1. Техника взятия смывов

Взятие смывов производится с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов. Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробирки с ватными пробками, заготавливают заранее в лаборатории. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливают (в условиях бокса над горелкой) по 5 мл стерильного 0,1% водного раствора пептона таким образом, чтобы ватный тампон не касался жидкости.

Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют средой.

Смывы с крупного оборудования и инвентаря берут с поверхности 100 см2, для ограничения поверхностей используют шаблон (трафарет), сделанный из проволоки. Трафарет имеет площадь 25 см2, чтобы взять смывы с площади в 100 см2 его накладывают 4 раза в разных местах поверхности контролируемого объекта.

При взятии смывов с мелких инструментов обтирается вся поверхность предмета, при заборе смывов с тарелок протирают всю внутреннюю поверхность. При взятии смывов с мелких предметов одним тампоном протирают три одноименных объекта— три тарелки, три ложки и т. п. У столовых приборов протирают их рабочую часть.

При исследовании стаканов протирают внутреннюю поверхность и верхний наружный край стакана на 2 см вниз.

При взятии смывов с рук протирают тампоном ладонные поверхности обеих рук, проводя не менее 5 раз по каждой ладони и пальцам, затем протирают межпальцевые пространства.

При взятии смывов с санитарной одежды протирают 4 площадки по 25 см2 — нижнюю часть каждого рукава и 2 площадки с верхней и средней частей передних пол спецовки. С различных мест полотенца берут 4 площадки по 25 см2.

6. Окраска по Граму является важнейшим дифференциально диагностическим признаком бактерий.

Очень важно все операции проделать правильно и точно по времени.

Необходимы 3 раствора:

1. Карболовый раствор генцианвиолета или кристаллвиолета / метилового фиолетового

Генциановый фиолетовый (син. генцианвиолет) - основной краситель фиолетового цвета, используемый для окраски гистологических и микробиологических препаратов и изготовления селективных питательных сред (вызывает бактериостаз грамположительных бактерий).

Метиловый фиолетовый (синонимы: основной фиолетовый К, метилвиолет). Фиолетовые кристаллы, растворим в воде, ограничено — в полярных органических растворителях. Смесь триарилметановых красителей схожего строения, получаемая окислением диметиланилина кислородом воздуха в присутствии СuSO4с последующей обработкой соляной кислотой. Окраска отличается яркостью, но малоустойчива к действию света. Краситель используют для изготовления полиграфических красок, фиолетовых чернил, копировальной бумаги, штемпельных красок, карандашей, лент для пишущих машинок, а также для получения фаналевых лаков. Применяется также как кислотноосновной индикатор (при рН 0,23,2 переход окраски от желтой фиолетовой). Применяется в гистохимии для метахроматического выявления амилоида, в бактериологии — для окраски по Граму.

2. Раствор Люголя (1 г кристаллического йода, 2 г иодида калия растворяют в 300 мл воды, дают отстояться 1 сутки).

3. Карболовый фуксин Циля, водный раствор

Фуксин (солянокислый розанилин) - зеленые кристаллы с металлическим блеском, водные растворы пурпурно-красного цвета. Краситель, малостойкий на свету. Один из первых синтетических красителей (получен в 1856 Я. Натансоном). Назван фуксином из-за сходства цвета с окраской цветов фуксии.

Результат: Грамположительные бактерии окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, грамотрицательные - в красный или коричневый в зависимости от красителя; ядра клеток — ярко-красные, цитоплазма — розовая.

7. При окраске по НЕЙССЕРУ гранулы ВОЛЮТИНА у дифтерийных коринебактерий окрашиваются в сине–черный, а бактерия – в желтый цвет. Мазок окрашивают: 1) 1 мин уксуснокислым метиленовым синим (метиленовый синий – 0,1 г, спирт – 2 мл, ледяная уксусная кислота – 5 мл, дистиллированная вода – 100 мл); 2) сливают краситель и мазок промывают водой; 3) на 20– 30 с наносят раствор Люголя; 4) 1 –3 мин окрашивают везувином (прокипяченная и отфильтрованная взвесь 2 г везувина в смеси 60 мл спирта и 40 мл дистиллированной воды).

8. Окраска спор

Вследствие непроницаемости оболочки споры не воспринимают окрашивания. Однако при воздействии соляной кислоты оболочка теряет устойчивость, и поэтому краска проникает в споры.

