3. Флюориметрические:

- прямые с НАД(Ф) и НАД(Ф) • Н, В 100—1000 раз чувст-протекающие в щелочной среде; тельнее методов

И.1-П.2

- сопряженные с резурином; В 1000 раз чувствитель-

нее методов II.1—11.2

- сопряженные с люциферазой; В 10 000—100 000 раз

чувствительнее методов 11.1—11.2

- микроскопия спектрофлюо- В 1 000 000 раз чувстви-риметрическая тельнее методов

ИЛ—11.2

4. Рециклизирующие:

- исследование одной молекулы В 10 000—10 000 000 раз фермента в клетке или ее чувствительнее методов органелле 11.1—11.2

Табл. 25. Методы исследования ферментов

Классификация Некоторые из ферментов, Примечания методов, активность которых технология устанавливается при-определения веденными методами

/. Каталитические, выполняемые без участия НАД(Ф) или НАД(Ф) • Н2 1. Колориметри- Щелочная фосфатаза, кис-ческие с исполь- лая фосфатаза, гамма-зованием хромо- глутамилтранспептидаза, генов альфа-амилаза, липаза, холинэстераза 2. Флюориметри- Щелочная фосфатаза, В 1000—10 000 раз ческие кислая фосфатаза, чувствительнее лейцинаминопептидаза колориметрических 3. Титриметри- Липаза, В 10 раз чувствитель-ческие холинэстераза нее колориметрических 4. Газометри- Оксидазы, каталаза, Отдельные из методов ческие декарбоксилаза в 100 000 раз чувствитель­нее колориметрических

5. Электро- Холинэстераза, Используются суб­химические орнитинкарбамоил- стратные электроды, трансфераза радиотелеметрические капсулы 6. Изотопные Позволяют проводить исследования на уровне клетки, чувствитель­ность в 1000—1 000 000 выше, чем метода 1.1 7. Использующие Щелочная фосфатаза В 1000 раз чувствитель-парамагнитный нее колориметрических резонанс 8. Инфракрасной В 1000 раз чувствитель-спектрофото- нее колориметрических, метрии позволяют выполнять «бескровное» исследо­вание т у1уо

//. Каталитические методы с использованием НАД(Ф) или НАД(Ф) ' Н2

1. Основанные Определение активности ЦУ-тест на оптическом свыше 100 ферментов тесте Варбурга 2. Колориметрические: - сопряженные с применением инди- РагЫез!: катеров (компонентов реакционной смеси, реагирующих с окисленным и восстановленным НАД), дающих об­разование окрашенных соединений; - прямые тиопиридиновые методы, состоящие в применении ТНАД(Ф) • Н

III. Некаталитические

1. Иммунологические:

- радиоиммунологические;

- иммунотурбидиметрические;

- кинетической нефелометрии

2. Состоящие в применении аффинной хроматографии

3. Основанные Щелочная фосфатаза, Основаны на исполь-на титровании трипсин зовании изотопных активного цент- и флюоресцентных ра мечеными ингибиторов ингибиторами

Активность ферментов выражается количеством разрушенно­го субстрата или образованного в ходе реакции продукта (в моль, ммоль, мкмоль и т.д.) в пересчете на один литр сыворотки (плаз­мы) крови при температуре 37, 30, 25°С (81) либо в международ­ных единицах (Е/л, 1]/\),& также в каталах (долях катала) на литр, например мккат/л (1 мккат = 60 V; 1 \] = 16,67 • 10~³ мккат). Одна единица (\5) какого-либо энзима — есть то его количество, которое катализирует трансформацию 1 мкмоль субстрата за 1 мин при определенных условиях.

В настоящее время представляется актуальным исследование активности ферментов не только в плазме крови, но также в моче и других биологических жидкостях.

Ферменты мочи

Начало исследованию активности ферментов в моче положил ^оЫ^епнйп, предложивший в 1908 г. тест определения активнос­ти альфа-амилазы мочи с целью диагностики острого панкреати­та. В настоящее время в моче обнаружено около 40 ферментов, однако большое клинико-диагностическое значение приобрело определение активности лишь немногих из них.

Ферменты мочи могут иметь различное происхождение. Часть из них попадает в мочу из плазмы крови путем гломерулярной фильтрации. Фильтрационный барьер в почечном клубочке трех­слойный: первый слой представляет собой фенестральный эндо­телий капилляров клубочка, имеющий поры диаметром 60—100 нм, местами прикрытые и не прикрытые диафрагмой; второй слой составляет базальная мембрана клубочка, толщиной 320—340 нм — основной барьер, определяющий избирательность процесса филь­трации; третий слой — это покрывающий капилляры эпителий. Он образован подоцитами, между ножками которых имеются за­тянутые диафрагмами фильтрационные щели шириной 20—30 нм.

Эффективность фильтрационного барьера зависит от филь­трационной способности каждого слоя в отдельности, а также от скорости кровотока вдоль его внутренней поверхности (в услови­ях нормального кровотока поры шириной 7 нм закрыты более крупными молекулами — макромолекулами) и электрического заряда молекул. В норме в мочу попадают ферменты с молекуляр­ной массой менее 70 кД — альфа-амилаза, лизоцим, рибонуклеа-за, а также небольшое количество низкомолекулярных форм микросомной аминопептидазы и высокомолекулярных фермен­тов — АлТ, АсТ, КФ, ЛАП, ЛДГ, МДГ, ЩФ. При патологических условиях фильтрации в моче обнаруживается активность многих других как высоко-, так и низкомолекулярных ферментов.

