1.4. Двигательная активность обонятельных жгутиков

Из выше изложенного следует, что мембранные рецепторы и, по-видимому, вторичные посредники обонятельной трансдукции сосредоточены в жгутиках рецепторных клеток. Эти жгутики пребывают в непрерывном движении.

Их наблюдениями активно занимался А.А. Бронштейн с коллегами (1966, 1973, 1977). Посредством фазово-контрастной прижизненной микроскопии обонятельной выстилки различных животных вопреки отрицательным утверждениям некоторых исследователей (Lidow, Menco, 1984; Menco, Farbman, 1984), им удалось показать, что обонятельные жгутики всех позвоночных без воздействия на них раздражителей подвижны. Спонтанные перемещения этих нитеобразных образований в пространстве совершенно отличаются от ресничек мерцательного эпителия. Они совершают неупорядоченные асинхронные, изгибательные, волнообразные и воронкообразные движения. Короткие тонкие и толстые обонятельные жгутики колеблются с разной частотой: от 20 до 40 – 50 колебаний в минуту – первые и от 15 до 30 движений – вторые, а длинные двигаются с частотой 10 – 25 в минуту (Firestein et al., 1990; Frins, Lindemann, 1991). ОЖ у рыб (радужная форель) имеют сходное строение с другими видами позвоночных и подвижны. Движение их совершается при участии динеиновых ручек, в состав которых входит Mg-активируемая АТФаза. Посредством радиоактивно меченых одорантов (L-аланина, L-серина, L-треонина, L-лизина и D-аланина) получено прямое доказательство, что они связываются со связывающими их сайтами, локализованными в ОЖ (Rhein L.D., Cagan R.H., 1980).

Наблюдения за жгутиковыми перемещениями обнаружили интересный факт, касающийся их дистального участка. Судя по результатам электронно-микроскопического анализа, длинные обонятельные жгутики лягушек и крыс имеют структуру цитоскелета, образованную 9 х 2 + 2 микротрубочками в проксимальном отделе, но их дистальный участок имеет неполный их состав, и их число постепенно уменьшается до 1 - 2 (Бронштейн, 1977; Menco, Farbman, 1984; Matsuzaki et al., 1999). Таким образом, вершина жгутика оказывается лишенной тубулярного цитоскелета, а, следовательно, и молекулярных механизмов подвижности. Поэтому в активном локомоторном акте у них могут участвовать, вероятно, только проксимальный отдел, тогда как дистальная часть двигается пассивно вслед за ним, и в процессе движения обонятельного жгутика она может закручиваться в виде петли или диска (Бронштейн, 1977).

Anholt R.H. et al. (1986). В своей работе исследовали изолированные ОЖ лягушки-быка, Rana catesbiana. Посредством биохимического анализа PAGE in SDS показали наличие около 30 протеиновых полос в геле, среди которых такие цитоскелетные молекулы, как актин с Мм 46 кДа и α- и β-тубулины с Мм 55 и 53 кДа, сооветвественно, которые легко идентифицировали с помощью иммуноблотинга. В Ож обонаружили гликопептиды с Мм 56 – 65 и 116 кДа, которых не нашли в ресничках респираторного эпителия у этих животных. В ОЖ идентифицровали β-субъединицу Na/K-ATPase с Мм 56 – 65 кДа. В препаратах ОЖ с помощью имуноблотинга авторы обнаружили α-субъединицу с Мм 39 кДа и β-субъединицу с Мм 36 кДа Golf-белка, которые не обнаружны в респираторных ресничках. В геле виден также спектрино-подобный цитоскелетный протеин с Мм 185 кДа.

Mair R.G. et al. (1982) исследовали изменения морфологии и физиологии ОЖ позвоночных в ходе развития у лягушек. За движением наблюдали с помощью прижизненной микроскопии препаратов ОЭ. Использовали также электронную сканирующую микроскопию ОЭ. Наблюдали за регенерацией ОЖ после их удаления в течение времени. При микроскопическом исследовании авторы наблюдали короткие, подвижные, и длинные, неподвижные ОЖ (СМ. РИС.1). Подвижные реснички авторы разделили на 2 группы: одна, названная strokers (взмах, удар), это ОЖ длиной около 15 – 50 мкм и двигаются медленно, хлыстоообразно. Другая группа ОЖ, названная wigglers (извивание), короче (10 – 20 мкм в длину), движется быстрее и сложнее. Все эти типы ОЖ распределены по всему ОЭ, причем, в каких-то местах встречаются 2 типа из трех, в каких-то – только один. Эти распределения разные у разных лягушек данного вида. Показали, что wigglers более чувствительны, чем strokers к изменению физиологических условий.

ОЖ были устойчивы к повреждению, даже при самых сильных толчках микрозонда. ОЖ редко отрывались от основания, в то время как отдельные врхушки их повреждались. (Поэтому, вероятно, по video нельзя судить о длине ОЖ с большой точностью). Авторы показали, что через 16 часов после обработки Тритоном Х-100 подвижные и неподвижные ОЖ равны по длине и распеределены в тех же местах, что и в необработанных тканях. Восстановление ОЖ после обработки ZnSO4 происходит значительно медленнее. Только через 12 дней появляются первые, редко расположенные ОЖ, имеющие высокую подвижность. Это совпадает с начальной регистрируемой рецепторной аткивности, вызываемой одорантами, и предшествует первому появлению аксонов в нерве на 2 дня. Длина ОЖ и их число увеличиваются через 16 дней и за последующие еще 10 дней. Неподвижные ОЖ начинают появляться через 27 дней, а через 45 дней достигают длины ~140 мкм. Теперь ОЭ становится похожим по составу ОЖ на небработанный ОЭ. (Следует, по-моему, сделать одно замечание. В этой статье говориться, что срок жизни обонятельных клеток у лягушек 60 дней, а у мышей – 30 – 40 дней. Следовательно, длинные и неподвижные ОЖ появляются к концу жизни ОК, то есть скорее у состарившихся клеток, чем у зрелых, для которых характерен набор компонентов обонятельной трансдукции и наличие синаптической связи). В обонятельном нерве присутствует много аксонов рецепторных клеток ко времени, когда впервые видны длинные неподвижные ОЖ. За последующие 4 недели число их драматически увеличиается. Авторы считают, что они поддерживают гипотезу, обонятельные клетки несут различные типы ОЖ на разных стадиях своей жизни. Тогда это свидетельствует о том, что в ОЭ обонятельные клетки находятся на разной стадии развития в разных участках ОЭ. Но существует и другая гипотеза – в ОЭ присутствуют разные типы ОК, имеющие характерный для них тип ОЖ. Однако, по мнению авторов, из этого следует, что те ОК, которые снабжены неподвижными ОЖ, развиваются медленнее, что не подтверждается анатомическими и физиологическими данными.

