39. Реакция Кумбса. Выявление неполных антител ( at ). Метод латекс-агглютинации. Реакция латекс-агглютинации.

Реакция Кумбса. Метод выявляет неполные (одновалентные) AT, образующиеся при бруцеллёзе, резус-конфликте или системных коллагенозах. Реакция также известна как антигло-булиновый тест. Для постановки реакции необходима антиглобулиновая сыворотка, содержащая полные (как минимум двухвалентные) AT.

Неполные AT предварительно инкубируют с корпускулярным Аг и вносят антиглобулиновую сыворотку. Одна молекула полных AT взаимодействует с двумя молекулами неполных AT, связавших Аг, в результате происходит видимая агглютинация или гемагглютинация (рис. 10-15).

(40)Метод латекс-агглютинации. В последние годы ассортимент диагностикумов из убитых микробов дополнили так называемые суспензионные Аг и AT, сорбированные на различных инертных корпускулярных носителях. Среди них наибольшее распространение нашёл метод латекс-агглютинации, основанный на взаимодействии Аг (или AT) в образце с частицами латекса, нагруженными специфическими моноклональными AT (или Аг), что ведёт к быстрому образованию видимых агрегатов.

Учёт результатов проводят через 10-15 мин при косом освещении на тёмном фоне. Разработаны коммерческие диагностикумы для выявления Аг Streptococcus pneumoniae, стрептококков группы В, Haemophilus influenzae типа b и капсулированных штаммов менингококка в различных тканевых жидкостях (СМЖ, сыворотке крови, моче). Также имеются наборы для выявления Аг стрептококков группы А в мазках из зева; для первичной экспресс-идентификации колоний стрептококков групп А, В, С, F, энтерококков, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типов a-f, золотистого стафилококка, Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae.

40. Реакция адсорбции агглютининов. Реакция коагглютинации. Схема реакции коагглютинации.

Если различные бактерии имеют одинаковые или похожие по структуре Аг, то их агглютинируют одни и те же антисыворотки. Для облегчения идентификации таких Аг используют реакцию адсорбции агглютининов, основанную на способности Аг родственных бактерий адсорбирвать из сыворотки крови только групповые AT, сохраняя в ней типоспецифические AT. Полученные антисыворотки называют монорецепторными, так как они содержат AT только к одному Аг.

Для адсорбции агглютининов применяют взвесь убитых бактерий; если они убиты нагреванием, то адсорбируются остающиеся интактыми О-агглютинины, если формалином, то Н-агглютинины [Н-Аг (жгутиковые) не чувствительны к формалину].

Она основана на способности белка А золотистого стафилококка неспецифически связывать Fc-фрагменты Ig. В подобных ситуациях стафилококки играют роль частиц с сорбированными на их поверхности AT. При внесении в систему соответствующих Аг с ними взаимодействуют Fab-фрагменты AT и образуются агрегаты из стафилококков, диагностических AT и исследуемых микробных Аг (рис. 10-14).

41->38

42. Реакция иммунофлюоресценции - РИФ (метод Кунса).Различают три разновидности метода прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

43. Реакции aгглютинации - простые по постановке реакции склеивания корпускулярных антигенов (микробов, эритроцитов и других клеток, а также индифферентных корпускулярных частиц с адсорбированными на них антигенами) с помощью антител. Их используют для определения антител в сыворотке крови больных, напр. при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта, Хаддлсона), туляремии и других инф. болезнях, а также для определения возбудителя, выделенного от больного. Для выявления антител к разведениям сыворотки крови больного добавляют взвесь убитых микробов (диагностикум) и через определенное время при t° 35е отмечают наибольшее разведение (т. е. титр) сыворотки, при к-ром произошла агглютинация.

При определении возбудителя ставят ориентировочную реакцию агглютинации на предметном стекле: к капле диагностической иммунной сыворотки в разведении 1:10,1: 20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больного. Если появляется хлопьевидный осадок, реакцию ставят с увеличивающимися разведениями диагностической сыворотки, добавляя в каждую дозу сыворотки 2-3 капли взвеси микробов. Реакцию считают положительной, если агглютинация идет до разведения, близкого к титру диагностической иммунной сыворотки. В контролях (сыворотке, разведенной изотоническим раствором хлорида натрия, или взвеси микробов в том же растворе) осадок в виде хлопьев должен отсутствовать.