Для определения состояния гломерулярной фильтрации дос­таточно оценить активность холинэстеразы (ХЭ) в моче, так как этот фермент в почечной ткани практически отсутствует. В норме фермент в моче не содержится, поскольку не проходит через гло-мерулярный фильтр (молекулярная масса 348 кД). Выявлена связь между экскрецией ХЭ с мочой и селективной протеинурией у больных с нефротическим синдромом, а также достоверное по­вышение активности ХЭ в моче при смешанной форме гломеру-лонефрита. К числу тех ферментов, которые проходят через гло-мерулярный фильтр и частично реабсорбируются в почечных ка-

нальцах, относится альфа-амилаза. Поэтому ее активность в моче коррелирует с реабсорбционной способностью эпителия прокси­мального отдела нефрона.

В клубочках почек найдено лишь небольшое содержание фер­ментов. Считается, что наибольшее количество их поступает в мочу из проксимального отдела нефрона. Так, например, уста­новлено, что около 50% ЛДГ поступает в мочу из проксимального отдела нефрона, 18% — из дистального, 21% — из мозгового ве­щества и только 5% — из почечного тельца.

Повышение в моче активности тех или иных ферментов отра­жает повреждение или повышение проницаемости мембран по­чечных канальцев. В зависимости от глубины повреждения в мочу выделяются ферменты, имеющие различную субклеточную локализацию. При незначительном нарушении почечной ткани в моче возрастает активность ферментов, связанных преимущес­твенно с плазматической мембраной, при выраженной деструк-туризации повышается активность цитоплазматических и лизо-сомальных ферментов. Значительное увеличение активности ми-тохондриальных ферментов в моче соответствует некрозу клеток почечной ткани. Активность ГГТП мочи особенно тесно корре­лирует с активностью патологического процесса в ткани почек, так как этот фермент частично локализован в плазматической мембране, а частично — в комплексе Гольджи.

Большую группу составляют ферменты, попадающие в мочу из плазмы крови, других клеток и тканей. Среди них ферменты:

а) клеток крови — в лейкоцитах содержатся КФ, ЛДГ, ЩФ, бета-глюкуронидаза (Гл), а в эритроцитах — преимущественно ЛДГ;

б) опухолевых клеток: богаты Гл, альдолазой, ЛДГ, ГГТП и ЩФ (определение активности этих энзимов в моче используется для диагностики опухолей, хотя практически ни один из них до сих пор не оправдал себя как надежный маркер опухоли);

в) бактерий, содержащих в большом количестве каталазу и Гл (степень бактериурии не коррелирует с уровнем ферментурии).

В настоящее время определение активности ферментов в моче

используют для:

а) распознавания типа повреждения нефрона при почечной и

внепочечной патологии;

б) констатации отторжения почечного трансплантата;

в) оценки токсического действия лекарств на почки;

г) диагностики латентной (скрытой) нефропатии на основа­нии регистрации увеличения экскреции ферментов с мочой пос­ле приема лизосомотропных веществ;

д) улучшения распознавания инфекционных заболеваний по­чек и мочевого пузыря;

е) выявления нефроптоза;

ж) диагностики опухолей почек.

По данным большинства авторов, при заболеваниях почек от­сутствует тесная корреляция между активностью ферментов в плазме (сыворотке) крови и моче, выявление их в моче оказывается значительно более информативным, чем определение активности в

крови.

Фермент, определение активности которого пригодно для ди­агностики поражений почек, должен находиться в почечной тка­ни, но практически отсутствовать в нижнем отделе мочевыводя-щих путей; иметь достаточно высокую молекулярную массу в от­личие от таковой ферментов других органов. Желательно, чтобы было минимальным влияние на его активность компонентов мо­чевого осадка и мочевой микрофлоры. К тому же он не должен терять активность при хранении; в моче не должно находиться ни активаторов, ни ингибиторов определяемых ферментов.

Гиперферментурия встречается как при соматических, так и при онкологических заболеваниях. Установлено, что при сахар­ном диабете в моче возрастает активность лизоцима, аминопеп-тидаз (ААП), Гл, бета-1Ч-ацетилглюкозаминидазы (НАГ); гипер-тиреозе — ААП, ЩФ; муколипидозе — бета-галактозидазы и НАГ; кардиопатиях — АлТ, АсТ, ААП, ЛДГ, ЩФ, гипертензии — бета-галактозидазы, Гл, ЛАП, НАГ, ЩФ; гепатопатиях — ААП, АсТ, Гл, ЛАП, НАГ, ЩФ; остром панкреатите — ААП, альфа-амилазы, Гл, бета-глюкозидазы; ревматических заболеваниях (кол-лагенозах) — НАГ; при опухолях различной локализации — Гл, ГТГ, лизоцима, а также отношение ЛДГ5/ЛДГ1.

Надежность лабораторных исследований во многом зависит от условий сбора и хранения мочи. Для сбора мочи предлагались разные интервалы времени — 24, 8, 4 ч, большинством авторов признак оптимальным промежуток 3 ч, так как за этот срок ак­тивность ферментов в собранной моче изменяется в меньшей степени. С целью устранения влияния на экскрецию ферментов с мочой циркадных ритмов рекомендуется собирать утреннюю порцию мочи (6—9 ч). Оказалось сложным определить, в каких именно единицах следует выражать активность ферментов мочи для того, чтобы уменьшить искажающее результаты влияние ди­уреза. Предлагалось выражать активность ферментов в единицах, соотнесенных либо с объемом пробы мочи, либо со временем сбора ее (12 или 24 ч). Наиболее достоверные результаты получе­ны при выражении ферментативной активности, отнесенной к 1 г креатинина, так как концентрация последнего в моче коррелиру­ет со степенью гломерулярной фильтрации.

