18. Среда Сабуро — с добавлением антибиотика

Kачественный метод. В лаборатории мокроту выливают в чашку

Петри, выбирают 2-3 гнойных комочка, которые однократно отмывают в

физиологическом растворе, после чего засевают на кровяной и

желточно - солевой агары, среды Эндо и Сабуро. Посев производят

стерильным стеклянным шпателем, равномерно растирая материал на

поверхности питательной среды. На чашку с кровяным агаром сразу же

после посева накладывают диски с антибиотиками (стрептомицином,

пенициллином, тетрациклином, эритромицином и левомицетином), что

позволяет получить экспресс - информацию о лекарственной

чувствительности преобладающей в посеве микрофлоры. На второй день

учитывают количество выросших колоний (этиологически значимым

считается рост более 50 колоний), однородность популяции и

лекарственную чувствительность при росте их в монокультуре.

19. Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля^^Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри—металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой вынимают из нее ватную пробку над пламенем горелки, набирают петлей посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой, жак описано на с. 23. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры).

При работе с пипеткой прежде всего ее освобождают от бумаги или вынимают из пенала, быстрым движением проводят над пламенем горелки, вводят в пробирку и остужают об ее внутреннюю сторону. Затем всасывают посевной материал ртом и, соблюдая описанные выше правила, выдувают его в пробирку или другую лабораторную посуду.' Микробную культуру безопаснее всасывать через резиновую трубку или с помощью резиновой груши. Отработанную пипетку опускают в банку с дезинфицирующим раствором. Таким же образом производят посевы пастеровскими пипетками, предварительно обламывая запаянный конец.^

Посевы газоном производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. При этом крышку придерживают левой рукой и одновременно вращают чашку, не отрывая ее от стола. После инкубации посева появляется равномерно сплошной рост бактерий.

20. Для выделения анаэробных возбудителей инфекционных болезней создаются анаэробные условия культивирования. Для этого существуют несколько методов.

1. Физический метод. Он заключается в удалении воздуха из эксикатора или анаэростата при помощи масля­ного воздушного насоса. Жидкие среды перед засевом для удаления из них воздуха кипятят, то есть проводят так на­зываемое регенерирование среды; для предотвращения кон­такта жидкой среды с воздухом на ее поверхность наносят слой вазелинового или парафинового масла.

2. Химический метод. Основан на применении по­глотителей кислорода, например, пирогаллола с гидроокисью натрия, калия либо гидросульфита натрия с гидрокарбонатом натрия в соотношении 1:1.

3. Биологический метод (метод Фортнера). Осно­ван на выращивании анаэробов ъ присутствии аэробов (на­пример, «чудесной палочки») в одной чашке Петри. Вначале вырастает аэробная культура, а затем по мере поглощения последней кислорода из чашки начинает развиваться ана­эробная культура.

4. Комбинированный метод. Предусматривает ис­пользование двух других, скажем, физического и хими­ческого.

Нередко удается ослабить или полностью нейтрализовать вредное для бактерий действие кислорода путем прибавления к среде восстановителей (аскорбиновой кислоты, тиогликола-та, цистеина).

23. № 13 Основные принципы культивирования бактерий.

Универсальным инструментом для производства посевов явля­ется бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом при­меняют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пасте­ровские и градуированные пипетки. Первые предварительно из­готовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец ка­пилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец за­крывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая дру­гими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной ма­териал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней ча­сти среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного мате­риала (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, пет­лей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горел­ки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

24. Среда Ресселя (Рассела) применяется для изучения биохимических свойств энтеробактерий(шигелл, сальмонелл). Содержит питательный агар-агар, лактозу, глюкозу и индикатор (бромтимоловый синий). Цвет среды травянисто-зелёный. Обычно готовят в пробирках по 5 мл со скошенной поверхностью. Посев осуществляют уколом в глубину столбика и штрихом по скошенной поверхности.

