Техника приготовления некоторых полуфабрикатов и питательных сред общего назначения
Мясной настой (мясная вода). Для приготовления настоя употребляют свежее говяжье мясо. Мышцы отделяют от костей, освобождают от жира и соединительной ткани, измельчают в мясорубке, заливают водой из расчета 2 л воды на 1 кг мясного фарша и оставляют на 18-20 ч при температуре 8-10°С. Затем настой вместе с мясом нагревают до кипения и кипятят в течение 30 мин. Удаляют всплывающий на поверхность жир, доливают дистиллированной водой до первоначального объема, отделяют настой от фарша через сито или марлю, фильтруют через ватный фильтр. Настой, не стерилизуя, употребляют для приготовления бульона или для хранения разливают в бутылки и стерилизуют при 120°С в течение 30 мин. В мясном настое содержится азота общего - 2,00 г/л, азота аминного - 0,6 г/л.
Гидролизат (перевар) по Хоттингеру. Мясо (1 кг) нарезают кусочками примерно по 1-2 см опускают небольшими порциями в кастрюлю с двойным количеством (по отношению к мясу) кипящей воды, кипятят 15-20 мин, пока мясо не станет серым, затем извлекают из жидкости шумовкой и пропускают через мясорубку, в оставшейся жидкости устанавливают рН-8,0, опускают в нее фарш и охлаждают в кастрюле до 40°С, после чего добавляют поджелудочную железу (очищенную от жира, соединительной ткани и дважды пропущенную через мясорубку) в количестве 10% к взятой жидкости (на 1 л жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в количестве 0,5 г) и выше в зависимости от его активности. Хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают через 30 мин (отсутствие сдвига реакции в кислую сторону указывает на недоброкачественность фермента). После установления рН смесь переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой с таким расчетом, чтобы 1/3 бутылки оставалась свободной. Добавляют 1-3% хлороформа (в холодное время года меньше, чем в теплое), закрывают бутыль пробкой и несколько раз встряхивают, после чего на минуту вынимают пробку для освобождения от избытка паров хлороформа. Через 1-2 ч после добавления фермента опять проверяют реакцию и устанавливают рН - 7,4-7,6. Смесь оставляют на 10-16 дней при комнатной температуре или 7-10 дней при 37°С. Первые 3-4 дня переваривания ежедневно проверяют и исправляют реакцию, а также встряхивают перевар не менее 3 раз в сутки. В дальнейшем проверку проводить нецелесообразно, а встряхивать можно реже. За 1-2 дня до окончания переваривания прекращают встряхивание, чтобы перевар отстоялся. Окончание переваривания характеризуется следующими признаками: на дне бутылки собирается пылевидный осадок. жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет, реакция на триптофан с бромной водой положительная (максимальное содержание триптофана 2,00-3,00 г/л), в гидролизате содержится 11,00-12,00 г/л азота. 7,00-9,00 г/л аминного азота. По окончании гидролиза перевар (фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, разливают в бутылки, колбы и стерилизуют при 120°С в течение 30 мин для хранения впрок.
Мясо-пептонный бульон. К мясному настою добавляют 1% пептона, 0,5% химически чистого натрия хлорида. Смесь кипятят при постоянном помешивании 15-20 мин, устанавливают рН - 7,2-7.4, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и пробирки. стерилизуют при 120°С в течение 20 мин. Содержание аминного азота в готовой среде 1,2 г/л.
Бульон Хоттингера. К 100-200 мл перевара Хоттингера добавляют 800-900 мл дистиллированной воды (в зависимости от концентрации аминного азота в переваре), прибавляют 5 г хлористого натрия, 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого натрия. Устанавливают рН - 7,4-7,6. Разливают в колбы или пробирки. Стерилизуют при 120°С в течение 20 мин. Содержание аминного азота в готовой среде- 1.00-1.20 г/л.
Мясо-пептонный агар. К 1 л мясо-пептонного бульона прибавляют 15-25 г (1,5-2,5%) мелко нарезанного агар-агара. Кипятят, перемешивая. до полного растворения агара. Устанавливают рН - 7,4-7,6. Фильтруют, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при 120°С в течение 20 мни.
Агар Хоттингера. К 1 л бульона Хоттингера прибавляют 15-25 г (1,5-2,5%) мелко нарезанного агар-агара. Кипятят, перемешивая, до полного растворения агара. Устанавливают рН - 7,4-7,6. Фильтруют, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при 120°С в течение 20 мин.
Контроль питательных сред по биологическим и физико-химическим показателям
Бактериологическому контролю подлежат все серии питательных сред промышленного производства и все партии сред, приготовленных в лаборатории. В качестве тест-культур используют типовые или местные штаммы бактерий, типичные по всем признакам, в гладкой форме. Тест-культуры хранят в лиофилизированном состоянии или в столбике полужидкого питательного агара, высевают перед использованием на питательный агар и для получения необходимых посевных доз разводят десятикратно стерильным 0,85% раствором натрия хлорида исходную взвесь культуры концентрации 1 млрд бактерий в 1 мл.
Определяют следующие биологические показатели питательной среды:
Чувствительность (ростовую).