Активность ферментов в значительной мере зависит от рН мочи, колеблющегося даже в физиологических условиях.

А.В. Мошкин, Б.П. Мищенко (1982) перед проведением ис­следования активности ферментов рекомендуют проводить ак-тивный диализ мочи в течение 2 ч против раствора ЫаС1 (9 г/л) из расчета: 1 мл мочи на 200 мл этого изотонического раствора с ис­пользованием мембран «1)шоп СагЫд Согр.» (США).

Для сохранения ферментативной активности в моче ее остав­ляют стоять 3 ч при температуре 4°С, затем центрифугируют для осаждения солей, доводят рН до 7,0 и добавляют глицерин (30 мл/л). Оказалось, что такие ферменты, как НАГ, ААП, ГГТ и ЛДГ, сохраняют активность в моче постоянной при температуре -20°С в течение года.

нотрансфераза (Ь-аспартат: 2-оксоглутаратаминотрансфераза; КФ 2.6.1.1) и аланинаминотрансфераза (Ь-аланин: 2-оксоглута-ратаминотрансфераза; КФ 2.6.1.2) — широко распространены в тканях человеческого организма.

Аспартатаминотрансфераза — белок с молекулярной массой 110 000 Д. Наиболее богатыми источниками ее являются сердце, печень, скелетная мускулатура, нервная ткань и почки; в подже­лудочной железе, селезенке и легких АсТ обнаруживается в мень­ших количествах (см. табл. 28). Активность фермента в эритроци­тах незначительна и составляет приблизительно десятую часть от таковой в плазме: поэтому слабый гемолиз существенно не влия­ет на величину активности фермента сыворотки (плазмы) крови. Активность же АлТ в эритроцитах в 6 раз превышает таковую в сыворотке (плазме) крови, что следует учитывать при анализиро­вании гемолитической сыворотки. Наибольшее количество фер­мента аланинаминотрансферазы содержится в печени.

Аспартатаминотрансфераза представлена отдельными изоэн-зимами, составляющими две основные формы фермента — мито-хондриальную и растворимую, содержащиеся как в митохондри­ях, так и в цитоплазме.

Митохондриальная форма энзима составляет около 12% об­щей активности аспартатаминотрансферазы. В печени на долю митохондриальной формы АсТ приходится 81% от общей актив­ности фермента (ц-АсТ — растворимая в цитозоле, м-АсТ — ми­тохондриальная) .

Особенности распределения АсТ и АлТ в тканях и плазме кро­ви взрослого человека представлены в табл. 28, 29.

Табл. 28. Распределение АсТ в тканях и плазме крови взрослого человека

Ткани Активность фермента Отношение активности

в ткани гомогената, фермента ткани и плазмы

Е • 10"³ г (сыворотки) крови ткани гомогената

Сердце 156 7800

Печень 142 7100

Скелетная

мускулатура 99 4950

Почки 91 4550

Поджелудочная

железа 28 1400

Селезенка 14 700

Легкие 10 500

Плазма 0,02 1

Табл. 29. Распределение АлТ в тканях и плазме крови взрослого человека

Ткани Активность фермента Отношение активности

в ткани гомогената, фермента ткани и плазмы

Е • 10"³г (сыворотки) крови ткани гомогената

Сердце 7,1 444

Печень 44 2750

Скелетная

мускулатура 4,8 300

Почки 19 1188

Поджелудочная

железа 2 125

Селезенка 1,2 75

Легкие 0,7 44

Сыворотка 0,016 1

Аспартат и аланинаминотрансфераза обратимо катализируют реакции 1) и 2):

СО₂Н СО₂Н

СО₂Н С=О СО₂Н НС— NН₂

1) НС--NН2 + СН_{2 |} ^АсТ, С = О + СН₂

сн₂ 'сн₂ сн₂ сн₂

СО₂Н СО₂Н СО₂Н СО₂Н

Ь-аспартат а-кетоглутарат Оксалацетат Ь-глутамат

СО₂Н СО₂Н

СО₂Н С=О СО₂Н НС—NН2

2) НС--ЫН₂ + СН_{2 (} ^АлТ, С =О + СН₂

СНз СН₂ Ьнз СН₂

СО₂Н СО₂Н

Ь-аланин а-кетоглугарат Пируват Ь-глугамат

ц-АсТ представлена двумя идентичными субъединицами, яв­ляясь димером с молекулярной массой 93 кД. Наиболее полно охарактеризована АсТ из миокарда свиньи. м-АсТ — также димер с молекулярной массой 91 кД. Выделение изоферментов выявило существование нескольких изоформ со сходной кинетикой, но выраженными иммунохимическими особенностями.

АлТ (глутаматпируваттрансаминаза; Ь-аланин-2-оксоглутарат-аминотрансаминаза — ГПТ, КФ 2.6.1.2) является второй важной аминотрансферазой, выделенной из тканей человека и хорошо изученной. АлТ присутствует во многих органах: печени, почках, скелетных мышцах, миокарде, поджелудочной железе. Невысо­кая активность АлТ отмечена и в плазме (сыворотке) крови здо­ровых людей. Как и АсТ, АлТ присутствует в клетках в форме двух изоферментов — цитозольного и митохондриального, но послед­ний является нестабильным, да и содержание его в клетках низ­кое.

