5

При выполнении клинико-биохимических исследований фотометрия чаще всего проводится в области длин волн 400—700 нм. Особенно широко распространена регистрация содержания НАД • Н и НАД • ФН по поглощению света с длиной волны 340 нм, т. е. в ближнем ультрафиолетовом диапазоне. Для фотометрических измерений в видимой и ближней инфракрасной области пригодны кюветы из обычного стекла; для ближней ультрафиолетовой области нужны кюветы из специальных сортов стекла — так называемого увиолевого стекла, в коротковолновой ультрафиолетовой области пригодны только кюветы из кварца и сапфира.

При проведении фотометрических исследований оценку результатов чаще всего производят тремя способами:

- по конечной точке (измерение в конечной точке);

- по фиксированному времени (примером может служить прямой псевдокинетический метод Яффе);

- кинетически (кинетическое измерение).

Определение по конечной точке состоит в учете образования продукта за некоторое (порой относительно длительное) время инкубации. Расчет результатов производится по стандарту.

Способ исследования по методологии «фиксированного времени» основан на применении спектрофотометров (типа «СОЛАР») или фотометров с обычными светофильтрами, оснащенных термостатирующим кюветным отделением, и установлении количества нарабатываемого (расходуемого) продукта за определенный промежуток времени с последующим расчетом концентрации (активности) по стандарту.

Кинетический метод исследования, как правило, является ферментативным. Выполняется при условии выделения строго монохроматизированного светового потока (благодаря применению фотометров с интерференционными светофильтрами или спектрофотометров) с использованием термостатируемой кюве­ты (при температуре 25°С, 30°С и чаще всего 37°С). После старта реакции через определенный интервал времени (например, 60 с троекратно) находят изменение оптической плотности. Из полученных значений рассчитывают среднюю величину изменения абсорбции (Д) и с использованием определенных (соответствующих температуре инкубации) коэффициентов производят расчет с выражением результатов в ЕД/л (кат/л) и их производных.

Методы второй и особенно третьей группы обладают рядом существенных преимуществ перед одноточечными (конечной точки): их выполнение занимает мало времени, они не связаны с применением агрессивных жидкостей, точны, позволяют получать достоверные результаты (в особенности при исследовании активности ферментов, когда к тому же не требуется разводить в определенное количество раз сыворотку крови для предотвращения эффекта «разбавления» при гиперферментемии).

Подавляющее их большинство базируется на использовании оптического теста Варбурга, состоящего в ферментативном (с участием лактатдегидрогеназы) превращении НАД • Н в НАД (и наоборот), существенно отличающихся величиной оптической плотности при длинах волн 340 нм, 334 нм, 365 нм. Основывающийся на этом оптическом эффекте принцип используется для определения содержания пировиноградной (ПВК) и молочной (МК) кислот ферментативным методом, в котором под влиянием ЛДГ катализируются прямая и обратная реакция их взаимопревращения.

При определении активности многих ферментов, содержания субстратов, метаболитов, некоторых электролитов ход энзиматических процессов в реакционной смеси «замыкается» на превращении ПВК в МК (и наоборот) с участием лактатдегидрогеназы и НАД • Н (НАД). Так, в методике определения активности аланинаминотрансферазы используются следующие реакции:

1) Алании + а-кетоглутаровая к-та -> ПВК + Глутаминовая кислота

НАД-Н₂

2) ПВК-------■ МК + НАД-

ЛДГ

Наряду с ЛДГ используется также малатдегидрогеназа (МДГ).

Кинетическим методом, базирующимся на оптическом тесте Варбурга, можно исследовать активность более 100 ферментов.

Чтобы избежать необходимости измерять оптическую плотность растворов всегда в ультрафиолетовой области, применяют колориметрические методы. Образующийся в результате ферментативной реакции восстановленный НАД — НАД • Н₂ и НАДФ • Н₂ превращает специальное индикаторное вещество (например, формазан) в окрашенный продукт, количество которого легко определять фотометрически в видимой области спектра. Примером этого может служить определение активности лактатдегидрогеназы.

Еще более удобны прямые колориметрические методы с использованием тио-НАД (ТНАД- Н) и тио-НАДФ (ТНАДФ- Н). При восстановлении этих окисленных форм производные никотинамидадениндинуклеотида окрашиваются в желтый цвет и могут быть определены при длине волны 398 нм.

Флюориметрические методы в 100—1000 раз более чувствительные, чем аналогичные, базирующиеся на абсорбционном фотометрическом анализе. Они обычно основаны на собственной флюоресценции пиридинкоферментов (НАД-содержа-щих кофакторов реакции). Благодаря использованию флюоресцентной редоксиндикаторной цепи чувствительность этих методов становится гораздо выше.

НАД ФМС • Н Резурцин (бесцветный)

II — II — II

НАД • Нг ФМС Резоруфин (окрашенный)

Полученный и ходе этой реакции резоруфин флюоресцирует в 100 раз сильнее НАД- Н₂-

При реакции с бактериальной люциферазой флюоресценция продукта в 1000 раз превышает флюоресценцию НАД • Н₂.