АГАР КЛИГЕРА (Трехсахарный Агар) КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ И ОБЪЯСНЕНИЕ

Агар Клиглера используется для определения ферментации углеводов и освобождению сероводорода для идентификации грамотрицательных бактерий. . Хайна разработал формулу для Агара Клиглера, добавив сахарозу к формуле двойного сахара (декстроза и лактоза) Железосодержащего агара Клиглер. Добавление сахарозы увеличило чувствительность среды, облегчив выявление сахароза – ферментирующих бактерий, а также ферментеров лактозы и/или декстрозы. Ферментация углевода определяется присутствием газа и видимым изменением цвета рН индикатора (красного фенола) от красного к желтому. Производство сероводорода выявлено присутствием осадка, который делает темной среду в столбике пробирки.

Клиглер Агар содержит три сахара (декстроза, лактоза и сахароза), красный фенол для определения ферментации углевода и железистый сульфат аммония для определения производства сероводорода . Ферментация углевода определяется выделением газа и изменением цвета индикатора от красного к желтому. Для облегчения определения микроорганизмов, которые ферментируют только декстрозу, концентрация декстрозы является одной десятой частью концентрации лактозы и сахарозы. Маленькое количество кислоты, полученной на скосе агара в пробирке в течение ферментации декстрозы, быстро окисляется, что приводит к сохранению красного цвета среды или возвращению к щелочной рН. Напротив, кислая реакция (желтая) видна в столбике пробирки, поскольку находится под более низким кислородным давлением. По мере убывания декстрозы, организмы, способные к этому, начинают использовать лактозу или сахарозу. Чтобы увеличить щелочное состояние скошенного агара, необходимо обеспечить свободный обмен воздуха, неплотно закрыв крышку пробирки. Если пробирка плотно закрыта, кислотная реакция (вызванная только ферментацией декстрозы) также затрагивает и скошенный агар.

Среда Олькеницкого. В 500 мл дистиллированной воды растворяют

7,5 г лактозы х.ч., 1,75 г сахарозы х.ч., 1 г глюкозы х.ч., 5 гр.

мочевины х.ч., 0,3 г железа сернокислого закисного (соль Мора) и

0,5 г гипосульфита, устанавливают рН 7,4-7,6. Добавляют 23 г сухой

среды с сахарозой и индикатором ВР. Все размешивают, кипятят,

фильтруют, разливают по пробиркам так, чтобы длина столбика и

скоса агара были равны. Стерилизуют при 0,5 атм. 20 минут.

Готовая среда имеет серовато - розоватый цвет. При ферментации

глюкозы и лактозы среда синеет, при разложении мочевины -

приобретает оранжевое окрашивание, при образовании сероводорода

появляется почернение на дне пробирки.

25. Протеолитические ферменты микробов. Некоторые виды микроорганизмов продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты — протеазы, катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада — пептоны, альбумозы и полипептиды. Под действием других протеолитических ферментов пептоны в свою очередь расщепляются на полипептиды (соединения двух или нескольких аминокислот) и отдельные аминокислоты. Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок.

Чаще всего для этой цели применяют желатин, реже — свёрнутую лошадиную сыворотку, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса. Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов. Поэтому для разных видов микробов рекомендуют питательные среды различного состава. Определение протеолитической активности микробов, а) На желатине. Мясо-пептонный желатин (рец. 50) разливают в пробирки столбиком по 5— 6 мл. Посев производят уколом, погружая петлю с исследуемой культурой в глубь питательной среды до дна пробирки. Микробы, способные расти при низкой температуре, оставляют стоять в комнате при 20—22 °С. Остальные посевы инкубируют в термостате при 37 °С. Вместе с опытными пробирками в термостат ставят одну или две пробирки с незасеянным желатином для контроля. При температуре 37 °С желатин плавится, поэтому после инкубации пробирки, вынутые из термостата, опускают в холодную воду или ставят в холодильник. После застудневания желатина в контрольных пробирках приступают к просмотру роста и учету изменений в питательной среде опытных пробирок.