В организме человека катализируемая ферментом аланинами-нотрансферазой реакция (2) идет слева направо, поскольку обра­зующийся при этом продукт (Ь-глутамат) служит источником об­разования мочевины.

Существующие методы определения активности указанных аминотрансфераз в сыворотке крови можно разделить на две ос­новные группы: конечной точки (колориметрические, с использо­ванием обычной, не оснащенной системой термостатирования кювет фотометрической аппаратуры) и кинетические (спектро-фотометрические).

Колориметрические методы. В качестве унифицированного в СССР был утвержден метод Райтмана—Френкеля, в котором ок-салацетат, образованный при переаминировании Ь-аспартата и альфа-кетоглутаровой кислоты ь щелочной среде, превращается в пируват, дающий с 2,4-динитрофенилгидразоном гидразон пи-рувата, оптическую плотность которого измеряют при длинах волн 505—540 нм (рис. 27).

Колориметрический метод определения активности амино­трансфераз, основанный на образовании пируват-2,4-динитрофе-нилгидразона (Врублевский, Кабад, 1957), до сих пор наиболее широко использовался в ординарных клинико-диагностических лабораториях нашей республики. Несмотря на присущие ему не­достатки: невозможность наблюдения за ходом реакции, необхо­димость построения градуировочного графика, резко возрастаю­щие при гиперферментемии значения абсорбции (затрудняющие учет результатов), длительность исполнения анализа и некоторые другие — этот метод продолжает оставаться распространенным в клинико-лабораторной практике.

Метод Бабсона и др. (1961), базирующийся на цветной ре­акции оксалацетата с диазониевой солью, также не лишен опре­деленных недостатков (затруднения в калибровке и др.).

Колориметрические азометоды основаны на образовании ок­рашенного соединения при взаимодействии щавелевоуксусной кислоты и 6-бензамидо-4-метокситолуидиндиазониевого хлори-

СО₂Н

1 с = о

I сн,

—1ЧН

Пируват Динитрофенилгидразин

Рис. 27. Определение пирувата

Динитрофенилгидразоновый

комплекс (пируват-динитрофенилгидразон)

да. Методы этой группы довольно просты и при наличии соответ­ствующих реактивов могут быть использованы для быстрого ори­ентировочного определения активности аспартатаминотрансфе-разы.

Находит применение и метод определения активности АсТ, базирующийся на образовании окрашенного комплекса при вза­имодействии арилдиазониевой соли с метиленовой группой ща­велевоуксусной кислоты.

Химизм реакции образования окрашенного комплекса, поло­женный в основу определения активности фермента одним из колориметрических методов (конечной точки и кинетическим), показан на рис. 28, 29.

Содержание АсТ в биологических жидкостях как специфичес­кого белка можно исследовать иммунохимическим методом и ме­тодом титрования активных центров фермента. Однако с практи­ческой точки зрения это хуже, чем использование 1Л/-метода.

Кинетические методы. Поскольку колориметрическим мето­дам присуще множество недостатков, предпочтение отдается бо­лее совершенным кинетическим (спектрофотометрическим), предложенным Кармен еще в 1955 г. Они основаны на проведе­нии сопряженных ферментных реакций, в ходе которых оксал-ацетат удаляется по мере его образования. Используемая в реакци­онной смеси НАД-зависимая малатдегидрогеназа является инди­каторным ферментом, позволяющим определять активность АсТ по снижению абсорбции монохроматического светового потока (340 нм) вследствие происходящего окисления НАДН • Н. В даль­нейшем бьшо предложено улучшить условия проведения реакции и стандартизовать температуру ее протекания.

Наиболее удобный, нашедший широкое применение, анали­тический спектрофотометрический метод определения актив­ности аминотрансфераз предложен Кармен. В этом методе обра­зовавшийся в результате переаминирования оксалацетат восста­навливают в малат с одновременным окислением НАД • Н при

1) Аспарагино- ₊ а-кетоглутаро- ^Ас\ Глутаминовая . Щавепевоуксус-

вая кислота 2) СО₂Н

вая кислота

кислота

+ ная кислота (оксалацетат)

I + ж₂-сн₂

I

СО₂Н.

Оксалацетат Динитрофенилгидразин Динитрофенилгидразоновый

комплекс (оксалацетат-динитрофенилгидразон)

Рис. 28. Определение активности аспартатаминотрансферазы ме­тодом конечной точки

1) Аспарагино- а-кетоглутаровая АсТ" Глутаминовая Щавелевоуксус-вая кислота⁺ кислота ^ кислота ⁺ ная кислота

(оксалацетат)

2) СО₂Н

СО₂Н

| Малатде- |

С = О гидрогеназа СН — ОН

I +НАДН + Н < > I

СН,

СО₂Н Оксалацетат

СН₂

I СО₂Н

Малат

+НАД⁺

Рис. 29. Определение активности аспартатаминотрансферазы ки­нетическим методом

действии малатдегидрогеназы и измеряют кинетику оптической плотности НАД • Н при длине волны 340 нм. Предпочтение отда­ется другому методу оценки активности фермента, основанному на регистрации изменения оптической плотности раствора при длине волны 340 нм: пируват, образованный при переаминирова-нии аланина и альфа-кетоглутарата, восстанавливают в лактат с одновременным окислением НАД • Н, катализируемым ЛДГ. Преимущество метода состоит в его высокой специфичности, возможности использования для расчета активности фермента коэффициента молярной экстинкции НАД • Н, «постоянной» превращения пирувата в лактат при накоплении его в инкубаци­онной среде. Снижение оптической плотности инкубационной среды после незначительного «лаг-периода» при 340 нм отражает активность АлТ.

Ч7А

Генлеем (1955), Врублевским и Ля Дью (1956) предложен ки­нетический метод, базирующийся на регистрации восстановле­ния пирувата НАД • Н-зависимой лактатдегидрогеназой.

Большой вклад в развитие методологии кинетического иссле­дования был внесен Немецким обществом клинической химии, Скандинавским союзом клинической химии и клинической фи­зиологии, Французским обществом клинической биологии. Пос­ледним были сделаны рекомендации, касающиеся изменения со­держания в реакционной среде субстратов, их метаболитов, рН и температуры. В 1980 г. Международная федерация клинической химии (1РСС) одобрила процедуру определения активности ами-нотрансфераз, основанную на сопряжении ЛДГ-НАД • Н. Комитетом экспертов 1РСС было предложено для достижения максимальной активности ферментов добавлять к реакционной смеси 5-фосфопиридрксаль (этот методический подход, в час­тности, реализуется в диагностических наборах реагентов фирмы «Эбботт» («АЬЪои ЬаЬога1опе5»), «Лахема» («АлАТ-УФ-микро», «АсАТ-УФ-микро»). В наборе реагентов фирмы «Пойнте Сцайнтифик Польска» не содержится 5-фосфопиридоксаль, пос­кольку трактовка диагностической значимости увеличенной от внесения в реакционную смесь кофермента активности АсТ оста­ется все еще предметом обсуждения. Оптимизированные методы отличаются от других высокой концентрацией 5-фосфопиридок-саля в смеси.

На использовании методологии немецкого и скандинавского международного общества клинической химии основывается применение наборов реагентов фирмы «Бекман».

Предложенный Немецким обществом клинической химии метод реализуется с применением наборов реагентов фирм «Кормэй», «Бёрингер Маннгейм» и др. Фирмой «Лахема» предла­гается тест «АлАТ-УФ-микро» — определение каталитической концентрации фермента, выполняемое по методике, одобренной 1РСС (1985).

В качестве кофермента в реакции переаминирования, осу­ществляемого обоими ферментами, выступает витамин Вб (пири-доксин), точнее, его основная метаболически активная форма — пиридоксаль-5-фосфат (П-5-Ф). Добавление в сыворотку крови П-5-Ф приводит к повышению активности как АсТ, так и АлТ. Ассоциация кофермента с апоферментом замедлена в фосфатном буфере, чего не отмечено в трис-буфере и органических буфер­ных системах. У здоровых людей выявлена отрицательная корре­лятивная зависимость между содержанием в крови П-5-Ф и по­вышением активности АсТ и АлТ при добавлении П-5-Ф к сыво­ротке крови.

Следует иметь в виду, что витамин Вб широко распространен в пищевых продуктах, но разрушается при приготовлении пищи.

Раздельное исследование активности ц-АсТ и м-АсТ можно пррвести, используя различия в кинетических характеристиках изоферментов, хроматографические методы анализа, методы электрофореза и иммуноингибирования.

Особый интерес представляют флюориметрические методы определения активности ферментов, основывающиеся на воз­можности осуществлять флюориметрический мониторинг светя­щегося в ультрафиолетовой области восстановленного НАД (НАД • Н) или продуктов, образующихся в пробирке (кювете) за счет воздействия НАД • Н. Образующийся в ходе этой реакции резоруфин обладает в 100 раз более интенсивной флюоресценци­ей, чем восстановленный НАД.

Возможно и использование с этой целью флавиновых моно-нуклеотидов:

1) НАД • Нг + ФМН редуктаза НАД + ФМН • Нг; 2)ФМН • Н + альдегид О₂-люцифераза _{фмн +} кислота + Ьу (биолюминесцентный метод).

Наиболее часто используемым для определения активности АсТ и АлТ биологическим материалом является сыворотка кро­ви, которая не должна иметь следов гемолиза (из-за наличия фер­ментов в эритроцитах). Активность АсТ (АлТ) стабильна: в тече­ние 24 ч (по некоторым данным, 4 сут) — при комнатной темпе­ратуре (18—25°С), 10 (7) сут при 2— 8°С, 14 (30) сут — после замо­раживания (-20°С). Вместо сыворотки может быть использована и плазма крови. Для ее получения в качестве антикоагулянтов ре­комендуется применять гепарин и ЭДТА.

Для исследования активности АсТ предпочтительнее исполь­зовать свежую сыворотку крови, взятую в условиях минимально­го стаза, или плазму крови, полученную при добавлении гепари­на (не более 0,2 мг/мл), ЭДТА (1 мг/мл), флюорида (2 мг/мл), ок-салата (1 мг/мл) и цитрата (1 мг/мл).

Для исследования активности АлТ также лучше использовать свежую сыворотку крови, плазму крови применять не следует. АлТ сохраняет свою активность в сыворотке крови на протяже­нии минимум 4 сут при температуре 4°С.

Специфичным ингибитором АлТ является пропаргилглицин. К интерферирующим факторам относятся повышенная концен­трация ионов аммония и высокая активность глутаматдегидроге-назы.

Клинико-диагностическое значение определения активности аминотрансфераз в сыворотке крови

Наиболее часто активность аминотрансфераз исследуют с целью дифференциальной диагностики патологии печени и мио­карда. Печень относится к органам, клетки которых имеют пря­мой контакт как с интерстициальньш, так и с внутрисосудистым пространством; к тому же проницаемость стенок капилляров в печени высока. В этих условиях, при патологии гепатоцитов, ферменты, освобождающиеся из клеток, быстро оказываются в плазме крови. В миокарде, наоборот, миоциты имеют прямой контакт только с межклеточным пространством при низкой про­ницаемости капилляров. Поэтому освободившиеся из клеток ферменты достигают внутрисосудистого пространства преиму­щественно путем транспорта с лимфой.

При инфаркте миокарда активность АсТ в 95% случаев повы­шена. Возрастание ее происходит через 4—6 ч с момента присту­па, повлекшего данное заболевание. Оно четко выражено спустя 24—36 ч (увеличивается примерно в 4—5 раз по сравнению с вер­хним предельным уровнем диапазона нормы) и лишь на 3-й — 7-е сут снижается до нормы. Повышение активности АсТ и ЛДГ наб­людается при таких формах инфаркта миокарда, которые не ди­агностируются электрокардиографически.

По данным некоторых авторов, при крупноочаговом инфар-V

кте миокарда показатель активности АсТ составляет 1,54—3,28 ммольДч • л), АлТ — 1,90—3,80 ммольДч • л); при мелкоочаговых поражениях — в среднем 0,70 ммольДч • л) для АсТ и 1,27 ммольДч • л) для АлТ —при норме соответственно 0,50 ммольДч • л) и 0,80 ммольДч • л).

В остром периоде инфаркта миокарда повышение активности АсТ является достоверным диагностическим тестом. В то же вре­мя активность этого фермента повышена в значительно меньшей степени, чем активность КК или ЛДГ.

Отношение показателей активности КК/АсТ имеет высокую диагностическую значимость при дифференциальной диагности­ке инфаркта миокарда и поражения скелетных мышц: отношение КК/АсТ около 27 (13—56) свидетельствует о поражении скелет­ной мускулатуры, около 5 (2—9) — о патологии кардиомиоцитов.

При исследовании активности АсТ и АлТ у больных острым крупноочаговым инфарктом миокарда обнаружено достоверное повышение ее вплоть до 40-х сут заболевания. Максимальное по­вышение наблюдалось на 3-й сут обследования, далее активность данных энзимов постепенно снижалась, но, как указывалось ра­нее, так и не нормализовывалась к 40-м сут.

Сердечная мышца содержит незначительное количество АлТ по сравнению с АсТ. Поэтому уровень активности АлТ в сыво­ротке при инфаркте миокарда обычно остается в пределах нормы, если только в результате застойных явлений вторично не затраги­вается печень.

Умеренное повышение активности аминотрансфераз наблю­дается у больных с пароксизмальной тахикардией, гипертоничес­кими кризами.

Выраженное увеличение активности аминотрансфераз отме­чается при гангрене мышц, прогрессирующем миозите, миокар­дите, некрозе и травме скелетных мышц.

При эмболии легких, сопровождающейся выраженным повы­шением активности АсТ и АлТ, активность КК не увеличивается, что может быть использовано как дифференциально-диагности­ческий критерий поражений в отдельных органах — сердце, лег­ких, составляющих кардиореспираторную систему.

Исследование активности аминотрансфераз в сыворотке кро­ви имеет исключительно важное значение для диагностики и дифференциальной диагностики болезней печени.

При инфекционном гепатите активность аминотрансфераз повышается с большим постоянством в очень ранние сроки — еще до появления желтухи. Резкое увеличение активности фер­мента наблюдается и у больных с безжелтушной формой заболе­вания, поэтому указанная проба широко применяется при обсле­довании лиц, пребывавших в очаге инфекции. В начале заболева­ния коэффициент АсТ/АлТ становится значительно меньше 1.

Большей чувствительностью отличается аланинаминотрансфе-разная проба, которая в первые 10—15 сут болезни (5—10 сут от начала появления желтухи) практически во всех случаях бывает повышенной. С увеличением сроков заболевания активность аминотрансфераз постепенно снижается, как правило, быстрее при легком его течении, чем при среднетяжелом и тяжелом. У де­тей данный показатель нормализуется раньше, у больных с за­тяжным течением наблюдается длительная (на протяжении 5—7 нед у взрослых) гиперферментемия; при рецидивах и обострени­ях болезни активность аминотрансфераз вновь возрастает. Ами-нотрансферазная проба в определенной степени служит критери­ем полноты выздоровления.

При токсическом гепатите и обострении хронического гепа­тита часто выявляются высокие цифры ферментативной актив­ности. Цирроз печени даже в активной фазе не сопровождается столь значительной гиперферментемией. При дистрофии печени активность энзимов может быстро снижаться (с ранее констати­рованных высоких цифр), несмотря на ухудшение течения забо­левания.

Максимальное повышение активности АсТ и АлТ происходит при остром вирусном гепатите — более чем в 100 раз, достигая 3000—8000 Е/л (в этот период времени проявляется выраженная желтуха). Во всех случаях острого вирусного гепатита в крови до­минирует активность АлТ. В то же время степень гиперферменте-мии не всегда соответствует размеру некроза печени, установлен­ному на аутопсии. Быстрое снижение активности аминотрансфе­раз одновременно с возрастанием гипербилирубинемии и выра­женным увеличением протромбинового времени предвещает плохой прогноз, свидетельствуя об обширных некротических из­менениях в ткани печени. В благоприятных ситуациях острого вирусного гепатита активность АлТ и АсТ снижается медленно в течение нескольких недель и даже месяцев.

Умеренная гиперферментемия наблюдается при хроническом гепатите (в том числе гепатите при алкоголизме, когда уровень активности АсТ обычно оказывается выше, чем АлТ), лекар­ственно-индуцированном поражении печени, ишемическом ге­патите.

Возрастание активности ферментов отмечено также при ос­тром токсическом и лекарственном поражении печени, ишеми­ческом гепатите. Во всех случаях повышение активности амино­трансфераз при остром гепатоцеллюлярном поражении достигает больших значений, чем при обструктивном печеночном или вне-печеночном холестазе. В этих условиях степень гиперферменте-мии (не превышающая обычно 10-кратного возрастания актив­ности) может иметь и дифференциально-диагностическое значе­ние. При ишемическом гепатите, развивающемся, в частности, при сердечной недостаточности, активность аминотрансфераз возвращается к норме в течение короткого периода времени пос­ле того, как недостаточность кровообращения оказывается ком­пенсированной. При обструктивной желтухе, внутрипеченочном холестазе, циррозе печени, метастазах карциномы активность АсТ бывает повышена в большей степени, чем активность АлТ. При алкогольном гепатите активность АсТ может превышать та­ковую АлТ, однако уже две недели воздержания от принятия ал­коголя приводят к выраженному снижению активности АсТ. При абстиненции прием алкоголя (1 г/кг массы тела) вызывает значи­тельное увеличение активности АсТ сыворотки крови уже через 24 ч. Активность АлТ при этом существенно не повышается. От­мечено значительное возрастание активности гамма-глутамил-транспептидазы (ГГТП), глутаматдегидрогеназы и процентного содержания ЛДГ5 в спектре изоферментов лактатдегидрогеназы. Однако степень увеличения активности ГГТП и ГлДГ не превы­шает 10-кратного значения. Возможно, преимущественное по­вышение активности АсТ при алкогольном гепатите связано с об­разованием в митохондриях ацетальдегида. При алкогольном ге­патите в печени снижена активность АлТ по сравнению с ее уров­нем у здоровых, активность АлТ не удается повысить при назначении пациентам П-5-Ф. Одновременно П-5-Ф предохра­няет фермент АсТ от влияния на него основного токсического метаболита этанола — ацетальдегида.

Исследование отношения активности м-АсТ/общая АсТ было предложено в качестве диагностического теста, поскольку значе­ние его характерно меняется в разные стадии воспалительного за­болевания печени.

Активность АсТ и АлТ немного увеличивается после введения гепатотоксических препаратов, например метотрексата, хлорпро-мазина при холестатической и обтурационной желтухе. Случай­ное введение четыреххлористого углерода приводит к значитель­ному повышению активности обоих ферментов.

Особого внимания заслуживают особенности изменения ак­тивности аминотрансфераз при острых и хронических воспали­тельных процессах в печени.

Инфекционный гепатит (острый вирусный гепатит, тип А), клинически характеризующийся внезапной потерей аппетита, тошнотой, рвотой, лихорадкой, гепатомегалией и болезнен­ностью печени, встречается как в спорадической, так и в эпиде­мической форме. Заражение обычно происходит фекально-оральным путем, клинические симптомы появляются через 15— 45 сут после инфицирования. Гистологически заболевание харак­теризуется диффузной дегенерацией и некрозом печеночных клеток с некоторой мононуклеарной воспалительной инфильтра­цией их. Болезнь в типичных случаях длится недолго и заканчи-

вается полным выздоровлением. Возрастание активности АлТ при эпидемиях замечено за 1 —4 нед до клинических проявлений заболевания. Обычно активность ферментов увеличивается за не­делю до первых клинических симптомов, примерно у 50% боль­ных — за 5 сут до проявления желтухи или гепатомегалии и у 90% — за 2 сут до ее развития. Пик ферментативной активности, отмеча­емый за 7—10 сут до обнаружения максимального уровня билиру­бина в крови, в основном совпадает с появлением у больного желтухи и нередко соответствует наиболее тяжелому клиническо­му проявлению заболевания. В этот период активность трансами-наз в 10—100 раз (чаще всего в 20—50 раз) превышает средний нормальный уровень. У 90% больных активность АлТ оказывает­ся выше активности АсТ. Через несколько суток после появления желтухи активность обеих аминотрансфераз быстро снижается, и это предшествует нормализации уровня билирубина и других ме­таболических показателей функции печени.

В неосложненных случаях активность ферментов приближа­ется к норме в течение 2—5 сут после начала развития желтухи. У 75% больных нормальные значения устанавливаются в течение 8 нед заболевания. Темп снижения активности АсТ оказался боль­ше (за счет более быстрой инактивации), чем таковой АлТ. К 3-й нед заболевания активность АлТ нормализуется у 10% больных, тогда как активность АсТ — у 40%.

У незначительного числа пациентов примерно на 8-й нед за­болевания уровень активности ферментов после нормализации может снова увеличиваться, что говорит о рецидиве болезни.

Длительно продолжающееся увеличение активности транса-миназ или повышение ее в поздние сроки заболевания может оз­начать развитие массивного некроза ткани печени. Высокая ак­тивность АсТ, превышающая активность АлТ, предполагает об­ширный некроз и плохой прогноз (это происходит за счет осво­бождения митохондриальной АсТ). При разрыве печени может наблюдаться резкое падение трансаминазной активности, сопро­вождающееся ухудшением состояния больных (в отличие от про­цесса, наблюдаемого при выздоровлении).

Отмечаемое в течение длительного времени незначительное, выше верхней границы нормы, увеличение активности АлТ и АсТ свидетельствует о хроническом гепатите или циррозе печени.