Окраска по способу Ожешко. Приготовленный на краю предметного стекла препарат просушивают и, не фиксируя, погружают для протравы на 2—3 минуты в чашку с 1 % кипящей соляной кислотой. После этого мазок промывают водой, обсушивают, фиксируют на пламени и красят карболовым фуксином через фильтровальную бумажку с подогреванием.

Остывший освобожденный от бумажки препарат обесцвечивают 5% серной кислотой, смывают водой и докрашивают дополнительной метиленовой синькой в течение 3—5 минут, затем смывают водой и высушивают.

Споры принимают ярко-красный цвет фуксина. Вегетативное тело бактерии, обесцвеченной серной кислотой, окрашивается дополнительной краской в синий цвет.

9. Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.

Методика окраски:

1. На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в в пламени до появления паров. Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава.

2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают.

3. Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты. Серная кислота-обесцвечивающий фактор.

4. Промывают водой

5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут Синька Леффлера — дополнительная краска

6. Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново- красного цвета, а остальная микрофлора — синего цвета

10. Для обнаружения КАПСУЛ бактерий, плохо воспринимающих красители, используют метод БУРРИ–ГИНСА: в каплю туши, разведенной в 10 раз водой, вносят исследуемые бактерии и равномерно распределяют их петлей по предметному стеклу; мазок высушивают, фиксируют (наносят 2–3 капли спирта и сжигают его на стекле), окрашивают в течение 3–5 мин фуксином Пфейффера, промывают водой, высушивают; на темном фоне препарата капсулы видны в виде светлых ореолов вокруг красных бактерий.

11. Механическое фильтрование

Органические жидкости не выносят нагревания, освобождают от бактерий, пропуская через стерильные мелкоячеистая фильтры. Эти фильтры задерживают микроорганизмы, их называют бактериальными фильтрами. Широко применяются асбестовые и мембранные фильтры с различным диаметром пор. Применяются также фарфоровые (из кварцевого песка и каолина), стеклянные и фильтры с инфузорной земли (с диатомита или кизельгура). Фильтры выпускаются под номерами и марками. Асбестовые фильтры выпускаются с диаметром 35 и 140 мм, различают фильтрующую и стерилизуя марки. Мембранные фильтры (с нитроклетчатки или ацетилцеллюлозы) имеют номера 1-5, соответственно размеры пор 350-1200 нм. Перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют кипячением или в автоклаве. Фильтры помещают в теплую дистиллированную воду и кипятят 30 минут, меняя ее 2-3 раза.

12. Химическая стерилизация

Применяются химические дезинфицирующие вещества. Обычно носит не предсказуемый результат для продуцентов и конечных продуктов, не имеет широкого применения в биотехнологических производствах.

13. Стерилизация сухим жаром (печь Пастера)

Сухим жаром стерилизуют в основном стеклянную посуду. Чтобы избежать заражения предметов простерилизованные, с воздуха, их перед стерилизацией заворачивают в оберточную бумагу и вынимают из нее только перед работой. Метод предусматривает бактерицидное действие нагретого воздуха до 165-180ºС, при большей температуре будет идти обугливания бумаги в который завернут посуду.

14. Стерилизация текучим паром (автоклав или аппарат Коха)

Питательные среды с углеводами и витаминами, молоко, солод, желатина и другие объекты, которые портятся от воздействия сухого жара, подвергают стерилизации текучим паром. Стерилизации текучим паром производят кипятильнике Коха или в автоклаве с открытым вентилем. Воду в них доводят до кипения, и образующийся пар, обтекает объекты. Температура питательных сред, стерилизуются, достигает 100 ° С (80-90 ° С). Нагрев течение 20-45 минут приводит к гибели вегетативных клеток бактерий, но споры их не погибают. На следующий день нагрева повторяют. В этих условиях погибают вегетативные клетки, развивающиеся из спор. Для обеспечения полной стерильности жидкость оставляют еще на сутки и снова повторяют нагревание.