Появление неподвижеых ОЖ совпадает по времени, когда аксоны растут обратно к ОЛ. При этом авторы утверждают, что неподвижность не является обязательной функцией длины, так как в ОЭ могут двигаться и длинные ОЖ.

Если из раствора Рингера, в котором находился препарат ОЭ, удаляли Са, ОЖ снижали подвижность через 24 – 45 мин. Сильнее реагировали wigglres, чем strokers. Добавление Са в раствор повышало подвижность через 1 мин., а через 5 – 10 мин. она становилась нормальной. Если из раствора удаляли Mg, то подвижность ОЖ снижалась через 20 – 30 мин. и сохранялась на этом уровне несколко часов. При этом реакция wigglers была также сильнее, чем stokers. При восстановлении состава среды Движения восстанавливались через 3 мин. и становились нормальными через 15 мин. При удалении и Са и Mg снижения активности ОЖ наступали гораздр быстрее.

Движения ОЖ замедлялись вплоть до отановки в присутствии 2 мМ ЭГТА в растворе без Са и Mg.

В работе проверяли вход Са через потенциал-зависимые ионные каналы, блокируя их 0,9 мМ Со в бескальциевом растворе Рингера. Показали: подвижность wigglers становилась upright (прямой, вертикальной) и jerky (отрывистый, тряский) через 1 – 3 мин. Через 5 – 15 мин. все подвижные ОЖ двигались быстро хлыстоподобным образом, не становясь в прямом положении. Strokers и wigglers различались с трудом. Они имели тенденцию оставаться наклоненными в одном направлении и проявлять метахрональнальное синхронные движения. При заменене раствора на нормальный через 1 – 3 мин. ОЖ приобретают jerky (отрывистый, тряский) характер и менее координированный. Через 5 – 10 мин. движения нормолизовались.

При блокировании Са-каналов лантаном эффекты были сходны, только времена были несколько дольше.

В работе авторы наблюдали за ОЖ под действием паров одорантов: амилацетат, d-лимонен, гептаноевая кислота, пиридин. На все стимулы наблюдали сходные реакции. В ответ на стимул движения ОЖ становились jerky. Через 1 мин. ОЖ начинали проявлять грубую метахрональную синхронию, которая длилась около 5 мин. (Можно предположить, что такая реакция связана с высокой концентранцией раздражителя - пары). Однако реакции были недостоверны, если препарат ОЭ стимулировали более 1 раза.

Полагают, что wiglers и stokers имеют сходные сократительные механизмы, но различные мембранные свойства. Эксперименты этих авторов показали, что для движений ОЖ требуется Са и Mg в окружающей среде. Но высокие концентрации Са (3 мМ) останавливают их подвижность. По данным авторов, Со и La в бескальзиевом растворе индуцировали сдвиг активности ОЖ от нормальной асинхронной к более синхронным движениям.

Значение подвижности жгутикового аппарата до сих пор неясно. Полагали, что основное ее предназначение сводится к перемешиванию обонятельной слизи с растворенными в ней молекулами пахучих веществ, что обеспечивает более быстрый их контакт с мембранными рецепторами. Однако это маловероятно, поскольку перемешивание слизевого секрета в носовой полости наземных позвоночных обеспечивается мерцательным эпителием (Бронштейн, 1977).

В настоящее время факт участия жгутиков в рецепторном процессе установлен. Важно теперь ответить на вопрос о том, какую роль в нем играет двигательная активность. Известно, что частота и направление движений ресничек обонятельных клеток изменяются в связи с различной степенью поляризации их мембраны, и что характер их движений контролируется посредством мембранного потенциала. В то же время имеются данные о возможности изменения трансмембранного потенциала в результате пассивного движения жгутиков (Бронштейн, 1977). Было высказано предположение, что изменения их локомоторной активности под влиянием одорантов могут приводить к изменению этого потенциала и что двигательная реакция обонятельных жгутиков может включаться в акт рецепции в качестве одного из звеньев этого процесса (Бронштейн, 1977).

Предположение А.А.Бронштейна, сформулированное около 30 лет назад, сохранило свою актуальность и нуждается в экспериментальной проверке. Можно думать, что изменения разности потенциалов на плазмолемме обонятельных жгутиков связаны с участием так называемые TRP-каналов (transition receptor potential channel). Впервые их описали в процессе фототрансдукции у D. melanogaster (Denis, Cyert, 2002). Затем гомологи были обнаружны и идентифицированы у червей, омаров, млекопитающих. Они вовлекаются в такие сенсорные функции, как боль, определение осмомолярности, слух и обоняние (Denis, Cyert, 2002). Мутация гена, кодирующего белок для этих каналов, локализованных в волосковых клетках, приводят к глухоте у насекомых и человека (Goodman, Schwarz, 2003).

Venkatachalam K., Montell C. (2007) TRP каналы. (Обзор)

Реферат. TRP – суперсемейство катионных каналов, замечательное тем, что проявляет большее разнообразие в механизмах аткивации и селективности, чем другие группы каналов. Организация доменов белков некоторых каналов также необычна, так как они состоят из связанного (linked) канала и энзиматических доменов. Их объединяют в одну группу, так как белки TRP каналов играют важную роль в сенсорной физиологии, которая включает зрение, вкус, обоняние, слух, тактильную и термо- и осмочувствительность. Кроме того, TRP-каналы обеспечивают некоторым клеткам способность чувствовать локальные изменения окружающей их среды. Многи кналы активируются рядом разнообразных стимулов и функционируют как сигнальные интеграторы. TRP-суперскмейство подразделяется на 7 подсемейств: 5 TRPs 1-й группы (TRPC, TRPV, TRPM, TRPN, TRPA) и 2 субсемейства 2-й группы (TRPP, TRPML). TRP-каналы важны для здоровья человека, так как мутации по крайней мере 4 TRP-каналов лежат в основе заболеваний.

Введение.