26. Методы исследования, связанные с применением животных, называются биологическими, или экспериментальными, а используемые для этой цели животные — экспериментальными, или лабораторными. Наиболее широко в микробиологических лабораториях используют кроликов, морских свинок, белых мышей и крыс. Лабораторные животные являются донорами, у которых' систематически берут кровь для получения сыворотки, плазмы, эритроцитов, лейкоцитов, необходимых при постановке многих серологических реакций и для приготовления кровяных питательных сред. Лабораторные животные служат также для диагностики некоторых инфекционных заболеваний, моделирования экспериментальных острых и хронических инфекционных процессов, установления вирулентности и токси-генности изучаемых штаммов микробов, определения активности приготовленных вакцин и исследования их на безвредность.

27-29. Методы культивирования вирусов. Для культивирования ви¬русов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чув¬ствительных лабораторных животных. Культуры клеток. Представляют собой соматические или эмбриональные клетки животных или человека, культиви¬руемые в лабораторных условиях. В культурах клеток удается культивировать большинство вирусов, вызывающих заболевания человека.Внутриклеточные паразиты оказывают цитопатическое дей¬ствие (ЦПД)

на клетки, в которых происходит их репродукция. ЦПД может проявляться деструкцией (лизисом) зараженных клеток, изменением их морфологии (изменением размеров и формы самой клетки, клеточного ядра, появлением вакуолей или включений) и нарушением их функций. Куриные эмбрионы. Пригодны для культивирования хламидии, рик-кетсии и некоторых вирусов, патогенных для человека. Для получения чистых культур риккетсии, хламидии и ряда вирусов в диаг-ностических целях исполь¬зуют 8—12-

дневные куриные эмбрионы. К недостаткам данно¬го метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона. Для заражения куриных эмбрионов исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости в желточный мешок куриного эмбриона. Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных, их возраст определяют репродуктивную способ¬ность вирусов. Преимущество метода культивирования вирусов в ор¬ганизме лабо

раторных животных перед другими состоит в воз¬можности выделения тех вирусов, которые плохо репродуци¬руются в культуре клеток или эмбрионе. К его недостаткам относятся высокая вероятность контаминации организма по-допытных животных посторонними вирусами.

30. Определение чувствительности микробов к антибиотикам методом «бумажных дисков». Этот способ наиболее доступен для практических целей. В стерильные чашки Петри диаметром 10—11см наливают по 20 мл агаровой питательной среды с рН 7,1—7,3. Можно взять 2%-ный мясопептонный агар, а также 1%-ный или 2%-ный агар на переваре Хоттингера, содержащий 110—130 мг% аминного азота. Для получения равномерного «бактериального газона» в чашки Петри с застывшим агаром наливают 1 мл двухмиллиардной суспензии испытуемой культуры (по бактериальному стандарту). Жидкость равномерно распределяют по агару покачиванием чашки Петри.

31-32. Метод серийных разведений в плотных средах во многом аналогичен методу разведений в жидких средах, но определение МБК требует более сложных манипуляций. Готовят двойные серийные разведения препарата от 1:10 000 до 1:320 000, затем вносят по 1 мл каждого разведения в пробирки, содержащие по 4 мл (или 9 мл) охлаждённого до 45 °С агара. Процедуру проводят одной пипеткой с перенесением препарата от меньшей концентрации к большей. Содержимое пробирок можно быстро внести в чашки Петри, либо пробирки «скашивают» до застывания агара. Затем агар засевают исследуемой стандартизированной тест-культурой (петлёй или специальным дозатором, засевающим чашку 36 видами различных микроорганизмов) и инкубируют 18-20 ч при 37 "С. После инкубации определяют МИК по отсутствию роста на чашках (пробирках), содержащих наименьшие концентрации препарата.

33. Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом—исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм Staph, aureus, а при определении стрептомицина—Е. coli. После инкубирования посевов при 37°С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий,— 0,313 мкг/мл, то произведение 1024-0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.

34. Метод Аппельмана основан на внесении различных количеств титруемого бактериофага в бульон, засеянный одной и той же дозой культуры гомологичных микробов, с целью получения феномена бактериофагии.