В последнее время для определения активности НАД(Ф)-зависимых оксидоредуктаз все более широко применяют биолюминесцентный метод, основанный на использовании биферментной системы НАД(Ф) • Н: флавинмононуклеотид (ФМН)-оксидоредуктаза-люцифераза из светящихся бактерий. Реакция светоизлучения протекает в результате ферментативного окисления НАД(Ф) • Н в цепи последовательных реакций.

НАД(Ф) • Н + ФМНРВДУ™³? НАД(Ф) + ФМН • Н;

ФМН • Н + альдегид + О₂ ^люциФ^еР^аз,^а ФМН +кислота +Н₂О + Ьу.

Данный метод позволяет абсолютно специфично и с высокой чувствительностью определять восстановленные пиридиннуклеотиды (НАД • Н₂, НАДФ • Н₂ ) и ферменты, катализирующие реакции с их участием.

Каталические методы могут быть осуществлены и без использования пиридинкоферментов (НАД, НАД • Н₂): примером может служить определение активности щелочной и кислой фосфатаз, холинэстеразы, гамма-глутамилтранспептидазы. В большинстве своем они реализуются путем фотометрии раствора в видимой области спектра.

Выбор светофильтра

Если возникают затруднения в выборе наиболее подходящего для производства фотометрических определений светофильтра, раствор наливают в кювету и измеряют его абсорбцию при всех имеющихся в наборе светофильтрах. Руководствуясь описанными правилами, строят кривую, откладывая на горизонтальной оси длины волн (в нм), соответствующие максимальному коэффициенту пропускания светофильтров (они указаны в паспорте прибора), а на вертикальной оси — найденные при их исполь­зовании значения оптической плотности. Отмечают на графике участок линии, отражающий наибольшую величину абсорбции и располагающийся примерно параллельно горизонтальной оси. Ориентируясь на него и выбирают нужный светофильтр.

Из двух близких по области пропускания светофильтров выбирают тот, при работе с которым чувствительность прибора (оцениваемая по максимальному значению А) оказывается наибольшей. Подбор светофильтра может быть облегчен использованием табл. 3.

Из табл. 3, в частности, следует, что при фотометрии раствора сине-зеленого цвета следует применять красный светофильтр.

Табл. 3. Таблица подбора светофильтров

Окраска исследуе- Приблизитель- Окраска подходяще- Приблизитель­ного раствора ная область го светофильтра ная область

длин волн, нм длин волн, нм

Фиолетовая 400—450 Желто-зеленая 560—575

Синяя 450-480 Желтая 575-590

Зелено-синяя 480—490 Оранжевая 590—625

Сине-зеленая 490—500 Красная 625—750

Зеленая 500—560 Пурпурная —

Желто-зеленая 560—575 Фиолетовая 400—450

Желтая 575-590 Синяя 450-480

Оранжевая 590—625 Желто-зеленая 480—490

Красная 625—750 Сине-зеленая 490—500

«СУХАЯ» ХИМИЯ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

В настоящее время в клинико-лабораторной диагностике наряду с традиционной, связанной с применением для определения физиологических и патологических компонентов мочи и крови жидких реагентов, все шире используется методология «сухой» химии. Она реализуется с применением специальных полосок, реа-гентные зоны которых содержат сухие реактивы (ферменты и/или неферменты), способные воздействовать на определенные метаболиты биологических жидкостей с изменением окраски индикатор­ной зоны.

Индикаторные тест-полоски применяются для полуколичественного и количественного определения диагностически значимых компонентов мочи, крови и других биологических жидкостей. Их использование незаменимо для неотложного анализа (выполняемого в присутствии больного: в приемном отделении, в больничной палате или дома), для профилактики и раннего распознавания заболеваний, а также «первой линии контакта врача с пациентом» в клинических лабораториях лечебно-профилактических учреждений, непосредственно у постели больного дома и в стационаре, службе скорой помощи, для массовых обследова­ний населения с целью выявления некоторых заболеваний, в том числе самими пациентами или их родственниками в домашних условиях.

6

му, построенную на базе 7 основных единиц. Ими являются: метр (м) — единица обозначения дайны, секунда (с) — времени, ки­лограмм (кг) — массы, ампер (А) — силы тока, кельвин (К) — температуры, кандела (кд) — силы света и моль (моль) — коли­чества вещества. Наряду с ними применяются две дополнительные единицы: радиан (рад) — для плоского угла и стерадиан — для те­лесного. Оставлены и вспомогательные единицы, которыми поль­зуются наравне с основными. Таковы единицы времени: минута (мин), час (ч), сутки (сут); температуры: градус Цельсия (было — практический градус; он имеет то же численное значение, что и градус Кельвина); объема: литр (л), массы: тонна (т).

Основные единицы используются для образования производ­ных единиц, получаемых при определенном сочетании основных. Среди последних в клинической лабораторной диагностике при­меняются главным образом четыре: м, кг, с, моль.

Производные единицы служат для обозначения молярной массы (кг/моль), концентрации количества вещества, или моляр­ной концентрации (молярность компонента) — моль/м³, моляр­ной концентрации — моль/кг, активности фермента — моль/с (обозначаемой «катал», сокращенно — «кат»), скорости химичес­кой реакции — моль/с • м³), молярного расхода — моль/с, массо­вой концентрации — кг/м³, массового отношения — кг/кг, мо­лярного отношения — моль/моль, объемного отношения —

М³/М³.