Представители TRP-суперсемейства каналов имеют общие совйства шести трансмембранных сегментов, различающихся степенью гомологии а/к-последовательностей. TRP- каналы отличаются от каналов других типов тем, что обладают большим различием по катионной селективности и специфическим механизмам активации. Самое удивительное, что одиночный TRP-канал можно активировать, по-видимому, абсолютно несопоставимыми механизмами. Во многих случаях TRPs можно рассматривать как множественные интеграторы, так как реакция на одном входе модифицируется на другом. Тем не менее, общим для TRP кналов является то, что они играют важную роль в реакциях на все основные классы внешних стимулов, включая свет, звук, химические вещества, температутру и прикосновение. TRP каналы функционируют в отдельных клетках со способностью чувствовать локальные изменения окружающей среды, такие как осмолярность.

Классификация и филогенетическое распределение TRP-кналов

TRP-каналы экспрессируются и функционируют в большом разнообразии многоклеточных организмов, включая червей, фруктовых мух, зебрафиш, мышей и человека. Суперсемейство TRP-каналов подразделяется на 1-ю и 2-ю группы, которые сами подразделяются на 7 субсемейств (Рис.1) ().

Восьмое суперсемейство, TRPY, состоит из TRPs дрожжей, которые являются дальними родственниками TRPs 1-й и 2-й групп (). Существование TRP у дрожжей означает, что природа TRP каналов произошла до возникновениня (появления) организмов metazoa.

Разделение TRPs на 1-ю и 2-ю группы основывается на различиях а/к-последовательностей и топологии. TRPs 1-й группы состоят из 5 субсемейств, которые имеют самую сильную гомологию а/к-последовательности с найденным представителем суперсемейства, TRP дрозофилы (). Те каналы, которые ниаболее родственыы TRP дрозофилы, получили название классическими или TRPC-каналами. TRPV, TRPM, TRPA и TRPN субсемейства так называются на основании первоначального имени, полученного при первоначальном описании представителя каждого субсемейства. В зависимости от организма семейство TRP 1-й группы включает от 11 до 22 представителей (Рис.1с). Белки TRPN не обнаружены у млекопитающих, хотя они экспрессируются у таких позвоночных, как зебрафиш. \TRPs 1-й группы состоят из нескольких примечательных последовательных элекментов и доменов. Самая большая область гомологичной а/к-последовательности 6 раз пронизывает ПМ, образуя 6 трансмембранных сегментов, включающих поровую петлю между 5-м и 6-м трансмембранными сегментами (Рис.1а). TRPC, TRPM и TRPN каналы содержат также TRP-домен, который следует за 6-м трансмембранным сегментом (Рис.1 и 2). Наиболее консервативные части TRP-домена – части 1 и 2 TRP-кналов (Рис.2). За исключением TRPМ-каналов, TRPs в 1-й группе имеют много N-терминальных анкериновых повторов. Три протеина TRPM – это так наз. Chanzymes (5) с С-терминальными энзиматическими доменами.

Два субсемейства TRPP и TRPML составляют 2-ю группу TRPs, которые являются дальними родственниками TRPs 1- й группы. Протеины TRPP и TRPML гомологичны по а/к-последовательности над трансмембранными сегментами и содержат большую петлю, отделяющую первые 2 трансмембранных домена (Рис. 1в). Субсемейство TRPP, вероятно, самое древнее, так как его представители распространяются от дрожжей до млекопитающих (). Проеины обнаруженных TRPP и TRPML обнаружены как генные продукты, мутированные при аутосомном доминантном заболевании полицистозом почек (ADPKD) и муколипидозе 4-го типа (ML IV), соответственно (). Мутации у двух белков TRP 1-й группы также лежат в основе заболеваний человека. Аутосомный доминантный сегментальный гломерулосклероз является результатом разрушения TRPC6 (), а мутации TRPM6 приводят к гипомагниемии и гипокальциемии (13, 14). Таким образом, TRP-каналы связаны с заболеваниями человека и его здоровьем.

Активация и регуляция активности каналов

Механизмы активации и регуляции данных каналов предложены на основе их предназначения. Например, TRPs, активируемые термически, принадлежат представителям TRPV, TRPM и TRPA субсемействам, тогда как регулируемый экзоцитоз стимулирует вход катионного тока через некоторые из TRPC, TRPV и TRPM каналы. Однако, в некоторых случаях существует сходство между представителями субсемейства, так как все TRPC каналы активируются через пути, сопряженные со стимуляцией ФЛС. Возвращаясь к теме разговора, большинство TRP кналов активируется через различные механизмы. Существуют TRP кналы, таке как TRPV1, которые реагируют на стимулы, находящиеся в области от тепла до ботанических веществ, провоспалительных агентов и экзоцитоза.

TRPCs беспозвоночных.

Ген, кодирующий первого представителя суперсемейства TRPs, TRP дрозофилы (), требуется для сохранения реакции на свет. Фототрансдукция у дрозофил инициируется, когда свет действет на G-белок-сопряженный рецептор родопсин. Это приводит к стимуляции гетеротримрного G-белка, активации ФЛС и последующему катионному току в фоторецепторную клетку (). Мутации trp-локуса приводит к транзиентной реакции на свет, характеризующейся 10-кратным снижением входа Са (). Эти результаты означают, что TRP или являются Са-проницаемыми катионными каналами или для активации канала необходим регулятрный белок. Предполагаемая топология TRP канала, состоящая из множества трансмембранных сегментов (), в сочетании с исследованиями гетерологической экспрессии, означают, что TRP – новый тип Cа проницаемого катионного канала.

Наличие транзиентной реакции на свет в отсутствие функционального TRP канала указывает на роль дополнительных каналов (Замечание! В ОЖ тоже, веротяно, есть дополнительные каналы – одни обеспечивают трансдукцию, а другие – движение). Действительно, существет 2 других TRPC канала, экспрессрующиеся у мух, TRPL (TRP-like) и TRPγ (), а реакция у мух исчезает при мутациях и trp и trpl (0. Хотя TRP – основной источник входа Са в фоторецепторы мухи (), TRPL играет роль для поддержания длительной реакции при пролонгированном освещении (). Если TRP каналы являются относительно селективны к ионам Са, то TRPL и TRPγ – неселективные тонные каналы ().

Ключевой вопрос – механизмы, благодаря которым стимуляция ФЛС приводит к гидролизу фосфоинозитид-4,5-бифосфата (PIP2) с образованием диацилглицрола (ДАГ) и IP3 (инозитол-1,4,5-трифосфата). Существует по крайней мере 3 модели для механгизма активации TRP и TRPL. Согласно первой модели, IP3 быстро диффундирует через цитоплазму и связывается с Са-проницаемым IP3- рецептором, локализованным в мембране ЭПР. Это приводит к высвобождению Са и истощению ЭПР, что, в свою очередь, активирует TRP и TRPL. Действительно, TRP дрозофилы и TRPCs некоторых млекопитающих активируются через такой депо-зависимый механизм в системах гетерологической экспрессии (1). Однако ни TRP ни TRPL не активируются тапсигаргином, специфическим ингибитором Са-АТФазы ЭПР, ни IP3-опосредованным истощением Са-депо в нативных фоторецепторных клетках, доказывая отсутствие влияния истощения Са-депо ЭПР на активацию канала in vivo (24, 25). Кроме того, мутации одиночного гомолога дрозофилы IP3-рецептора млекопитающих не вляли на активациюканала или фоторецепцию (26).