Чувствительность питательной среды определяют по минимальному количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, обеспечивающих появление роста колоний на среде, или по другому варианту - максимальному десятикратному разведению культуры из исходной концентрации 10 ед. мутности (по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича), обеспечивающему появление роста бактерий на всех засеянных чашках Петри.
Ингибирующие свойства,
Ингибирующие свойства среды оценивают как степень подавления прочей микрофлоры по величине посевной дозы в КОЕ, полностью подавляемой на среде, или по отношению количества выросших колоний бактерий к расчетному количеству посеянных бактерий.
Дифференцирующие свойства.
Дифференцирующие свойства сред изучают путем посева испытуемых видов бактерий в смеси с ассоциантами с последующим определением четкости дифференциации колоний искомых бактерий от ассоциантов. Специфичность дифференцирующего свойства среды выявляют по отсутствию этого свойства у прочих видов бактерий, кроме искомых.
Скорость роста бактерий на среде.
Скорость роста бактерий на среде устанавливают по минимальному времени инкубации посевов (в часах), в течение которого обеспечивается четкий, видимый невооруженным глазом, рост культуры (для селективных сред) или формирование колоний с типичными дифференциальными признаками.
Воспроизводимость.
Воспроизводимость биологических показателей сред оценивают по частоте одинаковых результатов (в %) при повторных использованиях сред с теми же штаммами бактерий.
Контроль различных питательных сред по биологическим показателям проводят по конкретным методикам и нормативам руководствуясь официальными документами.
Физико-химический контроль питательных сред в практике лабораторий осуществляют по показателям рН, гН, содержанию аминного азота. Прочие показатели изучают обычно при промышленном производстве питательных сред. Для определения рН и гН сред используют рН - метры, индикаторные бумажки, а также различные химические индикаторы рН и гН вносимые в питательные среды. Содержание аминного азота изучают методом рН-метрического формолового титрования питательных сред по ГОСТу.
Посев инокулята
Посев инокулята является первым этапом исследования. В практической работе для получения "чистых культур" микроорганизмов используют одну из модификаций метода высева на чашки со средой. Эти методы основаны на том, что отдельные микроорганизмы иммобилизуются на поверхности или в глубине питательной среды, в которую добавлен агар или какое-нибудь другое гелеобразующее вещество.
1. Посев петлей: посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки, избыток снимают, проколов петлей агар, а оставшийся материал рассеивают параллельными штрихами по стерильной поверхности среды. Это наиболее распространенный способ посева, его техника показана на рисунке 4.
2. Посев шпателем: материал наносят на поверхность среды петлей или пипеткой, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его по всей поверхности агара. При этом левой рукой придерживают слегка приоткрытую крышку и одновременно вращают чашку. После посева металлический шпатель прокаливают в пламени горелки, а стеклянный помещают в дезинфицирующий раствор.
3. Посев тампоном: тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.
4. Посев на секторы: дно чашки расчерчивают на секторы, посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, чтобы штрихи с одного не переходили на другой.
5. Посев газоном: 1 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура или взвесь микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой на поверхность среды и тщательно распределяют жидкость по всей ее поверхности. Избыток материала отсасывают пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор.
После посева чашки закрывают и переворачивают их вверх дном. Надписи на чашках делают со стороны дна, а на пробирках - в верхней части.
При посеве инокулята из пробирки в пробирку обе пробирки (с посевным материалом и со средой) держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы края пробирок были на одном уровне. Бактериальную петлю держат как писчее перо. Петлю вертикально прокаливают в пламени горелки. Пробки из пробирок вынимают правой рукой, зажимая их между мизинцем и ладонью. Вынув пробки, края пробирок обжигают в пламени горелок. Прокаленную петлю вводят через пламя горелки в пробирку с посевным материалом, охлаждают и небольшое количество посевного материала осторожно переносят в пробирку со средой.
При посеве на жидкую среду петлю слегка погружают в жидкость и растирают посевной материал на стенке пробирки, после чего смывают его средой.
Для посева жидкого материала можно использовать стерильные пипетки (пастеровские или градуированные).
При посеве на скошенный агар материал наносят штрихообразными движениями снизу вверх, начиная с конденсационной воды, а если агар или желатин разлит в пробирки столбиком, то посев производят уколом, прокалывая петлей с посевным материалом столбик до дна.
После посева петлю извлекают из пробирки, пробирку закрывают, предварительно проведя ее края через пламя горелки. Петлю прокаливают.
При выделении чистых культур аэробов можно использовать не только методы, основанные на механическом разобщении бактерий, но и методы, основанные на различиях бактерий по биологическим свойствам. Так, например, некоторые подвижные бактерии могут быстро распространяться по слегка влажной поверхности питательной среды, благодаря этому можно очистить их от неподвижных видов микробов.
Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций полезно включить в среду вещества, избирательно подавляющие рост тех или иных микробов. Например, добавление полиеновых антибиотиков (нистатина) в среду используется для очистки бактериальных культур, сильно загрязненных грибами.
Посевы инкубируются в термостате 18-24 ч. В течение этого времени из отдельных микробных клеток формируются изолированные колонии.
Колония - это популяция микробных клеток одного вида, сформировавшаяся в результате деления одной микробной клетки в условиях культивирования на плотной питательной среде при оптимальной температуре.