В связи с тем что в течение многих десятилетий в медицине для обозначения объема использовалось понятие «литр» (и доль­ные от него значения), а времени — «минута», «сутки», для удоб­ства пользования системой указанные единицы были включены в число наиболее употребительных, или самостоятельных. Ими явились: кг — для обозначения массы; моль — для обозначения количества вещества; ч, с, мин, сут — для обозначения времени; л — для обозначения объема. Сочетание этих единиц дало следу­ющие производные: кг/л — плотность и массовая концентрация; моль/л — молярная концентрация; л/л — объемное отношение; моль/моль — молярное отношение; л/с — объемный расход (кли­ренс, очищение); моль/с • л), или кат/л, — скорость химической реакции (здесь кат — каталитическая активность, т. е. моль/с, а кат/л — концентрация каталитической активности, или каталитическая концентрация). Обозначать ферментативную активность в международных единицах (МЕ) — мкмоль/мин • л) — не рекомендуется, вместо МЕ применяется нкат/л: 1 МЕ соответствует 16,67 нкат/л, или 16,67 нмоль/с • л). Поскольку 1 ммоль/ч • л) равен 278 нмоль/с • л), для преобразования первой во вторую (и наоборот) используют коэффициенты пересчета 278 и 0,0036 (1/278).

2

ВЗЯТИЕ, ХРАНЕНИЕ И ДОСТАВКА В ЛАБОРАТОРИЮ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Наиболее распространенным материалом для клинико-лабораторных исследований являются кровь, моча и некоторые другие биологические жидкости.

Кровь рекомендуется брать утром (между 8 и 10 часами), до физической нагрузки и проведения диагностических процедур. За сутки до взятия крови прием пищи может быть обычным (следует исключить употребление алкоголя). Практически здоровым лицам и амбулаторным больным накануне утра (после 2 ч ночи) запрещается курение, прием пищи и жидкости (разрешается выпить стакан воды между 22 и 5 часами). Если для выполнения подавляющего большинства тестов взятие крови призводят после 8_12 ч голодания, то для определения триацилглицеринов требуется выдержать 10—12-часовой интервал после приема пищи. Непосредственно перед взятием крови пациенту необходимо предоставить отдых в положении сидя в течение не менее 15—30 мин (в процессе взятия крови рука пациента располагается под углом 45°). У больных, которым предписан строгий постельный режим, взятие крови осуществляют между 7 и 9 часами; при этом рука пациента, лежащего в постели, должна находиться в горизонтальном положении.

Следует иметь в виду, что при пребывании человека в течение нескольких часов в горизонтальном положении объем плазмы в русле крови оказывается на 10—15% больше, чем у пациента, сохраняющего обычный двигательный режим. Отсюда концентрация веществ в крови человека, лежавшего в течение более часа, всегда ниже, чем у него же после ходьбы.

Положение тела оказывает влияние на концентрацию общего белка, альбумина, креатина, холестерола, триацилглицеринрв, активность щелочной фосфатазы, аспартатаминотрансферазы и других компонентов плазмы. Содержание этих веществ и активность ферментов значительно повышаются при переходе больно­го в вертикальное положение и, наоборот, уменьшаются — в горизонтальном. Максимальное изменение характерно для уровня общего белка, активности ферментов (11%) и содержания кальция (3-4%).

При взятии крови путем венепункции время сдавления сосудов жгутом по возможности должно быть минимальным. Больному не следует сжимать и разжимать пальцы руки, поскольку это вызывает местный стаз и гипоксию, а также сдвиги в распределении некоторых веществ (холестерола, калия, натрия, кальция и др.) между форменными элементами крови и ее жидкой частью.

Если нет возможности пользоваться одноразовым шприцем, то обычный, многоразовый, нужно кипятить только в дистиллированной воде, нельзя промывать его изотоническим раствором натрия хлорида. Во избежание гемолиза кровь следует брать сухим шприцем, сухой иглой (одноразового пользования), в сухую пробирку в стерильных условиях. Если набранная в шприц кровь переносится в пробирку, то эту процедуру осуществляют медленно (для предотвращения вспенивания крови). При исследовании системы гемостаза к процессу взятия крови предъявляют ряд дополнительных требований. Так, рекомендуется использовать иглу с широким просветом, лучше без шприца (его применяют для взятия крови у детей, у взрослых больных с явлениями гипотензии, а также находящихся в терминальном состоянии; при этом шприц должен быть полиэтиленовым или силиконированным). Дезинфекцию кожи осуществляют обработкой соответствующего ее участка над местом прокола (обычно в локтевом сгибе) 70% этиловым спиртом. Поскольку при прохождении иглы через кожу в просвет иглы перемещаются тканевая жидкость и фрагменты тканей, могущие в дальнейшем существенно повлиять на коагулологические тесты, первые (после наложения жгута и прокола вены иглой) 0,5—1 мл (особенно выступившие вначале 5—6 капель) вытекающей крови нельзя использовать для коагулограммы. Однако эту порцию крови можно применять для всех других биохимических исследований (Е.П. Иванов, 1983). Чтобы исключить влияние на коагуляцию последствий венозного застоя крови, рекомендуют (Е.П. Иванов, 1983) в процессе ее взятия на непродолжительное время (2—3 с) расслабить жгут. Кровь должна стекать по стенке пробирки. Если требуется получить плазму, в пробирку заранее вливают или всыпают соответствующий антикоагулянт (лимоннокислый натрий, щавелевокислый натрий или калий и др.) для предохранения крови от свертывания. Кровь с антикоагулянтом осторожно перемешивают (без вспенивания), закрывают пробирку кусочком полиэтиленовой пленки и оставляют в штативе на 20—25 мин. Интенсивное встряхивание вызывает гемолиз эритроцитов, что искажает многие параметры коагулограммы. Поэтому плазма с признаками гемолиза не пригодна для данного исследования.