Вторая модель полагает, что ФЛС регулирует активность TRPC дрозофилы путем снижения концентрации ингибиторного PIP2. PIP2 ингибирует активность экзогенно экспрессированных TRPL каналов при insideout пэтчах (). Поэтому активность ФЛС могла ба приводить к активации канала посредством ослабления ингибиторного влияния PIP2. Хотя PIP2 может быть ингибиторным, истощения PIP2 может быть недостаточно для активации кнала in vivo.

По-видимому, активация TRP канала опосредуется in vivo через ДАГ или его метаболиты, полиненасыщенные ЖК (PUFAs). PUFAs активируют TRP и TRPL каналы в препарированных фоторецепторных клетках (), и ДАГ/PUFAs активируют TRPL каналы, экзогенно экспрессированные в клетках насекомых (). Кроме того, разрушение глаза, обогащенного ДАГ-киназой, которая фосфорилирует ДАГ с образованием фосфатидной кислоты (РА), вызывает конститутивную акитвность TRP и TRPL (). Хотя уровни PUFAs не оценивали у мутантов ДАГ-киназы, отклонение ДАГ к PUFAs вместо РА могло бы повышать уровни PUFAs, пррсредством чего увеличивая активность канала (). Получены и другие доказательства участия ДАГ в активации TRP in vivo.

Активность TRPL ослабевает также посредством его зависимым от света движения вперед-назад (shuttling) из фототрансдуцирующей части фоторецепторных клеток, rhabdomeres, в extrarhabdomeral cell bodies (32). TRPC канал у C. elegance , TRP-3, который функционирует при оплодотворении, подвергается в процессе развития (developmentally) регулируемой транслокации (23). В сперматозоидах TRP-3 располагается во внутриклеточных везикулах, однако при активации сперматозоида канал транслоцирует к ПМ. Эта транслокация коррелирует с увеличением активности TRP-3.

TRPCs млекопитающих

Первые иденитифицированные у млекопитающих гомологи TRPs дрозофилы назвали TRPC1, TRPC2, TRPC 3 (). Затем описали 7 белков TRPC у млекопитающих (TRPC – 7) (Рис.3). Однкао у человека экспресструется только 6, поскольку TRPC2 учеловека является псевдогеном (). 7 гомологов млекопитающих имеют ≥ 30% а/к-идентичности друг с другом и с TRPCs дрозофилы верхних N-терминальных 750 – 900 а/к-остатков. На основе а/к-сходства TRPs млекопитающих делят на 4 группы: TRPC1, TRPC2, TRPC3/6/7 TRPC4/5. Если какие-то TRPCs (например, TRPC1) широко экспрессируются (), то другие обогащены в Н.С. (Табл.1).

Все TRPCs млекопитающих активируются через ФЛС (). Однако существует вариативность в их селективности для Са по сравенеию с другими катионами и в механизме, сопрягабщем активность ФЛС со стимуляцией канала. Некоторые белки TRPCs могут активироваться посредством истощения Са из внутриклточных хранилищ, вызываемого аппликацией IP3 или тапсигаргина (перечень в реф. 37) (таблю1).

Одна гипотеза, относящаяся к взаимодействию между статусом Са-хранилищ и активностью TRPC-канала, заключается в том, что существует прямое конформационное сопряжение между TRPCs и каналами Са-высвобождения в ЭПР. Такой сопрягающий механизм потребывал бы тесного соприкосновения между ЭПР и ПМ. Действительно, разделение двух мембран посредством фармакологической реорганизации актинового цитоскелета в кортикальном кольце прекращает активацию экзогенно экспрессированных TRPC3 каналов (38). Однако модификация актинового цитоскелета может также снижать активность канала, вызывая его интернализацию (39). Хотя потребности в прямых взаимодействиях между TRPCs и каналами Са-высвобождения в ЭПР (и IP3 и рианодиновыми рецепторами) описаны (1, 37), TRPC-каналы вполне функциональны в DT40 avian В-лимфоцитах, в которых 3 гомолога IP3-рецептора нокаутированы (). Однако роль конформационного сопряжения нельзя исключить, так как ативация TRPCs каналов не может сопрягаться с рианодиновыми рецепторами при отсутствии функциональных IP3-рецепторов.

Некоторые TRPCs млекопитающих сопрягаются с активацией ФЛС благодаря потребности в ДАГ. При экзргенной экспрессии некоторые TRPCs-каналы сильно стимулируются ДАГ и его аналогами (43) (Табл1).

В поддержку роли ДАГ in vivo говорит тот факт, что нативные TRPC2 каналы, которые экспрессируются в вомероназальном органе мышей, активируются исключительно ДАГ, а не через IP3 рецепторы, Са-хранилища или PUFAs арахидоновой ктслоты (45). Кроме того, устранение TRPC6/7 каналов в культивированных клетках устраняет развитие ДАГ-завасимой проводимости (46, 47). По крайней мере, 1 TRPC –канал,TRPC1, открывается механическим стимулом, так как активируется развитием растяжения (или напряжения) поперек липидного бислоя в рекноструированных липосомах () в отсутствие белков.

На основе исследований исключительно гетерологической экспрессии сделано заключение относительно механизмов активации TRPC каналов. Проводимость нативных TRPC3-каналов в нейронах primary pontine из мозга новорожденных крысят активируется через путь, инициируемый нейротрофным производным из мозга neutotrophic фактором (BDNF) и TrkB-рецептором (). Эта нативная проводимость (I_BDNF) зависит от стимуляции ФЛС, увеличения внутриклеточного Са и функциональных IP3-рецепторов (). Удивительно то, что эта проводимость не возникает под действием ДАГ (), что поднимает вопрос: почему TRPC3 активируется ДАГ, когда экспрессируется в клетках культивируемых тканей. ДАГ требуется также для инактивации TRPCs, опосредованной через ПКС (), и ДАГ активирует нативные TRPC7 в DT40 клетках только после ингибирования ПКС (50). Поэтому расхождения в наблюдаемом вкладе ДАГ в активацию TRPC могут отражать различный вклад ПКС-опосредованного ингибирования в различных клетках. Кроме того, как описано выше, существует убедительное доказательство, что проводимость некоторых нативных TRPCs активируется ДАГ (45).