15. Стерилизации контроль. Эффективность С. контролируется механическими, хим. и биол. м-дами. Механический контроль состоит в визуальном и инструментальном контроле за всеми параметрами стерилизации. Измерительная аппаратура, в свою очередь, должна периодически контролироваться в государственном метрологическом учреждении. Хим. контроль проводят с помощью хим. индикаторов, изменяющих цвет или плавящихся при достижении определенного уровня температуры, влажности, концентрации стерилизующего агента. Наружные индикаторы в виде стерилизационной ленты (окрашенной или нет) наносят на упаковку простерилизованного предмета, они указывают на то, что предмет прошел стерилизацию, внутренние хим. индикаторы свидетельствуют о том, были ли стерилизуемые объекты подвергнуты действию одного или нескольких условий стерилизации, но не о стерильности объекта. Показатели внутренних хим. индикаторов снимаются после окончания стерилизации. Биол. контроль прямо указывает, произошло уничтожение микробов в процессе стерилизации или нет, т. е. стерильный или нестерильный объект. Для паровой стерилизации в качестве биол. индикатора (БИ) используют споры В. stearotbermophilus (100 тыс. - 1 млн), для стерилизации этиленоксидом - В. subtilis в таком же количестве. Менее стандартные результаты дает «споровая почва». Упаковки для размещения Б И должны быть сконструированы таким образом, чтобы их обработка была более затруднена по сравнению с др. предметами для стерилизации, а количество и устойчивость Б И превышала аналогичные показатели микроорганизмов, находящихся в стерилизуемых объектах. Все это вместе взятое повышает коэффициент безопасности стерилизации. После стерилизации БИ извлекают из упаковки и проверяют споры на выживаемость с помощью микробиол. техники или по изменению цвета специальной упаковки. Контроль хим. стерилизации, а также стерильности различных материалов проводят посевом в сахарный бульон Хоттингера, тиогликолевую среду и в бульон Сабуро кусочков стерилизуемых материалов или смывов с предметов; мелкие предметы выборочно погружают в среды; пробирки, матрацы заполняют средами. Отсутствие роста в ходе 14-дневной инкубации при 37°С в сахарном бульоне и тиогликолевой среде и при 20 - 22°С бульона Сабуро свидетельствует о стерильности материала; появление роста хотя бы в одной из сред - нестерильности всей партии. Материалы, подвергнутые хим. стерилизации, перед посевом несколько раз отмывают стерильной водой от стерилизанта или засевают на среды с его нейтрализатором.

16. Питательные среды в микробиологии

Требования к питательным средам:

1. Питательные среды должны содержать универсальные источники углерода, азота.

2. Они должны являться источником витаминов и минералов.

3. В средах рН должно поддерживаться на постоянном уровне, что обеспечивается наличием в питательных средах буферных систем.

4. Питательная среда должна быть стерильной.

5. Питательная среда должна быть прозрачной.

6. В ней должна быть оптимальная концентрация кислорода и углекислого газа.

Классификация питательных сред для бактерий

1. По консистенции. По консистенции все питательные среды делят на жидкие, полужидкие и плотные. Для жидких питательных сред основой является мясная вода, гидролизаты белков, либо естественные продукты (кровь, молоко). Среды приобретают плотную консистенцию за счет добавления в них агара. В полужидкие среды также добавляют агар, но его значительно меньше, чем в плотных питательных средах.

2. По происхождению. По происхождению все среды делят на искусственные и естественные. Основу искусственных питательных сред составляют пептоны, а естественные представлены молоком, кровью, могут включать кусочки фруктов и т.д.

3. По назначению. По назначению все среды делят на универсальные, дифференциально-диагностические, селективные и специальные. На универсальных питательных средах хорошо растут все бактерии (точнее большинство). Примером универсальных питательных сред являются мясо-пептонный бульйон и мясо-пептонный агар. Дифференциально-диагностические среды позволяют отличать один вид бактерий от другого вида по их ферментативной активности или культуральным свойствам. Дифференциально-диагностическими являются среды Гиса, Кларка, Эндо, Плоскирева. Селективные среды позволяют отбирать определенные виды бактерий, так как содержат вещества угнетающие рост остальных бактерий, но при этом способствующие росту данного вида бактерий. Селективные среды называют также элективными, избирательными или обогатительными. Примером селективных сред являются 1% пептонная вода и среда Мюллера. Специальные среды предназначены для роста бактерий, которые не растут на универсальных питательных средах. Примером специальных сред являются среда Мак-Коя-Чепина (для возбудителя туляремии), среда Левенштайна –Йенсена (для микобактерии туберкулеза), кровяной мясо-пептонный агар (для стрептококков).

17. Посев на плотные питательные среды (в пробирке)

При посеве берут пробирку в левую руку, а правой, плотно обхватив пробку четвёртым и пятым пальцами, вынимают её. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, в вертикальном положении её вносят в открытое пламя и прожигают до красного каления. Остывшей петлёй набирают посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой, предварительно пронося её над пламенем спиртовки. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская её до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают её пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив рукояткой вниз. Пробирки с посевами подписывают заранее, указывая дату посева, номер исследования и название культуры.