH 0,3М розчин

4.Хлористоводнева кислота НCl 1N розчин

5.Натрій вуглекислий Nа₂СО₃∙0,5м розчин

6.Основний реактив Фоліна

7.Робочий реактив Фоліна

8.Хлористоводнева (соляна) кислота НCl 0,2N розчин

Посуд та обладнання

1.Ваги аналітичні

2.Пробірки сухі та хімічно чисті

3.Піпетки на 1, 2 і 5 мл

4.Ультратермостат на 30^оС

5.Лійки Ø 40-50 мм

6.Фільтрувальний папір

7.Фотоелектроколориметр

8.Кювети з товщиною стінки 10 мм

Визначення білку за методом Лоурі

Метод оснований на реакції білків з реактивом Фоліна, який дає синє забарвлення. Метод використовують для визначення в розчинах білку з концентрацією від 10 до 100 мкг.

Хід роботи

До 0,4 мл розчину білку додають 2 мл розчину С. Суміш перемішують і через 10 хв приливають до неї 0,2 мл робочого розчину Фоліна. Інтенсивність забарвлення визначають на фотоелектроколориметрі з червоним світлофільтром (або на спектрофотометрі при довжині хвилі 750 нм) через 30 хв. Кількість білка знаходять по калібрувальному графіку.

Побудова калібрувального графіка

Для побудови графіка 100 мг чистого білку (сироваткового  - глобуліну, або кристалічного альбуміну і т.п.) розчиняють в 100 мл 0,1 н. розчину NaOH (1мл приготовленого розчину містить 1 мг білку).

Приготовлений розчин розливаємо в 10 мірних колб на 100 мл, починаючи з 1 і закінчуючи 10 мл. Розчини в колбах доводять дистильованою водою до мітки і перемішують. З кожної колби відбирають по 0,4 мл приготовлених розчинів і додаємо по2 мл розчину С. Суміш перемішують і через 10 хв. додають 0,2 мл робочого розчину Фоліна і колориметрують.

По одержаним даним будують калібрувальний графік

Реактиви.

1.Натрій вуглекислий Na₂CO₃, 2%-ний розчин – розчин А.

2.Мідь сірчано кисла CuSO₄∙5H₂O 0,3%-ний розчин – розчин В.

3.Робочий розчин – розчин С

4.Основний реактив Фоліна.

5.Робочий реактив Фоліна – розчин Д