Сывороточный гепатит (острый вирусный гепатит, тип В) клинически и гистологически сходен с инфекционным, от кото­рого отличается временным появлением антигена гепатита В при острой форме заболевания и образованием антител к антигену ге­патита В в периоде выздоровления. Клинические симптомы по­являются через 25—150 сут после попадания в организм инфек­ции. Клиническая тяжесть болезни выражена в большей степени, а смертность и частота осложнений выше, чем при инфекцион-

ном гепатите. Выраженность и динамика изменения активности ферментов такие же, как при гепатите А. Увеличение ее происхо­дит в продромальном периоде (за 12 нед до появления желтухи). Склонность к хроническому течению приводит к более длитель­ному повышению активности фермента.

Хронический гепатит определяется, если болезнь продолжает­ся без значительного улучшения по крайней мере 6 мес и гисто­логически проявляется как воспаление без признаков цирроза. Этиологическими факторами могут быть вирусная инфекция, аутоиммунные болезни, различные лекарства и алкоголь.

Гистологически различают хронический активный и персис-тирующий гепатит. Хронический активный гепатит сопровожда­ется повреждением ткани печени и развитием гипертензии в сис­теме воротной вены. У 90% больных наблюдается увеличение трансаминазной активности, уровень которой коррелирует с ди­намикой клинических проявлений (при обострении активность АлТ выше, чем АсТ). Стероидное и иммуносупрессивное лечение приводит к ее нормализации.

Хронический персистирующий гепатит может протекать бес­симптомно или клинически характеризоваться длительной уста­лостью, нарушениями со стороны желудочно-кишечного тракта и гепатомегалией. Гипербилирубинемия отмечается у половины больных. Гистологически выявляется воспалительная инфиль­трация портальных зон с очаговым клеточным некрозом. Болезнь часто проходит в течение года. Почти у всех больных увеличена (в 5—10 раз) активность трансаминаз, у 50% больных активность АлТ превышает таковую АсТ.

Увеличение активности трансаминаз отмечается при других инфекциях, обусловливающих гепатиты: инфекционном моно-нуклеозе, полиомиелите, герпесвирусной инфекции, малярии, лептоспирозе, а также при жировой инфильтрации печени (ГГТП значительно повышена).

Цирроз — морфологическое понятие, применяемое к распрос­траненному фиброзу печени, который сопровождается образова­нием узлов регенерации клеток паренхимы. Различают, в час­тности, алкогольный, постгепатитный, билиарный, застойный циррозы печени. Уровень активности трансаминаз при отдель­ных формах цирроза обычно превышает норму в 5—8 раз, актив­ность АсТ выше, чем АлТ, у 50—75% больных.

При желудочно-кишечных заболеваниях обычно наблюдаются нормальные значения активности фермента, если только патоло­гический процесс не затрагивает печень.

При ревмокардите, остром панкреатите, кровоизлиянии в мозг, дифтерии, опухолевом процессе активность ферментов в сыворотке крови и транссудатах умеренно повышается.

При гемолитической болезни активность АлТ в сыворотке кро­ви увеличивается.

Возрастание активности ферментов отмечается у больных, на­ходящихся на хроническом гемодиализе.

Если в плазме (сыворотке) крови практически здоровых лю­дей обнаруживается только цитозольный изофермент АсТ, то у больных, перенесших инфаркт миокарда, как и у пациентов с ге­патитом и активным цирротическим процессом, наряду с ним — также митохондриалъный изофермент АсТ.

Повышение активности аминотрансфераз можно отметить и у здоровых людей, находящихся на диете, богатой белком или со­держащей 25—30% сахарозы, а также у доноров. У 82% доноров с повышенным уровнем АлТ не было клинических проявлений ге­патита: антитела к вирусу гепатита В отмечены только у 2%. Ис­следование показало, что повышение активности АлТ в крови до­норов имеет такую же ассоциацию с гепатитом А или В, как и у реципиентов. Минимальная активность АсТ, которую можно рассматривать как критерий гепатита, составляет 105 Е/л, т.е. в 2,5 раза выше нормы. У 88% доноров активность АлТ не превы­шает 42 Е/л, у 2/3 — выше 63 Е/л.

Увеличение активности АлТ и АсТ может быть вызвано упот­реблением лекарственных препаратов, оказывающих слабовыра-женное (или клинически не выраженное) гепатотоксическое дей­ствие или холестаз. К ним можно отнести аспирин, индометацин, анаболические стероиды, оральные контрацептивы, ингибиторы моноаминоксидазы, тестостерон, прогестерон, андрогены, суль­фаниламиды, пиридоксин, барбитураты, препараты меди и желе­за; антибиотики (эритромицин, гентамицин, ампициллин, тетра­циклин, линкомицин).

Под влиянием пиридоксальфосфата (при применении новых методов с использованием в качестве реактива пиридоксальфос­фата) активность АлТ увеличивается на 15%, а АсТ — на 40%.

Определение активности фосфатаз

Фосфатазы, или гидролазы фосфомоно- и фосфодиэфиров, — ферменты, отщепляющие остаток фосфорной кислоты от ее ор­ганических эфирных соединений. Их делят на фосфомоно- (КФ 3.1.3) и фосфодиэстеразы (КФ 3.1.4).

Фосфомоноэстеразы, способные выступать и как фосфотран-сферазы, гидролизуют простые эфиры фосфорной кислоты. В за­висимости от рН, при котором проявляется их наибольшая фер­ментативная активность, различают кислую и щелочную фосфа­тазы.

Щелочная фосфатаза (фосфомоноэстераза I, КФ 3.1.3.1), или фосфогидролаза ортофосфорной кислоты, гидроли-зует разные синтетические субстраты при оптимуме рН 10,0.