Окраска по методу Циля - Нельсена

Методика:

1. нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 мин);

2. бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% серной кислотой или солянокислым спиртом (2-4 с);

3. тщательно промыть водой;

4. окрасить леффлеровской синькой (3-5 мин);

5. промыть водой и высушить.

Кислотоустойчивые бактерии в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а остальные - синими.

Окраска спор

Некоторые виды бактерий образуют внутриклеточные (эндогенные) споры. В отличие от вегетативной клетки они обладают меньшим количеством свободной воды, а также высоким содержанием липидов и кальция.

Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за малой проницаемости оболочки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микробной клетки, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раствора краски с подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску.

Окраска спор по методу Ожешко

Методика:

1) нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 мин);

2) слить кислоту, промыть водой, высушить;

3) зафиксировать в пламени

4) окрасить по методу Циля - Нельсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы - в синий).

Часто для окраски спор используют только метод Циля - Нельсена.

Окраска включения волютина

Волютин - производное нуклеиновой кислоты - играет роль запасного питательного вещества. Среди включений запасного характера - жиры, гликоген, волютин, который занимает особое место. На основании его присутствия и особого расположения в клетке ставят предварительный диагноз методом бактериоскопии при подозрении на дифтерию. Наиболее демонстративные результаты удается получить при окраске зерен волютина по методу Нейссера.

Методика:

1) окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 мин);

2) промыть;

3) окрасить раствором Люголя (30 с);

4) слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 мин);

5) промыть препарат и высушить.

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, воспринимает щелочной краситель везувин и приобретает желтый цвет. Зерна волютина, прочно фиксировавшие ацетат цинка, - темно-синие, почти черные.

Обнаружение капсул у бактерий

Некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки, его называют капсулой. В состав капсул входят, главным образом, полисахариды (пневмококк), но у некоторых они содержат и полипептиды (сибиреязвенная палочка). Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для их обнаружения применяют негативную окраску. Все перечисленные методы относятся к позитивным, т.к. при их использовании окрашиваются микробные клетки. При негативных способах краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне.