Лабораторная работа 4
4.1. Изолирование митохондрий клеток печени (гепатоцитов)
Митохондрии из печени крыс изолируют по методу Джонсона и Ларди в холодной комнате при температуре 4 ºС. Необходимый инструментарий и используемые растворы (среды) также были охлаждают до температуры 4 ºС. 1. После эвтаназии животного печень быстро извлекают из брюшной полости и помещали в стаканчик со средой выделения (50 мл), находящийся в ледяной бане. После охлаждения (в течение 10 мин) печень осушают фильтровальной бумагой, взвешивают и продавливают через отверстия (диаметром 0,5 мм) ручного пресса.
2. Полученную таким образом гомогенную кашицеобразную массу из ткани печени переносят шпателем в стакан гомогенизатора и туда же вносят среду изолирования из расчета 5 мл среды на 1 г массы печени. Среду изолирования, содержащую 0,25 М сахарозы, 0,02 М Трис-HCl, 0,001 М ЭДТА, рН 7,2, готовят с использованием дважды дистиллированной воды.
3. Гомогенизацию ткани печени осуществляют с помощью тефлонового пестика в течение 60 с при 600 об/мин в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эвельгейма, помещенном в ледяную баню.
4. Приготовленные таким образом гомогенаты центрифугируют при 600 g в течение 10 мин при 4 ºС для осаждения ядер и обломков клеток.
5. Затем супернатант отделяют от осадка и подвергают центрифугированию при 8500 g в течение 10 мин при 4 ºС для осаждения митохондрий.
6. Супернатант вместе с жировым слоем удаляют, а полученный митохондриальный осадок ресуспендируют в таком же объеме среды выделения и повторно центрифугируют при 8500 g в течение 10 мин при 4 ºС.
7. После этого митохондрии ресуспендируют в небольшом объеме среды выделения для получения конечной концентрации белка 40 – 50 мг/мл и хранят на льду. Концентрацию белка определяют по методу Лоури.
4.2. Исследование мембранного потенциала митохондрий печени крыс с использованием флуоресцентного зонда сафранина о
Процедура измерения мембранного потенциала заключается в следующем: суспензию митохондрий (0,3 мг белка/мл) инкубируют при температуре 27 ºС в среде, содержащей 0,125 М сахарозы, 0,02 М Трис-HCl, 0,05 М КCl, 0,02 M KH2PO4, 0,005 M MgSO4, 0,001 M EDTA, рН 7,5 (могут использоваться и другие среды дыхания) в присутствии 8 мкМ флуоресцентного зонда сафранина О.
При использовании L-глутамата или α-кетоглутарата (5 мМ) в качестве субстратов дыхания происходит генерация мембранного потенциала благодаря активности I, III и IV комплексов электрон-транспортной цепи митохондрий. Мембранный потенциал, отражающий активность комплексов II, III и IV формируется при использовании в качестве субстрата сукцината (5 мМ) в присутствии блокатора I комплекса - ротенона (40 мкМ).
Интенсивность флуоресцентного зонда в суспензии митохондрий отражает величину митохондриального мембранного потенциала, т.е. степень истечения зонда из митохондрий. Внесение в суспензию митохондрий субстратов (глутамата, α-кетоглутарата, сукцината) приводит к тушению флуоресценции зонда сафранина О, что связано с формированием электрического потенциала на внутренней мембране митохондрий. Для получения максимальной интенсивности флуоресцентного сигнала зонда в суспензии митохондрий (для калибровки интенсивности флуоресцентного зонда от величины мембранного потенциала) используют протонофор 2,4-динитрофенол (36 мкМ) и блокатор цитохромоксидазы - азид натрия (5 мМ), полностью деполяризующие митохондриальную мембрану (рис. 1).
Рис. 1 Интенсивность флуоресценции зонда сафранина О в присутствии митохондрий печени крыс.
Примечание - Концентрация белка в суспензии митохондрий – 0,3 мг белка/мл. Среда измерения мембранного потенциала: 0,125 М сахароза, 0,02 М Трис-HCl, 0,05 М КCl, 0,02 M KH2PO4, 0,005 M MgSO4, 0,001 M ЭДТА, рН 7,5 в присутствии зонда (8 мкМ). Стрелками указано последовательное внесение компонентов в среду измерения.