При изучении системы гемостаза кровь обычно стабилизируют раствором лимоннокислого натрия (38 г/л), поскольку в цитратной крови (плазме) лучше сохраняются лабильные факторы свертывания и тромбоциты (А.Я. Смоляницхий, 1987). Основные сведения о наиболее часто применяемых антикоагулянтах приведены в табл. 5.

Для силиконирования стеклянной посуды применяют силикон (дихлорметилсилан), желательно всегда одной и той же марки (лучше всего ПМС-500), поскольку силикон разных серий по-разному смачивает покрываемый материал.

Силикон разводят эфиром, растворяя 1 часть его в 19 частях диэтилового (медицинского) эфира. После обработки пробирок, пипеток, игл и шприцев раствором силикона лабораторную посуду 5—10 раз ополаскивают эфиром (выливаемый эфир собирают и используют для промывания следующих партий посуды) и сушат 2—3 ч при температуре 100—150°С.

При лизисе сосредоточенных в сгустке эритроцитов находящиеся в них ферменты переходят в сыворотку крови. Этим объясняется, в частности, более высокая активность энзимов (лактатдегидрогеназы, аланин-, аспартатаминотрансферазы, фруктозодифосфатальдолазы, кислой фосфатазы, аргиназы, фосфогексоизомеразы и других ферментов, содержащихся в значительных количествах в тромбоцитах и эритроцитах и освобождающихся из них при свертывании крови) в сыворотке, чем в плазме крови. Поэтому для оценки активности перечисленных ферментов рекомендуется пользоваться плазмой.

Табл. 5. Приготовление растворов наиболее часто применяемых антикоагулянтов и противопоказания к их использованию в лабораторной практике

Антикоагулянт	Приготовление растворов и их использование	Лабораторные тесты, определению которых мешает применяемый антикоагулянт
1	2	3

Натрия оксалат №2С2О4 тг= 134,00

Аммония оксалат

) тг= 142,10

Тринатрийцитрат ИСНО Н

тг= 294,12

Этилендиамин-тетрауксусная кис­лота или ее динат-риевая соль: ЭДТА-натрий (синонимы: селектон Б, хелатон, версен, трилон Б)

300 мг щавелевокислого нат­рия растворяют в 20 мл (би) дистиллированной воды. Используют 0,1 мл раствора на 2 мл крови. Для стабили­зации крови при приготов­лении плазмы без фактора свертывания I и для приго­товления бариевосульфатной плазмы применяют 0,1 моль/л раствора (13,4 г/л) натрия ок-салата. Добавляют из расчета 0,1 мл на 1 мл крови Примечание. Натрия ок­салат или калия оксалат иног­да вносят в пробирку на кончи­ке скальпеля (примерно 0,01 г)

Раствор (10 г/л) готовят на дис­тиллированной воде, кипятят, фильтруют, хранят при 4°С

Наиболее часто используют водный раствор концентрации 38 г/л (с учетом навески кристаллизационной воды). Хранят в стеклянной бутылке с притертой пробкой, лучше в домашнем рефрижераторе при 4°С. Обновляют каждые 10—14 сут. 1 объем раствора лимоннокислого натрия добавляют к 9 объемам крови

300 мг натрия этилендиамин-тетраацетата (динатриевая соль, дигидрат) растворяют в 20 мл (би)дистиллированной воды. Если ЭДТА растворяется медленно, с трудом, можно к порции дистиллированной воды добавить щелочь (до рН 8,4—8,6), а затем пу-

Электролиты (К, Ш, Са), щелоч­ная фосфатаза, альфа-амилаза, рН крови

Аммиак, щелочная фосфатаза, альфа-амилаза, рН крови

Альфа-амилаза крови

Электролиты (К, №, Са), остаточный азот

131

Продолжение табл. 5

Гепарин

(с активностью

1000 ЕД в 1 мл)

Натрия гепаринат или калия гепаринат

Лития гепаринат

Аммония гепаринат

Цитратно-глюкоз-ная смесь (приме­няется для исследо­вания метаболичес­ких, ферментатив­ных процессов в эритроцитах, а также для опре­деления активности кислой фосфатазы)

тем внесения кислоты восста­новить прежнюю нейтральную реакцию раствора. На 2 мл крови берут 0,1 мл раствора, содержащего 1,5 мг антико­агулянта. Допускается всыпать ЭДТА в пробирку из расчета 1 мг порошка на 1 мл крови. ЭДТА-натрий в отличие от дру­гих антикоагулянтов не нару­шает морфологическую струк­туру эритроцитов (не «смор­щивает» их). Связывая наряду с ионами кальция и магния ионы металлов переменной валентности, ЭДТА тем самым предотвращает интенсифика­цию т У11го перекисного окисления липидов