Агонист-опосредуемый экзоцитоз TRPCs также модулирует активность каналов (1) (табл. 4). Инкорпорация TRPC4 и TRPC5 в ПМ активируется через рецептор к эпидермальному фактору роста (EGF). Активация рецептора к EGF увеличивает инкорпорацию TRPC4 благодаря тирозинового фосфорилирования TRPC4 с помощью Scr, что, в свою очередь, увеличивает взаимодействие со scaffold белком, регуляторным фактором Na/H-обмена (NHERF) (51). EGF-индуцируемая транслокация TRPC5 возникает через различные механизмы, вовлекающие фосфатидилинозитид-3-киназу, Rho-ГТФазу, Rac1 и фосфатидиоинозитол 4-фосфат 5-киназу (52). В случае TRPC3 агонист-индуцируемый экзоцитоз вовлекает прямое взаимодействие с SNARE белком, мембранным белком-2, ассоциированным с везикулой (53). Регулируемая транслокация TRPC5 из внутриклеточных везикул повышает вероятность того, что некоторые TRPCs будут конститутивно активны и вносисть вклад в катионный входящий поток при инкорпорации в ПМ (1).

TRPV

TRPV белки (Рис. 3) обладают ~25% гомологией с TRPC-каналами над областью пронизывающих мембрану доменов 5 и 6 (1). OSM-9 C. elegance и TRPV1 крыс – первые идентифицированные TRPVs (). Биофизические свойства OSM-9-зависимой проводимости не описаны, хотя такие PUFAs, как арахидоновая кислота, индуцируют Са-транзиенты и характерное поведение избегания (отмены) у ASH нейронов, которые экспрессируют OSM-9 и функционируют при осмо-, механо- и хемовосприятии (55). Такое индуцируемой арахидоновой кислотой повышение внутриклеточного Са не наблюдали у osm-9-мутанотов. Мутанты с дефектами в синтезе PUFAs проявляли сходные поведенческие феноипы, подтверждая этим, что OSM-9 могут активировться PUFAs (55).

Первые TRPV у млекопитающих идентифицировали с помощью экспрессионного клонирования при исследовании каналов, активируемых vanilloid веществом воспаления капсаицином, который придает острой пище горячий вкус (56) (Рис.3, талбл. 1). Кроме того, TRPV1 активируется теплом (≥43ºС) (56) и многими другими химическими веществами, которые включают эндоканнабиноид, anandamid, (57); местные обезболивающие, камфору (58); и острые (едкие) вещества, присутствующие в черном перце (пиперин) (59) и чесноке (аллицин) (60). Катионный входящий через TRPV1 ток, инициируемый действием ядовитых веществ или теплом, далее усиливается низкими рН (56). Так, рН ≤5,9, характерная особенность proalgesic тканевого ацидоза, связанного с повреждением, индуцирует сдвиг порогов тепловой активации TRPV1 так, что его можно активировать при комнатной температуре (1). Сдвиги порогов аткивации TRPV1 и активация капсаицин-опосредованных реакций вызываются также этанолом (63), никотином (62) и провоспалительными цитокинами (63). Кроме того, TRPV1 потенциируются снижением уровней PIP2 и ПКС-опосредованным фосфорилированием канала, оба из которых являются следствием активации ПКС, индуцируемой проальгезивными агентами, такими как брадикини и фактор роста нервов (1). Поэтому TRPV1 является интегратором большого числа сигналов, способным к трансдукции сигналов, вызываемых некоторыми вреднымит (ядовитыми) стимулами (табл. 1).

Активация теплом ­ свойство также TRPV2, TRPV3 и TRPV4. TRPV2 активируются вредным (опасным) теплом (≥ 52ºС), но не капсаиицином или изменениями рН (64)ю TRPV1 и TRPV2 экспрессируются в различных нейронах различных размером dorsal root ganglia (64), поодерживающих точность (fidelity) сигнализации в ответ на различные температуры. TRPV3 и TRPV4 активируются при теплых (warm) температурах в оласти 33 – 30ºС и 27 – 34ºС, соответственно (таюл.1) (1).

TRPV2 – 4 также активируются полимодально и способны к интегрированию различных стимулов. Функция TRPV2 активируется (upregulated) активацией фосфатидилинозитол-3-киназой (65) и разбуханием клетки, индуцируемым гипотоничностью (66). TRPV3 активируются в культивируемых клетках стимуляцией ФЛС (67); аппликацией таких PUFAs, как арахидоновая кислота (68); ментолом (69) и веществами, присутствующими в таких специях (пряностях), как oregano, гвоздика и тимьян (чебрец) (табл.1).

Помимо теплоты TRPV4 активируются внеклеточными гипотоническими растворами (1). Для аткивации TRPV4, индуцирумой гипотоничностью, необходимо его взаимодействие с водным каналом аквапорином 5 (70). Такие химичнсие вещества, как anandamid и арахидоновая кислота, активируют TRPV4 через механизм, вовлекающий цитохпром р450 –зависимое образование эпоксиэйкатриеновой кислоты (71). Различные пути, благодаря которым могут активироваться TRPV4, не возникают вследствие одного и того же механизма, так как точечная мутация 3-го трансмембранного домена ингибирует активации. Путем сильного нагревания, но не набуханием клетки или арахидоновой кислотой (72) (табл.1).

В соответствии с тем, что изменение осмолярности является эволюционно консервативным путем, для активации TRPV, TRPVs червя (OSM-9 и OCR-2) требуются для осмочувствительности, хотя неясно, активируются ли они непосредственно или опосредованно при изменении осмолярности. Тем не менее, белкиTRPV дрозофилы, Nanchung и Inactive, активируются гипоосмолярностью, когда экспрессируются в системе гетерологической экспрессии ().

TRPV5 и TRPV6 отличаются от других TRPV каналов тем, что не активируются при нагревании, а являются самыми Са-селективными из TRPs млекопитающих (Р_Са : Р_Та > 100) (1) (табл.1). TRPV6 обладают свойствами, сходными с депо-зависимой проводимостью, известной как Са-ток, активируемый высвобождением Са из CRAC (75). Хотя каналы проявляют высокую Са-селективность, в отсутствие внеклеточного Са они проницаемы для одновалентных катионов (75). Однако, некоторые биофизические свойства TRPV6 и CRAC имеют явные различия (76), и вовлечение Са- хранилищ в активацию TRPV6 остается противоречивым.