44. X3

45. X3

46. Реакция бактериолиза состоит в том, что при соединении специфической иммунной сыворотки с соответствующими гомологичными ей живыми бактериями в присутствии комплемента происходит лизис микробов. Реакцию бактериолиза можно наблюдать как в пробирке (in vitro), так и в организме животного (in vivo). Эту реакцию используют при диагностике холеры. При постановке реакции бактериолиза в пробирках соединяют выделенную у больного культуру вибриона, специфическую им¬мунную противохолерную сыворотку и комплемент. Результаты учитывают после двухчасового выдерживания в термостате при 37°С путем посева материала, взятого из пробирки, на мясо-пептонный агар.

При постановке реакции бактериолиза на морских свинках (феномен Исаева — Пфейффера) смесь выделенной культуры вибриона со специфической иммунной сывороткой вводят внутрибрюшинно.

При соответствии выделенной культуры и иммунных антител происходит гибель, растворение микроба. Это можно установить микроскопией мазков, взятых из экссудата, или при посеве на мясо-пептонный агар (отсутствие роста).

Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии на эритроциты специфической, иммунной по отношению к ним сыворотки в присутствии комплемента наблюдается их растворение, гемолиз. Жидкость, мутная от наличия эритроцитов, становится ярко-красной и прозрачной («лаковая» кровь).

Действие иммунной, гемолитической сыворотки строго специфично. Гемолиз эритроцитов в присутствии сыворотки наступает только при наличии комплемента. Реакцию гемолиза используют в лабораторной практике в диагностической реакции связывания комплемента (РСК).

47. Реакция бактериолиза по методике Исаева — Пфейффера ставится на двух свежих морских свинках. Одной свинке вводят внутрибрюшинно взвесь 18-часовой агаровой культуры холерного вибриона в бульоне, содержащем 0,001—0,002 мл антихолерной сыворотки высокого титра. Контрольной свинке вводят аналогичную взвесь, содержащую 0,01 мл нормальной сыворотки.

Через 20—40—60 минут перитонеальная жидкость исследуется под микроскопом. При положительном результате, когда исследуемый вибрион является холерным, он теряет подвижность, разбухает, превращается в шарообразные мелкие образования и затем исчезает.

48. Варианты постановки реакции преципитации. Реакция преципитации (серологическая р-ция) – это осаждение а/г из раствора в присутствии электролита. Компаненты: 1. А/г в коллойдном состояние (экстракт из клеток, моллекулы белка, полисахариды). 2. А/т – преципитирующаяся сыворотка (экстракт из клеток или отдельными а/г ). 3. Электралит 0,9% NаСl (чтобы реакция стала видимой ). Реакция сверхчувствительная и позволяет определить следы а/г или а/т. Варианты постановки:1 Реакция кольцепреципитация –

при положительной реакции на границе между сывороткой (а/т) и а/г появляется преципитат в виде белого кольца. 2 Реакция преципитации в геле – чашки заливают агаром, в котором вырезают несколько лунок. В центральную лунку вносят сыворотку содержащую а/т, а в остальные различные а/г. При диффузии реагентов в агаре, на месте встречи а/г и а/т образуются мутные полосы – усы преципитации. 3 Реакция термоприципитации – основана на термостабильности а/г, который получают путем кипячения (сибирская

язва, чума).

49. Реакции иммобилизации

Реакции иммобилизации основаны на способности специфических AT, циркулирующих в сыворотке больных, подавлять (нейтрализовать) подвижность различных микроорганизмов.

На практике применение нашли реакции иммобилизации бледной трепонемы и холерного вибриона.

50. Реакции нейтрализации (РН) основаны на способности AT связывать различные возбудители или их метаболиты, лишая тем самым их возможности реализовать свои биологические свойства (иными словами, AT нейтрализуют возбудителей). На практике РН применяют для выявления вирусов и различных токсинов. В определённой степени к ним же относят реакции торможения вирусиндуцированной гемагглютинации и иммобилизации.

Реакции нейтрализации вирусов

В сыворотке крови переболевших лиц циркулируют AT, нейтрализующие вирусы. Их наличие выявляют смешиванием культуры возбудителя с сывороткой с последующим введением лабораторному животному или заражением культуры клеток. На эффективность нейтрализации указывает выживание животного либо отсутствие гибели клеток в культурах.

Реакции нейтрализации токсинов

Реакции нейтрализации токсинов применяется для идентификации бактериальных экзотоксинов по видовой и типовой их принадлежности, а также для определения содержания антитоксинов в исследуемой сыворотке. Принцип основан на способности антитоксинов связывать токсин и блокировать его действие. Для идентификации токсина и определения титра антитоксических AT их смесь вводят лабораторным животным. При соответствии типа токсина и антисыворотки гибели животных не наблюдают. Нейтрализацию токсинов in vitro определяют в реакции флоккуляции. Для определения антитоксического иммунитета у человека часто применяют кожные пробы (например, пробу Шика).