4.3 Исследование респираторной активности изолированных митохондрий клеток печени с помощью полярографического метода
Для реализации данного метода используются кислородные электроды и полярографические ячейки различных типов, которые могут быть изготовлены и в лабораторных условиях.
Регистрация изменений напряжения кислорда (рО2) в суспензии митохондрий осуществляется с помощью электронных регистраторов (потенциометров), или же, в случае использовании адаптеров с встроенным аналогово-цифровым преобразователем, непосредственно на персональном компьютере. Калибровка электрода Кларка проводится 1) в течение эксперимента, путем последовательного продувания через ячейку воздуха (рО2 воздуха) и газообразного азота (рО2=0 мм рт. ст.), или 2) путем добавления в раствор, находящийся в ячейке, небольших количеств порошкообразного сульфита натрия, связывающего растворенный кислород.
Процедура исследования респираторной активности митохондрий включала следующие этапы: в ячейку вносили 3,0 мл среды инкубации и 0,1 мл концентрированной суспензии митохондрий, которые перемешивали с помощью магнитной мешалки. После этого ячейку закрывали модифицированной пробкой, вытесняя при этом воздух и избыточное количество суспензии, уменьшая при этом объем ячейки до 1,75 мл. Конструкция ячейки позволяет в анаэробных условиях вводить в суспензию через специальные каналы субстраты, АДФ и другие эффекторы.
Реактивы. Состав среды инкубации для исследования респираторной активности изолированных митохондрий печени крысы: 0,125 М сахароза, 0,02 М трис-HCl, 0,05 М КCl, 0,0025 M KH2PO4, 0,005 M MgSO4, 0,005 M EDTA, рН 7,5. Температура среды для исследования дыхания митохондрий не должна превышать 30 °С.
Регистрация респираторной активности митохондрий печени крысы и оценка результатов
Калибровка электрода. Электрод Кларка, расположенный в полярографической ячейке, перед каждым исследованием калибруется. После калибровки электрода в ячейку вносят среду инкубации в определенном объеме (3,0 мл), а затем добавляют 0,05-0,1 мл концентрированной суспензии митохондрий с содержанием белка 35-45 мг/мл. Конечная концентрация белка в суспензии митохондрий в ячейке должна составлять ~ 1,0 мг/мл. После этого ячейка закрывается специальной пробкой, что приводит к удалению из ячейки воздуха. Одновременно с этим осуществляют регистрацию количества поглощаемого митохондриями кислорода. На рисунке 2б представлена классическая кривая, отражающая метаболические состояния митохондрий (1-4) с соответствующими скоростями потребления кислорода митохондриями.
Рис. 2. Калибровочный график (а) и кривая поглощения кислорода (б) изолированными митохондриями печени крысы
Примечание – на рисунке 2 в части «а»: сО2 воздуха – содержание кислорода в воздухе (или растворе при рО2 воздуха), сО2 азота – содержание кислорода в газообразном азоте, принимаемое равным нулю; в части «б» стрелками слева направо обозначены моменты внесения в ячейку суспензии митохондрий, субстрата и АДФ, и выход дыхания в четвертое метаболическое состояние, соответственно.
Рассчитывают скорость дыхания митохондрий в различных метаболических состояниях. Как видно из представленной кривой:
1. После внесения в ячейку митохондрий наблюдается поглощение кислорода со скоростью V1. Это скорость базального (эндогенного) дыхания.
2. После введения в суспензию митохондрий субстрата (сукцината, малата/глутамата и др.) скорость поглощения кислорода возрастает и регистрируется скорость субстрат-стимулируемого дыхания V2.
3. После этого в ячейку добавляли AДФ и регистрировали скорость AДФ - стимулируемого дыхания V3 (скорость дыхания, сопряженного с фосфорилированием).
4. После фосфорилирования внесенного AДФ дыхание митохондрий замедляется, и регистрируется скорость V4, которая примерно соответствует по величине скорости V2.
Зная скорости поглощения кислорода в метаболических состояниях 2, 3, 4, можно рассчитать параметры, характеризующие сопряжение процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях: коэффициенты акцепторного контроля (V3/V2) и дыхательного контроля (V3/V4). Коэффициент фосфорилирования рассчитывается путем деления количества внесенного AДФ на количество поглощенного кислорода в 3-ьем метаболическом состоянии (рис. 2б).