Активность некоторых TRPV-каналов регнулируется введинем их в ПМ или сохранением их там (табл.1). TRPV1 взаимодействуют с членами SNARE-зависимого экзоцитозного пути, и эти взаимодействия обеспечивают ПКС-опосредованную транслокацию TRPV1 к ПМ (77). Кроме того, такие проальгезивные факторы, как фактор роста нервов, активируют введение в поверхность TRPV1 через тирозиновое фосфорилирование канала, опосредованное Src-киназой.

Активность TRPV2 может также регулироваться введением канала в ПМ из внутриклеточных везикул, индуцируемым аппликацией фактора роста-1 типа инсулина на культивируемые клетки (1). Гликозилирование в петле поры () и взаимодействие с протеинами, называемыми PACSINs (вовлекаемые в перемещение синаптических везикул) (80), регулирует поверхностную экспрессию TRPV4. Внедрение TRPV5 и TRPV6 в ПМ также регулирует их активность (81). Удержание TRPV5 в ПМ активируется β-глюкоронидазой Klotho через гидролиз внеклеточных углеводных остатков на каналах (82).

TRPM

Субсемейство TRPM млекопитающих состоит из 8 членов (Рис.3), которые ~ на 20% идентичны а/к-последовательности TRPC-каналов относительно пяти С-терминальных трансмембранных доменов (1). Подобно TRPCs, белки TRPM имеют TRP-домен, С-терминальный по отношению к трансмембранным сегментам (Рис.2). Общая а/к-длина (~1000 – 2000) и последовательность С-терминальных областей этих белков значительно различаются. На основе сходства в а/к-последовательностях эти белки разделили на подгруппы, содержащие TRPM1/3? TRPM4/5 и TRPM6/7 (Рис.2). TRPM2 и TRPM8 не поместили ни водну из этих подгрупп, хотя они наиболее близко родственны друг другу. TRPM2 и TRPM6/7 необычны тем, что явлюятся chanzymes с С-терминальным и энзиматическими доменами.

Первый TRPM, TRPM1. который идентифицировали у млекопитающих, назвали сначала меластатин, так как уровни его экспрессии кореллировали обратно пропорционально с метастатическим потенциалом в некоторых линиях меланомных клеток (83). Помимо клона с полной длиной (TRPM1-L), короткий вариант TRPM1 (TRPM1-S), который лишен трансмембранных доменов, взаимодействует с TRPM!-L и ингибирует его транслокацию к ПМ (*;) (табл.2).

TRPM3 образует конститутивно активный проницаемый для Са и Mg канал, когда экзогенно экспрессируется в культивируемые клетки (85). Спонтанные токи через TRPM3 усиливаются с помощью гипертонических внеклеточных растворов и при клеточном набухании (85) (табл.2). TRPM3 могут активироваться истощением хранилищ (86) или сфинголипидами (87). TRPM обладаюм множественными вариантами соединений (splice) с различной ионной селективностью (88).

TRPM4 и TRPM5 – необычные среди суперсемейства TRP, так как они модулируются потенциалом, активируются Са и являются селективными каналами для одновалентных ионов (VCAMs) (89 – 93) (табл.2). Селективность к одновалентным ионам, которая ставит эти каналы независимо от других TRP, диктуется коротким кислым удлинением шести а/к-остатков в петле поры (94). TRPM4 экспрессируются как два splice (связанных) варианта (84, 90), один из которых (TRPM4b) является VCAM (89, 93), а другой (TRPM4a) проявляет слабо различимую активность (84, 89, 90). Зависимость TRPM4b TRPM5 от потенциала обеспечивает модуляцию активации и инактивации изменениями МП (91 – 93). Отсутствие проницаемости для Са, Са-активация и модуляция потенциалом говорят о том, что на активность VCAMs можно влиять активностью потенциал-зависимых Са-каналов. В свою очередь, активация VCAM бует снижать МП и движущую силу для Са через другие каналы (90).

TRPM4b и TRPM5, также как и многие другие TRP-каналы, модулируются PIP2, причем PIP2 изменяет (реверсирует) Са-зависимую десенситизацию каналов и посредством этого увеличивает канальную активность (91, 95, 96) (табл.2). TRPM5 чувствителен также к температуре и активируется нагреванием в области 15 – 35 ºС (97) (табл.2). Таким образом, TRPM5 – другой пример TRP-каналов, которые интегрируют тепловой вход с другими модами активации.

TRPM6 и TRPM7 каналы имеют необычную архитектуру, так как они являются chanzymes с С-терминальным атипичным протеинкиназным доменом (). TRPM7-канал, специфический для 2-хвалентных катионов, включая Mg и следы таких металлов, как Ni (100). Он является Mg-ингибируемым каналом, и так как это потоки Mg (99), ингибирование магнием обеспечивает эффективный путь регуляции по механизму обратной связи. TRPM6 chanzyme также проницаем для следовых металлов, Mg и Са и ингибируется внутриклеточным Mg (101) (табл.2).

Активность TRPM7 регулируется рН, АТФ, липидами и транслокацией. TRPM7 увеличивают свою активность (upregulated) в 10 раз после снижения внеклеточного рН до 7,4 (102). Таким образом, часть пула TRPM7 может располагаться в кислой окружающей среде, такой как кислые везикулы. АТФ значительно увеличивает токи через TRPM7 (98); однако основа для такого эффекта противоречива. TRPM7 могут увеличивать саою активность с помощью АТФ, образуя MgАТФ, который снижает концентрацию внутриклеточного Mg (99) (Табл.2). Возможен другой вариант – потребность в ПТФ может отражать расход АТФ для генерации (образования) PIP2, так как истощение PIP2 вызывает снижение активности TRPM7 (103). Относительно быстрое встривание TRPM7 в ПМ (< 2 мин) индуцируется физиологически релевантным (уместным) потоком жидкости, приводящим к увеличению его активности (104). TRPM7 экспрессируется в линии ГМК сосудов (104) и может активироваться кровотоком в местах, в которых нарушается эндотелиальная выстилка кровеносного сосуда.

Роль киназного домена у TRPM7 противоречива. Согласно одному из исследований, мутации АТФ-связывающей области киназного домена приводят к заметному снижению функции канала (98). В последствие показали, что мутации киназного домена не мешают (не предотвращают) активности канала, хотя они изменяют чувствительность канала к ингибированию Mg (105). Нуклеотид-опосредованное ингибирование TRPM7 зависит от нуклеотид-связывающего сайта в киназном домене, который работает одновременно с Mg-связывающим сайтом киназного домена на внешней стороне TRPM7 (106). Киназный домен также играет роль в перемщении или сборке канала (107).

