другие варианты:

1. иммуноэлектрофорез;

2. иммуноблотинг.

9. Сложные серологические реакции (3–х компонентные: Aг+Ig+C):

а) видимые:

• иммобилизация;

• иммунного прилипания;

• лизиса (в том числе гемолиза);

б) невидимые:

• реакция связывания комплемента (РСК).

2.10 Реакции с использованием метки:

• РИФ – реакция иммунофлюоресценции;

• ИФА – иммуноферментный анализ;

• РИА – радиоиммунный анализ;

• ИЭМ – иммунная электронная микроскопия.

Лекция 3-4 Антигены (окончание). Иммунный ответ. КИО. ГИО

3 Агтигены бактерий:

• соматические О-Аг;

• жгутиковые H-Аг;

• оболочечные или капсульные К-Аг;

• у сальмонелл выделен термолабильный Vi-Аг.

Соматические антигены (называют антигенами тела микроорганизма)

• располагаются в оболочке бактерий,

• являются липополисахаридами,

• термостабильны,

• у Гр- бактерий О-Аг представляет эндотоксин,

• бактерии обычно имеют несколько О-антигенов одновременно.

Н-Аг образованы белком флагеллином, термолабильные.

К- Аг большинства бактерий имеют полисахаридную природу.

Особую группу представляют протективные (от лат. рrotection – защита) Аг - это Аг, способные вызывать в организме образование эффективного противоинфекционного иммунитета.

Например, антигены возбудителей чумы, сибирской язвы, коклюша, бруцеллеза.

В составе бактерий так же различают Аг:

• групповые – общие для нескольких видов бактерий;

• видовые – характерные только для определенного вида;

• вариантные – по которым группы штаммов различаются внутри вида;

• штаммоспецифические – специфичные только для отдельных штаммов.

Антигенная структура бактерий имеет большое значение в идентификации выделенных чистых культур бактерий.

Серотипирование – определение вида микроорганизма по его антигенам.

Серовары – варианты микроорганизмов, различающиеся внутри вида по антигенной структуре.

Например, у возбудителя ботулизма может быть 7 сероваров отличающихся по антигенной структуре, каждый из которых образует ботулинический токсин. Это используется для получения иммунной сыворотки против соответствующего антигенного варианта токсина.

4 Клеточный иммунный ответ

Иммунный ответ (ИО)– это комплексная стадийная реакция иммунной системы организма, индуцированная антигеном и направленная на его элиминацию.

По механизмам эффекторного действия различают ИО:

– гуморальный (обеспечивается В- системой иммунитета),

– клеточный (обеспечивается Т-системой иммунитета).

В отличие от В-системы иммунитета, которая нейтрализует антиген с помощью антител,

– Т-система иммунитета уничтожает антигены, представленные на клетках, через прямое взаимодействие субпопуляции T-клеток – специфических цитотоксических T-клеток (=CD8 T-клеток = T-киллеров) с измененными собственными или чужеродными клетками;

– Т-клетки распознают не собственно антигенный пептид (эпитоп), а его комплекс с молекулами МНС I или МНС II.

Реакции КИО лежат в основе:

• реакции отторжения трансплантанта,

• аллергической реакции замедленного типа,

• противоопухолевого иммунитета,

• противопаразитарного иммунитета.

Этапы КИО:

1. Поглощение и процессинг аг

В качестве антигенпрезентирующих (АПК) клеток в КИО участвуют дендритные клетки или макрофаги.

Процессинг сводится к:

– расщеплению исходной молекулы до уровня специфических пептидов,

– активации синтеза в АПК антигенов МНС I или II классов,

– образованию комплекса антигенный пептид + МНС I или II класса и к экспрессии его на мембране АПК.

2. Презентация аг:

– комплекс антигенный пептид + МНС I презентируется для опознания прецитотоксическим Т-лимфоцитам с фенотипом CD8+;

комплекс антигенный пептид + МНС II — Т-хелперам, имеющим фенотип CD4+.

– узнавание Т-клеточным рецептором (TCR) комплекса антигенный пептид + МНС I или II класса. При этом важную роль играют адгезивные молекулы CD28 на Т-лимфоцитах и CD80 (CD86) – на АПК, выполняющие функцию корецепторов;

3. активация Т-лимфоцитов – переход из стадии покоя в стадию G₁ клеточного цикла. Условие активации – передача сигнала от клеточной мембраны к ядру. В результате образуется ряд транскрипционных молекул, активирующих гены важнейших цитокинов. Синтезируются ИЛ2 и рецептора для него – ИЛ2R, гамма-интерферон (γИФН) и ИЛ4.