0,01 мл используют на 5 мл крови или каплю гепарина — на весь объем пробирки 60 мг гепарината растворяют в 20 мл (би)дистиллирован-ной воды. Берут 0,1 мл раствора на 2 мл крови Тоже

Тоже

4,7 г лимонной кислоты, 16 г трехзамещенного натрия цитрата, 25 г глю­козы растворяют в 1000 мл (би)дистиллированной воды. Берут 1 часть раст­вора на 4 части крови. (Приведенные количест­венные соотношения могут быть уменьшены соответственно в 10 или другое количество раз)

Электролиты (К, N3)

Щелочная фосфатаза

Аммиак

Электролиты, глюкоза

Примечание. При проведении коагулологических исследова­ний рекомендуется использовать пластмассовую или сшшконированную стеклянную посуду.

Для получения сыворотки антикоагулянт не добавляют. Доставленные в лабораторию пробирки закрывают ватной пробкой и помещают на 10— 15 мин в термостат для прогревания при температуре 37°С. Затем осторожно проводят проволокой или стеклянной палочкой по внутренней стенке пробирки, чтобы ускорить получение сыворотки. Удерживая сгусток стеклянной палочкой, сыворотку сливают в центрифужную пробирку и центрифугируют. Пробирку с кровью допускается выдерживать при комнатной температуре (20—26°С) в течение 1—1,5 ч после взятия, сгусток отделяют от стенки пробирки пластиковой палочкой.

Если сыворотку требуется получить немедленно, то кровь центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин на клинической центрифуге типа ОПН-3 (800 g) сразу же после ее взятия. Полученную сыворотку переносят в центрифужную пробирку и вновь подвергают центрифугированию в течение 10 мин; затем разливают в несколько пробирок для выполнения отдельных исследований.

Считается, что объем выделяемой сыворотки составляет примерно 1/3 взятого объема крови (при некоторых патологических состояниях сыворотки получается намного меньше). Сыворотку (дефибринированную плазму) желательно использовать для лабораторных исследований в день взятия крови. Если же исследо­вание откладывают до следующего дня, пробирку с сывороткой закрывают пробкой и помещают в домашний рефрижератор, в котором хранят при температуре 4°С.

Для постановки микрометодов кровь берут из пальца, заполняя ею специальные микропробирки, поднесенные к месту прокола. После свертывания крови сгусток отделяют от стенок пробирки тонким запаянным стеклянным капилляром и центрифугируют на ординарной клинической центрифуге (типа ОПН-3) при 1500 об/мин в течение 20 мин. Полученную сыворотку отсасывают пастеровской пипеткой и переносят в другие чистые пробирки.

Биохимические исследования выполняются как с плазмой, так и с сывороткой крови. Основным биологическим материалом для исследования активности ферментов и метаболитов является сыворотка крови. Необходимо отметить, что вследствие частичного разрушения эритроцитов, сопровождающего переход их содержимого в окружающую жидкость, а также выделения в процессе свертывания крови и ретракции сгустка находящихся в тромбоцитах биологически активных веществ, могущих влиять на ферменты плазмы (сыворотки) крови, в большинстве случаев активность энзимов сыворотки превышает таковую плазмы крови.

Если для исследования одновременно нужны и форменные элементы крови, и плазма (как, например, при определении активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы плазмы), то при взятии крови принимаются меры к предупреждению ее свертывания. В пробирки, предназначенные для взятия и хранения крови, предварительно вносят раствор лимоннокислого и щавелевокислого натрия и после полного испарения водной фазы набирают в них кровь. Затем кровь центрифугируют в течение 5 мин на клинической центрифуге типа ОПН-3 при 3000 об/мин. После этого плазму отсасывают. Эритроциты отмывают от плазмы охлажденным до температуры 4°С изотоническим раствором натрия хлорида и вновь несколько раз центрифугируют, каждый раз удаляя надосадочную жидкость.

Гемолизированные сыворотку и плазму не рекомендуется использовать для анализа, за исключением редких случаев. Так, гемолизаты цельной крови можно применить для определения активности фруктозомонофосфатальдолазы, содержания глюкозы и выполнения некоторых других тестов.

Обычно сыворотку крови содержат в холодильнике при 0— 4"С. Допускается ее хранение в течение месяца (и больше) при условии замораживания сразу после получения и однократном размораживании непосредственно перед определением. Вместе с тем известно, что активность щелочной фосфатазы более стабильна при комнатной температуре (не изменяется на протяжении нескольких суток). В случае хранения сыворотки при пониженной температуре (0—4°С) активность этого фермента постепенно повышается, достигая наибольшей выраженности спустя 12—24 ч. Если же данные об устойчивости определяемых соединений, в частности об изменении активности фермента в сыворотке (плазме) крови при хранении, отсутствуют, рекомендуется проводить биохимический анализ тотчас после ее взятия.

Для определения содержания лабильных соединений, активности некоторых ферментов (кислой фосфатазы и др.) необходимо пользоваться свежей или лиофилизированной сывороткой. Сыворотку же, хранившуюся при 0—4°С, применять с этой целью нельзя.

Исследуемый материал, как правило, сохраняют до окончания выполнения всех анализов, что позволяет в случае необходимости повторить определение.