TRPM2 – chanzyme с С-терминальным АДФ-рибоза фосфатным доменом (NUDT9 гомологичный домен) (108, 109). TRPM2 образует Са-проницаемый неспецифический катионный канал, который активируется внутриклеточной АДФ-рибозой, пиридиновыми нуклеотидами и NAD (108, 109) (табл. 2). Этот канал образует клеточный редокс-сенсор и активируется пироксидом или другими агентами, которые продуцируют реактивный кислород и виды азота (110) (табл. 2). Эта активация TRPM2 оксидативным и азотистым стрессами требует интактной расщелины (cleft), связывающей АДФ-рибозу в NUDT9 домене TRPM2 (). Далее, сАДФ-рибоза, арахидоновая кислота и внутриклеточный Са также положительно модулируют функции. TRPM2 () (табл. 2). Более короткий вариант TRPM2, который теряет последние 4 трансмембранных домена и С-конец, действует как доминантный негативный ингибитор TRPM2 (114).

TRPM8 – термически регулируемые каналы, активируемые средними температурами (< 23 – 28 ºС) и веществами, которые вызывают ощущение холода, такие как ментол, эукалиптол и ицелин (115, 116) (табл.2). Активацию холодом и ментолом можно разделить, так как некоторые мутации, оказывающие сильное влияние на активацию ментолом, обладают только минимальным влиянием на активацию холодом (117). Эти данные говорят о том, что домены, вовлекаемые в активацию ментолом и температурой, различны. Это доказывается также тем, что модуляция активности TRPM8 рН обладает эффектом, отличным от активации ицилином и холодом по сравнению с ментолом (118). Механизм термальной активности TRPV1 и TRPM8 горячими и холодными температурами, соответственно, по-видимому, сходны (119, 120). Эти каналы являются потенциал-зависимыми, и соответствующие их температурные активации, а также лиганды приводят к сдвигам их пороговых потенциалов к более физиологическим мембранным потенциалам (119, 120).

Активность TRPM8 регулируется также с поощью PIP2 (121) (табл. 2), так как истощение PIP2 снижает активность, индуцируемую ментолом или охлаждением. PIP2-опосредованная регуляция TRPM8 снижается при мутациях в основных а/к-остатках в TRP-домене (122). Хотя эти мутации влияют на PIP2-модулируемые реакции на ментол и на охлаждение (122), они лежат близко или по соседству с мутациями, идентифицированными при скрининге а/к-остатков, которые специфически функционируют при реакциях на ментол (117).

TRPA и TRPN

Первый белок TRPA, человеческий TRPA1, был идентифицирован при скрининге генов, downregulated вслед за онкогенной трансформацией фибробластов (123). TRPA1 – единственный белок TRPA, присутствующий у человека и других млекопитающих (1) и называемый ранее ANKTM1, так как белок состоит из большого числа N-терминальных анкириновых поворотов. Существует 2 и 4 белка TRPA, кодируемых в геноме C. elegance и дрозофилы, соответственно (Рис. 1с).

TRPA1 химически активируется психоактивным компонентом в марихуане, ирритантами в окружающей среде (Замечание! Может быть, NH3. являющисй ирритантом, тоже активирует этот тип каналов) и острыми (едкими) веществами. Они включают ингредиенты, присутствующие в wasabi, хрене и горчичных маслах (эфирах) (изтиоцианаты); чесноке (аллицин), коричном масле (цинамальдегид), марихуане (тетрагидрокаппабинол) и слезоточивых газах (acrolein) (60, 124 – 126). TRPA1 может активироваться также брадикинином и позже продуцируемыми метаболитами ДАГ и PUPFs (125) (таблю 2).

Существует противоречие по поводу того, являются ли TRPA1 тепло-или механочувствительными. При экзогенной экспрессии в культивируемые клетки TRPA1 отмечали как каналы, активируемые пагубным действием охлождения (< 17º С) (125, 126) (табл.2). Однако активация холодом TRPA1 в культивированных клетках (124) и у мышей, дефицитных по TRPA1, противоречива (126, 128). TRPA1 каналы у мышей и зебрафиш являются механочувствительными, а многочисленные анкириновые повороты TRPA1 могут образовывать воротную пружину, способную к трансдукции механической силы, и посредством этого к обеспечению открытия канала (129, 130). Однако анализ TRPA1-дефицитных мышей, описанный ниже, снижает такую возможность.

Несмотря на противоречия, касающиеся TRPA1, три TRPA дрозофилы (dTRPA1, Pyrexia и Painless) функционируют по термочувствительности. Хотя TRPA1 может быть термосенсором холода, TRPA1 дрозофилы и Pyrexia активируются in vitro теплом ( ≥ 24 - 27ºС) и вредным нагревом (≥ 40ºС), соответственно (131 – 133). Painless функционально не экспрессируется in vitro, но, как полагают, его ворота открываютс при вредном нагреве ( ≥ 38ºС) и изотиоцианатами, присутствующими в wasabi (134, 135).

Субсемейство TRPN названо так на основе найденного гена, NOMPC у дрозофилы (136). Одиночные представители TRPN присутствуют у червей, мух, зебрафиш, тогда как млекопитающие не кодируют каких-либо гомологов TRPN. Эти белки имеют 29 анкириновых поворотов, расположенных в тандеме N-конца с трансмембранными доменами. На основе функционального анализа, описанного ниже, они, вероятно, являются механочувствительными, вовлекающими воротную пружину, содержащую анкириновые повороты. Теперь существует недостаток функциональной информации, касающейся способности TRPNs образовывать каналы.

TRPP

TRPP2 (полицистин-2 или PKD2) – прототип TRPP канала и обнаружен как белок, разрушенный при ADPKD (10). TRPP2 и другая группа TRPs имеют очень низкое сходство в а/к-последовательности с представителямит группы 1 ответвляющегося суперсемейства TRP. Группа 2 TRPs также отличается от группы 1 большой петлей между трансмембранными доменами 1и 2 (Рис.6). Тем не менее, TRPP2 и родственные белки млекопитающих, называемые TRPP3 (полицистин-4 PKD2L1) и TRPP5 (PKD2L2) имеют 6 трансмембранных сегментов (1). TRPPs б/позвоночных описаны у C. elegance (137), дрозофилы (АМО) (138, 139) и морских ежей (suPC2) (140). TRPP2 могут составлять самое примитивное субсемейство TRP, как microbial гомологи TRPP2, обнаруженные у дрожжей (6).