4. Пролиферация – размножение специфического по отношению к данному антигену клона Т-лимфоцитов (клональная экспансия) под действие ИЛ2. Лишь размножившийся клон лимфоцитов способен выполнять функции по элиминации антигена.

5. Дифференцировка – процесс специализации функций клеток внутри специфического клона:

– под действием γИФН активируется процесс синтеза антигенпрезентирующими клетками ИЛ12, который воздействует на исходные специфические Т-хелперы нулевые (Th0) и тем самым способствует их дифференцировке в Тh1.

– Th1 продуцируют γИФН, ИЛ2 и факторы некроза опухоли альфа- и бета- , а также контролируют развитие клеточного иммунного ответа, и гиперчувствительности замедленного типа.

6. эффекторная фаза – уничтожение клетки-мишени. Происходит активация киллерной функции прецитотоксических лимфоцитов (специфических киллеров), натуральных киллеров, моноцитов, макрофагов и гранулоцитов. ПреЦТЛ дифференцируются в ЦТЛ, экспрессируя рецепторы к ИЛ2.

ЦТЛ убивают внутриклеточные бактерии и простейшие, инфицированные вирусами клетки, а также клетки опухоли и аллогенного трансплантата.

Каждый ЦТЛ способен лизировать несколько чужеродных клеток-мишеней.

Этот процесс осуществляется в три стадии:

• распознавание и контакт с клетками-мишенями;

• летальный удар – перфорины и цитолизины действуют на мембрану клетки-мишени и образуют в ней поры;

• лизис клетки-мишени – через образовавшиеся под влиянием перфоринов и цитолизинов поры проникает вода, разрывающая клетки.

Схема клеточного иммунного ответа

Закономерности развития гуморального иммунного ответа на проникновение тимусзависимых и тимуснезависимых антигенов.

Протекание процесса презентации АГ лимфоциту зависит от типа антигена. Все АГ делятся на тимусзависимые и тимуснезависимые. Большинство антигенов тимусзависимые. Презентация тимуснезависимого антигена проходит по схеме: М––>Вл. Презентация тимусзависимого антигена проходит по схеме: М––>Тх2––> Вл.

Тимуснезависимый антигенов мало. Они являются сильными митогенами. Должны быть полимеризованного характера и иметь большое количество одинаковых эпитопов (например: липополисахариды клеточной Гр(-) микроорганизмов). На поверхности В-лимфоцитов очень большое число антигенраспознающих рецепторов одной специфичности. Эти рецепторы подвижные. Как только на них действует липополисахарид, происходит агрегация рецепторов, приводящая к концентрированию их в одном месте в виде «шапочки» – это первый сигнал к активации В-лимфоцитов. Второй сигнал В-лимфоциты получают от макрофага в виде медиатора, которым является ИЛ1. После этого происходит активация В-лимфоцита и трансформация его в бластные клетки; они увеличиваются в размере, 6-7 раз делятся и дифференцируются в плазматические клетки, синтезирующие иммуноглобулин малой специфичности IgМ.

Тимуснезависимый антиген индуцирует пролиферацию клона клеток с АГ-специфическими рецепторами. Особенностью ИО в данном случае заключается в следующем: 1) не происходит переключения синтеза IgМ на синтез иммуноглобулинов класса G и др. классов; 2) тормозится ИО, т.к. не образуются клетки памяти; 3) быстро возникает иммунологическая толерантность.

Тимусзависимые антигены вызывают ИО, включающий следующие стадии: 1) Презентация антигена Т-хелперу; 2) специфическое распознание Т-хелпером антигена на поверхности макрофага через антигенраспознающий рецептор. Распознание идет в комплексе с молекулами HLA–DR. На этом этапе, получив антигенную информацию от макрофага, Т-хелпер получает медиаторный сигнал от макрофага в виде ИЛ-1. Это активирует Т-хелпер. Активированный Т-хелпер выделяет различные лимфокины (ИЛ-2,ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, митогенный и бластогенный фактор), что способствует экспрессии на поверхности Т-лимфоцитов рецепторов для ИЛ-2 и ИЛ-4. Это продукты самого Т-хелпера, которые поддерживают его в активном состоянии. Кроме этого, эти продукты активируют В-лимфоциты вместе с ИЛ-1, который В-лимфоцит получает от макрофага.