При хранении мочи в ней прежде всего изменяется содержание тех соединений, на которые влияют присутствующие в жидкости бактерии. Поэтому необходимо производить консервацию мочи разработанными для этого способами, к которым относятся:

1. Быстрое замораживание мочи при температуре -20°С. После оттаивания такая моча пригодна для проведения большинства биохимических исследований.

2. Добавление к суточному объему мочи 5 мл раствора тимола в изопропаноле (100 г/л). Обработанная этим реактивом моча пригодна для выполнения большинства биохимических анализов, за исключением определения уровня экскреции 17-кетостероидов и желчных кислот.

3. Добавление в качестве консерванта соляной кислоты — из расчета 50 мл 10 моль/л (380 г/л, 38%) раствора на суточное количество мочи. Приготовленную таким образом мочу обычно используют для определения содержания в ней стероидов и катехоламинов.

Для подкисления используют также борную кислоту из расчета 1,8 г на 100 мл мочи.

Допускается применять ряд других консервантов: жидкость Мюллера (10 г натрия сульфата, 25 г калия бихромата на 100 мл мочи), хлороформную воду (5—7,5 мл хлороформа на 1 л воды) из расчета 20—30 мл на 1 л мочи. Правда, многие консерванты затрудняют ее последующее химическое исследование.

При необходимости определения содержания в моче фотолабильных веществ (желчные пигменты, порфирины, витамин Вг, некоторые метаболиты аминокислот) биологический материал следует направлять на лабораторный анализ как можно быстрее, притом в посуде, обернутой светонепроницаемой бумагой.

Чтобы предотвратить развитие в моче микрофлоры, в наибольшей мере сказывающейся на результатах бактериологического анализа, исследование целесообразно выполнять в сроки от 30 мин до 1,5 ч после ее выделения (Р.Л. Марцишевская, 1983). Если это невозможно, мочу следует подкислить и хранить в холо­дильнике при 4°С (что позволяет отсрочить проведение исследования на 6 ч после ее сбора).

Выпотные жидкости собирают в чистую сухую колбу, содержащую в качестве антикоагулянта гепарин или лимоннокислый натрий (добавляются из расчета 1 г на 1 л жидкости), и после тщательного размешивания тотчас направляют на исследование.

Подготовка материала к исследованию. Стабильность компонента в сыворотке (плазме) крови в условиях хранения при -20°С, 4—6°С, 20—25°С составляет соответственно: для альбумина — 3, 3, 3 мес, альфа-амилазы — 1 год, 7, 7 сут, альфа-1-антитрипсина — 3,3 мес, 7 сут, апопротеина А1 —-, 3, 1 сут, апопро-теина В — -, 3, 1 сут, белка общего — годы, 4 нед, 6 сут, белковых фракций — 3 нед, 3,1 сут, билирубина — 6 мес, 7,2 сут, гаптогаобина — , 3 мес, 3,4 сут, гликозилированного гемоглобина — 6 мес, 7,3 сут, глюкозы (стабилизированной) — 1, 7, 1 сут, гамма-глутамилтранс-пептидазы — годы, 7, 7 сут, витамина В₆ — дни, часы, 30 мин, витамина В₁₂ — 8 нед, 4 ч, 15 мин, витамина С (со стабилизатором) — 3 нед, 3 ч, -, витамина Е — 1 год, 4 нед, -, железа — годы, 3 нед, 7 сут, иммуноглобулинов: 1§А — 6, 3, 3 мес, 1§О — 6 мес, 7, 7 сут, 1§Е — 6 мес, 7, 7 сут, 1§О — 6 мес, 3, 3 мес, 1§М — 6, 3 мес, 7 сут, инсулина — 6 мес, 1 сут, 4 ч, калия — 1 год, 1,1 нед, кальция общего — 8 мес, 3 нед, 7 сут, кальция ионизированного--,2 ч,

-, карциноэмбрионального антигена (СЕА) — 6 мес, 7,1 сут, кислой фосфатазы (без стабилизирования) — 1 сут, 8 ч, 2 ч, СЗ-компонента комплемента — 8, 8, 4 сут, С4-компонента комплемента —, 2, 2 сут, кортизола — 3 мес, 7, 7 сут, креатинкиназы — 4 нед, 7,2 сут, креатинина — 3 мес, 7,7 сут, молочной кислоты —, 3,3 сут, лактатдегидрогеназы — 4 нед, 4 сут, -, магния — 1 год, 7, 7 сут, миоглобина — 3 мес,1 сут, 2 ч, мочевины — 1 год, 7, 7 сут, мочевой кислоты — 6 мес, 7, 3 сут, натрия — 1 год, 2, 2 нед, нейрон-специфической енолазы — 3 мес, 3 сут, -, прогестерона — 1 год, 3, 1 сут, пролактина — 1 год, 3 сут, 1 сут, простатического специфического антигена — 3 мес, 2, 1 сут, С-реактивного белка —3 года, 8, 3 сут, СА 125 — 3 мес, 5, 3 сут, СА 15-3 — 3 мес, 5, -, СА 19-9 — 3 мес, 5 сут, -, СА 72-4 — 3 мес, 7 сут, -, соматотропина — Змес, 8,1 сут, тестостерона — 1год, 3,1сут,тиреоглобулина —4нед, 5, 5 сут, тиреотропного гормона — 3 мес, 3, 1 сут, тироксина общего — 4 нед, 7, 2 сут, тироксина свободного — 3 мес, 8, 2 сут, трансаминаз — 2 нед, 7, 3 сут, трансферрина — 6 мес, 8, 8 сут, трийодтиронина общего — 3 мес, 8, 2 сут, трийодтиронина сво­бодного — 3 мес, 2 нед, 3 сут, тропонина Т — 3 мес, 1 сут, -, ферритина — 1 год, 7, 7 сут, альфа-фетопротеина — 3 мес, 3, 3 сут, фосфора неорганического — 1 год, 4, 1 сут, фруктозамина — 2 мес, 2 нед, 3 сут, хлоридов — 1 год, 7, 7 сут, холестерина ЛПНП —,7, 1 сут, холестерина Л ПВП —, 7,2 сут, холестерина общего —,7 сут, 7 сут, холинэстеразы — 3 мес, 17, 17 сут, хорионического гонадотропина — 1 год, 3, 1 сут, церулоплазмина — 3 мес, 2, 2 нед, щелочной фосфатазы общей — 2 мес, 7, 7 сут, щелочной фосфатазы костной (изофермент) — 2 мес, 7,7 сут, эстрадиола — 1 год, 3,1 сут, этанола--,6 мес, 2 нед.