Двенадцать пробирок, содержащих по 4,5 мл мясо-пеп-тонного бульона, ставят в штатив в один ряд. В 1-ю пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 мл исследуемого фага. Содержимое пробирки перемешивают и 0,5 мл жидкости из 1-й пробирки переносят во 2-ю, из 2-й — в 3-ю и т. д. до 10-й включительно. Из 10-й пробирки лишние 0,5 мл выливают1; 11-я и 12-я пробирки контрольные. Переносят жидкость из одной пробирки в другую каждый раз отдельной стерильной пипеткой емкостью 1 мл. Таким образом, в 10 пробирках получают разведения бактериофага от 1 : 10 до 1 : Ю-10. Во все 10 пробирок приготовленного ряда разведений вносят по 0,2 мл 18—24-часовой бульонной культуры бактерий, одноименных титруемому фагу.

35. .Проба Отто. Сущность метода – доказательство присутствия фага – в месте попадания фага роста чувствительной культуры, появление мелких стерильных пятен (негативных колоний фага)

Изучено действие растворов кислоты, щелочи, дезинфицирующих средств, УФ-излучения на вновь выделенные бактериофаги. Показано, что для снижения титра бактериофагов следует использовать комбинированное воздействие инактивирующих факторов. Наибольший эффект достигали при использовании средства «Divosan Forte» и проведении обеззараживания воздуха.

Метод Фишера (метод фаговых дорожек) – отсутствие роста чувствительной культуры в месте стекания капли с исследуемым фагосодержащим материалом

36. В основу фаготипирования положен принцип совместного выращивания типируемой культуры с типовым бактериофагом. Наступление лизиса определяет типовую принадлежность бактерий. Для фаготипирования бактерий применяют 1,5% МПА с 5% глицерина. Пророщенную бульонную культуру каплями наносят на поверхность питательной среды. Капли не должны растекаться. Они должны впитаться в течение 3—10 мин.

Затем на поверхность каждой капли наносят по 1 капле типового фага с таким расчетом, чтобы часть культуры оставалась свободной от воздействия бактериофага (для контроля роста культуры). Чашки помещают в термостат при температуре 37°С: через 6—8 часов производят учет результатов фаготипирования.

37. Определение возбудителя

Ориентировочная реакция агглютинации на стекле. К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1 : 20) добавляют взвесь бактерии, выделенных от больного животного. Образуется хлопьевидный осадок.

Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного животного. К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного.

Определение антител в сыворотке крови

Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови. К разведениям сыворотки добавляют диагностикум.

Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие O- антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.

Агглютинация с Н - диагностикумом (бактерии, убитые формалином,сохранившие жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

38.Пассивные реакции агглютинации. Непрямые реакции агглютинации. Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации ( РНГА, РПГА ). Обратная РНГА. Реакция торможения пассивной гемагглютинации ( РТПГА ).

Эти реакции называются непрямыми (пассивными), так как при их проведении используют Аг (или AT), искусственно сорбированные на поверхности различных корпускулярных частиц.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации (РНГА, РПГА) — одна из наиболее чувствительных серологических реакций. Основана на способности AT взаимодействовать с Аг, фиксированными на различных эритроцитах, которые при этом агглютинируют. Для большей стабильности диагностикумов эритроциты формалинизируют.

(41)Обратная РНГА применяется для выявления Аг в сыворотке крови; для этого на эритроцитах фиксируются не Аг, a AT. Реакции этого типа широко применяют для диагностики инфекционных болезней, установления беременности, выявления повышенной чувствительности к лекарствам и т.д.

Реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) — дальнейшее развитие РНГА; в некотором смысле контролирует её специфичность. В отличие от РНГА, включает три компонента; Аг, AT и Аг (AT), адсорбированные на эритроцитах. Первоначально Аг реагирует с AT (стандартная антисыворотка), затем в смесь вносят эритроциты, сенсибилизированные аналогичным Аг (или AT). Если при взаимодействии Аг с AT в системе не остаются свободные AT (или Аг), то агглютинации эритроцитарного диагностикума не наблюдают.