Клонально-селекционная теория

Первую «селекционную» теорию образования антител предложил в 1900 г. Пауль Эрлих (Ehrlich). Согласно его теории, существуют клетки (по-видимому, В-лимфоциты), на поверхностной мембране которых расположено много разных молекул антител. Эти клетки способны синтезировать любое из них. После того как происходит связывание чужеродного антигена с каким-то одним антителом, клетка начинает производить антитела только этой специфичности. Поскольку этот «селективный» процесс происходит одновременно в большом числе клеток, образуется много антител, специфичных к данному антигену. Сейчас известно, что идея Эрлиха не верна. Современные селекционные теории, основанные на представлениях о том, что одна клетка может продуцировать только антитела одного типа (а не многих), начали появляться только в 1950-х гг.

Первой среди них была теория, предложенная Нильсом Ерне (Jerne) в 1955 г. Его теория переместила интересы иммунологов с инструктивных теорий, по которым антитела принимают любую форму в зависимости от формы антигена, на селекционные. В 1957 г. Макфарлейн Бернет предположил, что основной единицей отбора антигеном является клетка, и что одна клетка отвечает за образование антител только одного типа. Именно Бернет придумал термин «клональная селекция». В основе этой теории лежит представление о том, что «одна клетка производит только одно антитело» (точнее, антитела одной специфичности). Существует много разных клеток (лимфоцитов), образующих и несущих на поверхности разные антитела. Клетка «отбирается» антигеном, форма которого соответствует антителам, производимым данной клеткой. Именно она начинает размножаться и дает клон идентичных клеток, причем все клетки клона продуцируют антитела одной специфичности. Согласно этой теории, должен существовать механизм, который обеспечивает проявление на поверхности клетки антител только одной специфичности и исключает все другие антитела. Теперь мы знаем, что «решение», какое антитело будет синтезироваться в В-клетке, принимается на ранних стадиях развития лимфоцита. Бернет не только нашел экспериментальные свидетельства в пользу этой теории, но и сформулировал ее следствия для проблемы различения «своего» и «не-своего».

Далее клонально-селекционная теория развивалась усилиями таких исследователей, как Мелвил Кон и Элистэр Каннингем (Cunningham). До сих пор основные представления этой теории объясняют, как иммунная система приспосабливается к разнообразным и постоянно меняющимся антигенам внешней среды. Основные положения клонально-селекционной теории подтверждены экспериментально.

Привлекательность этой теории состояла в том, что она давала разумные объяснения механизма аутотолерантности. Если рецептор на поверхности развивающегося незрелого лимфоцита связывается с собственным антигеном, клетка получает «отрицательный» сигнал и уничтожается. Так как собственные антигены — это первые молекулы, которые встречаются незрелым лимфоцитам, этот процесс должен происходить в местах развития лимфоцитов. Бернет назвал его уничтожением «запрещенных» клонов. Только лимфоциты, прошедшие этот селекционный фильтр (уничтожение запрещенных клонов), достигают зрелости и приобретают способность связываться с чужеродными антигенами.

Мелвин Кон, а затем Элистэр Каннингем привели доводы в пользу того, что иммунная система имеет способность генерировать соматические мутации генов антител в ответ на внедрение чужеродных антигенов. По их мнению, по-видимому, выгодно, чтобы с ДНК зародышевой линии наследовалось только небольшое число необходимых Ig генов, а новые могли бы возникать в течение жизни животного в виде соматических мутаций, вызванных антигеном.

Сузуму Тонегава (Япония) открыл генетической основы образования вариационного богатства антител. В стрессовой ситуации, которую создает вторжение антигена, включается механизм перестройки генов иммуноглобулинов: генетическая система по каким-то не вполне еще понятным правилам режет и сшивает фрагменты генов до тех пор, пока не найдет приемлемый вариант – тот, что синтезирует антитело, которое реагирует с вторгшимся антигеном. Найденный вариант клонируется (т.е. размножается из единственного родоначального экземпляра).

За открытие этого механизма иммунолог из Японии Сусуму Тонегава получил в 1987 г. Нобелевскую премию (работа начата в Швейцарии, а завершена в США). Суть открытия в том, что ген может быть переделан в цитоплазме.

Указанный механизм рекомбинаций поставляет антитела, связывающие антигены довольно слабо. Для улучшения их «качества», для тонкой подстройки, осуществляется следующий этап, соматический (т.е. не связанный с размножением), – гипермутагенез. Гипермутагенез заключается в том, что при клонировании гены «болванки» (первично найденного варианта) мутируют с огромной частотой (каждый тысячный нуклеотид заменяется, тогда как обычно точковый мутагенез в 100 миллионов раз менее интенсивен), а потом с их копий синтезируется масса чуть отличных друг от друга белковых цепей антител, какое-то из которых оказывается подогнанным к антигену наилучшим образом. Этот окончательный вариант снова клонируется и запоминается клетками иммунной памяти, т.е. наследуется на время жизни особи (возникает приобретенный иммунитет).

