Лабораторная работа 9. Биохимические аспекты биотехнологии

1. МТТ-тест

Для определения цитотоксичности различных соединений (в том числе и L-аспарагиназ), их способности влиять на жизнеспособность клеток и их рост, обычно используется МТТ-тест. Реактив МТТ представляет собой тиазолий синий тетразолий бромид (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-3,5-дифенилформазан).

Метод основан на том, что дегидрогеназы митохондрий только живых клеток конвертируют МТТ в окрашенные кристаллы формазана. Водонерастворимую соль формазана лучше всего растворять в диметилсульфоксиде (DMSO) для измерения оптической плотности раствора: 0,5%-ный раствор МТТ (ДиаЭм) готовят, растворяя навеску МТТ в растворе Хенкса на горячей водяной бане. Перед добавлением к клеткам раствор МТТ охлаждают приблизительно до 37°С. Флакон с раствором реактива МТТ заворачивают в черную бумагу и хранят в морозильнике.

Для проведения экспериментов по определению цитотоксичности препаратов L-аспарагиназ клетки пассируют в 96-тилуночные планшеты в 100 мкл среды и культивируют в СО₂ -инкубаторе при 37°С 24 часа. Затем добавляют препараты L-аспарагиназ и через 72 часа останавливают эксперимент.

Для проведения МТТ-теста к культивируемым клеткам добавляют 50 мкл 0,5%-ного раствора МТТ и клетки культивируют еще 3-4 часа при 37°С. С клеток, растущих в монослое, тщательно удаляют культуральную среду и кристаллы формазана растворяют в 0,1 мл DMSO при встряхивании на Titramax 101 в течение 10 мин. Клетки, растущие в суспензии, переносят в 96-тилуночные планшеты с коническим дном и осаждают в центрифуге Eppendorf 5810 R при 1000 g 5 мин. Супернатант удаляют, к осадку клеток добавляют 0,1 мл DMSO и после встряхивания планшетов на Titramax 101 в течение 10 мин. окрашенный раствор DMSO переносят согласно номерам проб в 96-тилуночные планшеты с плоским дном, в которых проводили культивирование и МТТ-реакцию, для того чтобы растворить кристаллы формазана в оставшиеся в лунках клетках. Планшеты опять помещают на Titramax 101 на 10 мин, после этого интенсивность окрашивания измеряют на мультискане («Lab. System», Финляндия) при длине волны 540 нм. Количество выживших клеток рассчитывают в процентах от контроля, которым являются клетки, культивированные без добавления препаратов.

2. Определение энзиматической активности рекомбинантной L-аспарагиназы проводят методом прямой несслеризации. Поскольку аспарагиназа хранится только в лиофилизированном, либо в растворе в замороженном состоянии при -20°С, а при последующем оттаивании теряет часть своей активности, необходимо проводить измерение активности фермента перед проведением экспериментов по определению ее цитотоксической противоопухолевой активности как in vivo, так и in vitro.

Метод основан на измерении концентрации аммиака высвобождаемого при гидролизе L-аспарагина. Одна единица активности фермента соответствует 1 мкмолю аммиака, высвобождаемого за 1 мин инкубации с L-аспарагином при 37°С и рН 8,5.

Реактивы:

При всех приготовлениях растворов и разведениях препаратов используется только деионизованная вода высокого качества.

1. 0,0125 М Na-фосфатный буфер, рН 8,5 (можно использовать 0,0125 М Na-боратный буфер, рН 8,5).

2. 0,2 М L-аспарагин в 0,0125 М Na-фосфатный буфере, рН 8,5.

3. 20%-ная трихлоруксусная кислота.

4. Реактив Несслера.

5. Стандартные концентрации аммиака. Растворить 107 мг хлорида аммония в объеме 100 мл.

Калибровочную кривую строят для концентраций NH₃ от 0,1 до 2,0 мкмолей.

Фирма Sigma в своем информационном бюллетене рекомендует следующий набор реактивов:

А. 50 мМ трис-буфер, рН 8,6 при37°С. Готовится 100 мл раствора в деионизованной воде; рН доводится при 37°С раствором 1М HCl.

Б. 189 мМ раствор L-аспарагина. Готовится в 10 мл деионизованной воды.

В. 6 мМ стандартный раствор сульфата аммония (NH₄ )₂ SO₄.

Г. 1,5 М раствор трихлоруксусной кислоты. Готовится в 10 мл деионизованной воды из 6,1 N раствора ТХУ.

Д. Реактив Несслера.

Е. Раствор аспарагиназы, содержащий 2,0 – 4,0 МЕ/мл после разведения исходного препарата в деионизованной воде.