Визначення протеолітичної активності протеази (модифікований метод Ансона).

Метод засновано на гідролізі білку казеіната натрію препаратом фермента, який знаходиться в досліджуваному розчині з подальшою інактивацією фермента і осадженням негідролізованого білку трихлооцтовою кислотою (ТХО)

Протеолітична активність характеризує здатність ферментів каталізувати розщеплення білку до пептидів і амінокислот і виражається числом одиниць протеази в 1 г препарату.

За одиницю протеолітичної активності (ПС) приймають таку кількість ферменту, котра за 1 хв при температурі 30⁰С перетворює в не осаджений трихлооцтовою кислотою стан казеінату натрію в кількості, яка відповідає 1 мкмолю тирозину (1 мкмоль тирозину дорівнює 0,181мг).

Активність грибних і бактеріальних протеіназ визначають при наступних значеннях рН:

2,5±0,2 – кисла протеіназа

3,5±0,2 – слабокисла протеіназа

7,2±0,2 – нейтральна протеіназа

9,5±0,2 – лужна протеіназа

Хід роботи

Для визначення ферментативної протеолітичної активності проводять ферментативний гідроліз при 1% концентрації білку-субстрату в розчині (після змішування розчину субстрату і розчину ферменту). Кількість взятого ферменту повинна бути так розрахована, щоб був присутній великій надлишок субстрату і щоб зміна величини оптичної щільності лежали в межах 0,07-0,85 для кислих протеаз і 0,20-0,60 – для нейтральних і лужних протеаз.

В дві пробірки наливають по 2мл субстрату і установлюють їх в ультратермостат з температурою 30⁰С. Приблизно через 10хв в кожну пробірку додають по 2мл розчину ферменту, пробірку струшують і залишають в ультратермостаті для гідролізу на 10хв при температурі 30⁰С. Через 10хв в обидві пробірки додають по 4мл 0,3 М розчину ТХО Cl₃CCOOH, щоб перервати ферментативну реакцію і осадити білок та високомолекулярні продукти гідролізу. Суміш швидко перемішують і для забезпечення повного осадження витримують при температурі 30⁰С ще 20хв. Потім фільтрують через маленькі лійки з паперовими фільтрами в сухі пробірки. Фільтрат повинен бути зовсім прозорим. Відбирають в чисті пробірки по 1мл фільтрату, додають по 5мл 0,5 М розчину карбонату натрію Na₂CO₃, перемішують і швидко додають при безперервному перемішуванні по 1мл робочого розчину реактиву Фоліна і витримують протягом 20хв. Після реакції розчини приймають голубе забарвлення, інтенсивність якого вимірюють на фотоелектроколориметрі.

Одночасно готують контрольну пробу, приливаючи реактиви в зворотній послідовності: до 2мл ферментного розчину того ж розведення, як і в основному аналізі додають 4мл ТХО Cl₃CCOOH, витримують в ультратермостаті при 30⁰С 10хв, а потім вносять 2мл субстрату. Через 20хв розчин фільтрують, відбирають в суху пробірку 1мл фільтрату, а потім при перемішуванні вносять 5мл 0,5 М розчину карбонату натрію Na₂CO₃ та 1мл робочого розчину реактива Фоліна. Контрольна проба повинна мати слабке голубе забарвлення.

Оптичну густину аналізуємого розчину визначають по відношенню до контрольної проби на фотоелектроколориметрі при довжина хвилі 656-670 нм в кюветах товщиною поглинаючої стінки світло шару 10мм.