В этом, грубо говоря, состоит генетический принцип обеспечения разнообразия антител (термин Тонегавы): возникшие при перестройках фрагменты сшиваются (механизм Тонегавы), причем с нематричными вставками (механизм Альта–Балтимора, п.4), затем успешный вариант точно подгоняется к антигену (механизм гипермутагенеза), клонируется и запоминается (соматическое наследование).

Словом, гены антител образуются не за счет случайных мутаций, как думали прежде, а путем многостадийного процесса, в котором лишь одну ступень можно назвать мутагенезом и то в особом смысле: он направлен – в том смысле, что происходит только в нужных участках нужных генов, зато с неимоверной частотой.

Первичный и вторичный иммунный ответ.

При попадании антигенов в организм в первые сутки наблюдается антигенемия (циркуляция антигенов в крови). Основное количество антигена исчезает из крови через сутки и накапливается в лимфоузлах. В случаях бактериемии или вирусемии количество антигена может снова увеличиваться.

П е р в и ч н ы й и м м у н н ы й ответ развивается после латентного периода (3-5 дней), во время которого происходит распознание АГ и образование клонов плазматических клеток. Затем наступает логарифмическая фаза, соответствующая поступлению АТ в кровь. Продолжительность 7-15 суток. Постепенно титры АТ достигают пика и наступает стационарная фаза, продолжительность которой 15-30 суток. Ее сменяет фаза затухания, характеризующаяся снижением титров АТ, длящаяся 1-6 месяцев.

Первыми синтезируются IgM, а затем IgG (они могут сохраняться в течение всей жизни). Позже всех и не всегда появляются в небольших количествах IgA, E, D. Одновременно нарастает количество уровень иммунных Т-лимфоцитов, образуются комплексы антиген-антитело. В зависимости от вида антигена преобладают или иммунные Т-лимфоциты, или антитела.

Особенность первичного иммунного ответа – низкая скорость антителообразования и появление сравнительно невысоких титров АТ.

В т о р и ч н ы й и м м у н н ы й о т в е т.

Как мы уже отмечали, после антигенной стимуляции часть клетов В- и Т-лимфоцитов циркулирует в виде клеток памяти. Особенности вторичного имунного ответа:

• латентный период очень непродолжительный – несколько часов;

• за счет клеток памяти стимуляция синтеза антител и иммунных Т-клеток наступает быстро (через 1-3 дня);

• образование АТ стимулируется значительно меньшими дозами АГ;

• высокая скорость антителообразования;

• титры АТ достигают максимального значение (кривая скорости синтеза антител значительно круче, чем при первичном иммунном ответе;

• синтезируются сразу антитела, относящиеся к классу IgG;

• часть антител связывается с Fc-рецепторами лейкоцитов;

• образующиеся антитела циркулируют в организме длительное время.

Чем больше контактов с антигенами, тем выше уровень антител. Это явление используют при иммунизации (многократном введении антигена животным) с целью получения антисывороток, которые применяют для диагностики и лечения.

11. Иммунологическая память

Иммунологическая, или иммунная, память – способность иммунной системы отвечать на вторичное проникновение АГ быстрым развитием специфических реакций по типу вторичного иммунного ответа. Иммунная память проявляется как в отношении выработки антител, так и в отношении других имунных реакций (гиперчувствительности замедленного типа, трансплантационный иммунитет и проч.).

Реализацию этого эффекта обеспечивают стимулированные Т- и В-лимфоциты, не выполняющие эффекторные функции. Не все индуцированные антигеном В-лимфоциты подвергаются дифференцировке до конца. Часть из них после нескольких циклов деления перестает размножаться и образует субклон клеток памяти (из одной В-клетки образуется около 1000 клеток памяти, таким же образом образуются клетки памяти и из Т-лимфоцитов). Клетки памяти определяют продолжительность приобретенного иммунитета. При повторном контакте с данным антигеном они быстро превращаются в клетки-эффекторы.

Феномен интенсивного развития иммунного ответа на вторичное попадание АГ – бустер-эффект [от англ. to boost, усиливать] используют для получения лечебных и диагностических сывороток с высоким титром антител (гипериммунные сыворотки) от иммунизированных животных. Бустер-эффект также применяют для быстрого создания невосприимчивости при повторных вакцинациях (например, для профилактики туберкулеза).

Эффект иммунной памяти составляет основу вакцинопрофилактики многих инфекционных заболеваний.