Стабильность отдельных компонентов мочи составляет при -20°С, 4—8°С, 20—25°С соответственно: для альбумина — 6 мес,4 нед, 7 сут, дельта-аминолевулиновой кислоты — 4 нед, 4, 1 сут, альфа-амилазы — 3 нед, 10, 2 сут, белка общего — 4 нед, 7, 1 сут, белка Бенс-Джонса — 6 мес, 4 нед, 7 сут, ванилил-миндальной кислоты — годы, 7, 7 сут (при рН 3—5), глюкозы — 2 сут, 2, 2 ч, железа — годы, 7, 3 сут, 1^0 — нестабилен, 4 нед, 7 сут, калия — 1 год, 2 мес, 45 сут, кальция — 3 нед, 4, 2 сут,

2

Известно, что наряду с лечебным воздействием большинство лекарственных препаратов оказывает и нежелательные, побочные эффекты на организм, отражаемые характерными изменениями лабораторных показателей. Так, опиаты (морфин, кодеин) вызывают спазм сфинктера Одди, что нарушает выход альфа-амилазы и липазы в двенадцатиперстную кишку и приводит к повышению активности указанных ферментов в плазме (сыворотке) крови. Препараты группы салицилатов, как правило, вызывают возрастание активности аминотрансфераз плазмы крови.

Повышение энзиматической активности плазмы после приема контрацептивов обусловливается их способностью препятствовать разрушению некоторых ферментов.

Токсическое действие лекарственных препаратов сказывается прежде всего на функциональном состоянии центральной нервной системы, печени и почек. Так, используемый для лечения больных туберкулезом изониазид, трансформируясь в организме в изоникотиновую кислоту, высвобождает столь большое коли­чество ионов аммония (особенно в мозге и печени), что они могут быть причиной проявления токсических психозов либо серьезных нарушений функции печени. Ряд антибиотиков (канамицин и др.) в силу проявляемой ими нефротоксичности способны вызвать протеинурию. Многие из них (стрептомицин и др.) активируют перекисное окисление липидов. Поскольку подавляющее большинство лекарственных препаратов разрушаются в эндоплазматической сети печеночных клеток с образованием продуктов, легко выводимых из организма, становится понятным, почему печень, функция которой как «центральной лаборатории организма» почти постоянно нарушается при патологии, особенно чувствительна к воздействию лекарств. Известно более 200 фармакологических препаратов, активирующих и ингибирующих активность печеночных ферментов.

Ферменты плазмы (сыворотки) крови

Для исследования активности ферментов чаще всего используются плазма или сыворотка крови. В процессе свертывания крови и последующей ретракции сгустка высвобождаются содержащиеся в тромбоцитах биологически активные вещества, под влиянием которых возрастает активность многих энзимов. Про­исходящее при этом разрушение форменных элементов (эритроцитов и др.) крови обусловливает дальнейшее увеличение ферментативной активности, оказывающейся, как правило, в сыворотке более высокой, чем в плазме. Этим, в частности, объясняется известное предостережение не допускать гемолиза, например, при исследовании активности лактатдегидрогеназы крови.

Хранение сыворотки, как правило, сопровождается снижением активности ферментов. Для большинства из них активность не изменяется при комнатной температуре в течение 6—8 ч, около недели — при 4°С и на протяжении одного месяца — в замороженном состоянии. Следует учитывать, что многие антикоагулянты способны ингибировать (иногда, напротив, усиливать) де­ятельность ферментов. Известно, например, что оксалаты подавляют активность ЛДГ, в то время как салицилаты повышают активность аминотрансфераз.

5

Используемые в клинико-диагностических лабораториях методы определения активности ферментов могут быть разделены на две основные группы:

а) состоящие в определении конечного продукта, образовавшегося после известного периода инкубации ферментного препарата (обычно сыворотки) с субстратом в соответствующем буфере (метод конечной точки, выполняемый путем измерения опытной и контрольной проб, т.е., по сути, измерение проводится в двух точках). Для этого используется специальная химическая реакция, а учет оптической плотности может быть произведен на обычном ФЭКе;

б) методы, с помощью которых в ходе ферментативной реакции непрерывно или периодически определяют потребление субстрата, кофермента либо образование метаболита. Методы этой группы называются кинетическими, или методами непрерывной регистрации.

В зависимости от особенностей принципа исследования, положенного в основу определения активности энзимов, способы их осуществления подразделяются на несколько групп:

1. Без использования над и над • Нг (пиридинкоферментов).

Среди них различают колориметрические, титриметрические, газометрические, электрохимические, флюориметрические, изотопные, с использованием инфракрасной спектроскопии, электронного парамагнитного резонанса (табл. 25).

Они используются для определения активности а-амилазы — по количеству освобождающегося в процессе расщепления нитро-фенилпроизводного мальтогептазида 2-хлор-4-нитрофенола, да­ющего окрашивание в щелочной среде; панкреатической липазы — по интенсивности отщепления фенолфталеина (сообщающего раствору красное окрашивание в слабощелочной среде) в ходе расщепления ферментом фенолфталеиндибутирина; холинэсте-разы — по высвобождению при энзиматическом разрушении аце-тилтиохолина тиохолина, взаимодействующего с дисульфиднит-робензоатом с образованием окрашенного соединения; гамма-глутамилтранспептидазы — по объему расщепления гамма-глута-мил-нафтиламида; определения фибриногена и др.

Наиболее распространены колориметрические каталитичес­кие методы (определение активности щелочной и кислой фосфа-таз, липазы, холинэстеразы, лейцинаминопептидазы, гамма-глу-тамилтранспептидазы). В последнее время широко применяются методы исследования с использованием хромогенных субстратов (определение фибриногена и др.).

Флюориметрические методы обычно в 100—1000 раз чувстви­тельнее колориметрических и поэтому прежде всего годятся для ультрамикроанализа ферментов в микроскопических биоптатах

(кусках) ткани.

Из титриметрических методов известны способы определе­ния активности липазы и холинэстеразы (с помощью рН-элек-

трода).

Среди электрохимических методов чрезвычайно распростра­нены те, при которых "продукт ферментативной активности не­посредственно определяется стеклянным селективным электродом. Таким способом можно устанавливать активность холинэс-теразы (с использованием селективного на ацетилхолин электро­да), гуаназы (селективным на аммиак электродом), оксидазы (се­лективным на кислород электродом) и т. д.

2. Каталитические методы, базирующиеся на применении пи-ридинкоферментов (НАД, НАД • Нг).

Из этой группы чаще всего используют методы, основываю­щиеся на оптическом тесте Варбурга (рис. 26). Сопряжение ре­акции образования коферментов с превращением формазана позволяет учитывать ход реакции в видимой области спектра. По такой технологии анализируется активность свыше 100 фермен­тов.

3. Некаталитические методы, позволяющие непосредственно определять концентрацию фермента, независимо от его катали­тической активности. С помощью их выявляется содержание многих апоферментов. Концентрацию энзимов устанавливают чаще всего иммунологическими методами (например, определе­ние МВ-изофермента креатинкиназы).

Весьма перспективен способ аффинной хроматографии и не­которые другие.

Методы исследования ферментов

Классификация Некоторые из ферментов, Примечания

методов, активность которых

технология устанавливается при-

определения веденными методами

/. Каталитические, выполняемые без участия НАД(Ф) или НАД(Ф) • Н2

1. Колориметри- Щелочная фосфатаза, кис-ческие с исполь- лая фосфатаза, гамма-зованием хромо- глутамилтранспептидаза, генов альфа-амилаза, липаза,

холинэстераза

2. Флюориметри- Щелочная фосфатаза, В 1000—10 000 раз ческие кислая фосфатаза, чувствительнее

лейцинаминопептидаза колориметрических

3. Титриметри- Липаза, В 10 раз чувствитель-ческие холинэстераза нее колориметрических

4. Газометри- Оксидазы, каталаза, Отдельные из методов ческие декарбоксилаза в 100 000 раз чувствитель­нее колориметрических

5. Электро- Холинэстераза, Используются суб­химические орнитинкарбамоил- стратные электроды,

трансфераза радиотелеметрические

капсулы

6. Изотопные Позволяют проводить

исследования на уровне клетки, чувствитель­ность в 1000—1 000 000 выше, чем метода 1.1

7. Использующие Щелочная фосфатаза В 1000 раз чувствитель-парамагнитный нее колориметрических резонанс

8. Инфракрасной В 1000 раз чувствитель-спектрофото- нее колориметрических, метрии позволяют выполнять

«бескровное» исследо­вание т у1уо

//. Каталитические методы с использованием НАД(Ф) или НАД(Ф) ' Н2

1. Основанные Определение активности ЦУ-тест на оптическом свыше 100 ферментов

тесте Варбурга

2. Колориметрические:

- сопряженные с применением инди- РагЫез!: катеров (компонентов реакционной

смеси, реагирующих с окисленным и восстановленным НАД), дающих об­разование окрашенных соединений;

- прямые тиопиридиновые методы, состоящие в применении ТНАД(Ф) • Н

Классификация Некоторые из ферментов, Примечания

методов, активность которых

технология устанавливается при-

определения веденными методами