Трансмембранные сегменты в TRPP2 имеют гомологию а/к-последовательности с 6 из 11 С-терминальных тансмембранных доменов другого белка, разрушенного у ADPKD, называемые TRPP1 (полицистин-1 или PKD1) (141). Этот белок, который включает ~ 2500 а/кислотный внеклеточный домен, называется также TRPP1 на основе родства его а/к-последовательнсти с TRPP2. TRPP2 связывается с TRPP1, и эта ассоциация индуцирует транслокцию TRPP2 к ПМ, где он служит в качестве Са-проницаемого неселективного катионного канала (1) (табл. 3). Транслокация TRPP2 к первичной ресничке, которая локализуется во многих клетках, требует удлинения (stretch) 15 а/к-остатка на N-конце TRPP2 и не зависит от TRPP1 (142). Шапероно-подрбные факторы могут также индуцировать транслокацию TRPP2 к ПМ из внутриклеточных пулов (143, 144). Комплексы TRPP1/TRPP2 могут вносить вклад в функцию TRPP2 на ПМ, так как анти-TRPP1 антитела могут индуцировать структурную реорганизацию, приводящую к активации TRPP2 (145). Далее, добавление С-терминального фрагмента TRPP1 может изменить канальную активность TRPP2 (146).

Активация TRPP2 может возникать благодаря механическому воздействию на воротный механизм или через пути трансдукции, инициируемые факторами роста. Наличие белков TRPP в подвижных и неподвижных ресничках может делать их способными к ощущению (sensing) потока, осмолярности и механического растяжения. В соответствии с этим, TRPP1 и TRPP2 могут вовлекаться в индуцируемое потоком повышение Са в культивируемых клетках почек (147) (табл. 3). Кроме того, эмбрионы, дефицитные по TRPP2, не проявляют нормального увеличения Са, индуцируемого потоком в нодальных ресничках (148). TRPP2 увеличивают EGF- нидуцируемый ФЛС-зависимый вход Са в култивируемые эпителиальные клетки почек (149). EGF активирует TRPP2-зависимый вход Са посредством повышения PIP2-индуцируемого ингибирования TRPP1 (149). Реконструкция TRPP2 в липидных бислоях и экзогенная экспрессия в культивированные клетки приводит к многочисленным состояниям проводимости, которые ингибируются Са и диуретиком амилоридом (150) (табл. 3). Канальная активность TRPP2 в липидных бислоях усиливается его взаимодействием с α-актинином, играющем роль для актинового цитоскелета в модуляции TRPP2 (151).

Помимо функционирования в качестве канала для входа катионов TRPP2 локализуются также в мембране ЭПР, где они, как полагают, служат в качестве нового типа канала Са-высвобождения (152). Гомолог TRPP2 у C.elegance также, по-видимому, является каналом Са-высвобождения и модулирует IP3- и рианодин-опосрдеованное высвобождение Са из внутриклеточных депо (153). Локализация TRPP2 в ЭПР у млекопитающих опосредуется phosphofurin кислым (acidic) кластером, сортирующим протеин-2 (PACS-2), взаимодействующий с кислым кластером в С-терминалях TRPP2 (154). Другое исследование отмечает, что TRPP2 воздействует на (impact) Са-высвобождение путем взаимодействия с IP3-рецептором, посредством чего модулируя IP3-зависиое Са-высвобождение (155). TRPP3 – потенциал-модулируемый Са-активируемый неселективный катионный канал (153). TRPP3 проницаем для одновалентных органических катионов (157).

TRPM

TRPML1 (mucolipin-1 or MCOLN1) – представитель TRPML субсемейства (7 – 9). Мутации этого белка ответственны за lysosomal storage disorder mucolipidosis IV, который характеризуется жесткой нейродегенерацией. Помимо TRPML1 млекопитающие кодируют 2 других близко родственных белка, обзначаемых как TRPML2 и TRPML3 (рис. 3) (1). TRPML1 и TRPML2 имеют сигналы, нацеленные на лизосомы, и располагаются в лизосомальной мембране (158 – 160). TRPML3 – преимущественнов мембране ЭПР, если их эеспрессировать в культивируемые клетки (158). Каждый геном C. elegance и дрозофилы кодирует один белок TRPML (Рис. 1с).

TRPML1 - единственный представитель этого субсемейства, который является катионным каналом. При экспрессии в ооциты Xenopus TRPML1 транслоцируют к ПМ при повышении Са и образуют неселективный Са-канал (161) (табл.3). Другие исследователи обнаружили, что TRPML1 обладает большим чилом состояний проводимости, чья функция ингибируется при снижении рН (162). Однако Са-проницаемость и рН-регуляция TRPML1 противоречивы. TRPML1 – канал, проницаемый для 1-валентных катионов (160), который пропускает Н^+, посредством чего обеспечивает пути утечки протонов, регулируя внутриклеточный рН (163).

Действительно, отсутствие TRPML1 приводит к закислению лизосомального содержимого (lumen) (163). Разрушение TRPML1 лизосомальной протеазой катепсином В (cathepsin B) инактивирует канал (160) (табл. 3). Так как катепсин В – высоко рН-чувствительный, это является элегантной моделью для регуляции функции TRPML1 по механизму обратной связи.

Гетеромультимиризация среди TRP белков

Для TRP суперсемейства белков характерно то, что близкородственные TRP каналы образуют гетеромультимеры. Гетеромультимиризация – эффективный путь для модуляции функции, субклеточной локализации и биофизических свойств взаимодействующих каналов. В глазах дрозофилы TRP в 10 раз более богаты, чем TRPL или TRPγи присутствуют главным образом в виде гомомультимеров. Однако TYRPL, по-видимому, образуют облигатные (обязательные) гетеромультимеры, приводя в результате к TRP/TRPL или TRPL/TRPγ гетеродимерам in vivo и при экзогенной экспрессии в культивируемые клетки (18, 20). Такая гетеромультимеризация обеспечивает механизм для регуляции проводимости канала, так как биофизические свойства гетеромультимеров отличаются от таковых гомомультимеров (18, 20).

TRPC белки млекопитающих также образуют гетеромультимеры. Взаимодействия гетеромультимеров имеют тенденцию to be favored между представителями, которые близко родственны друг другу (164, 165), хотя это не строгое правило. TRPC1 наиболее близко родствен TRPC4/TRPC5, а TRPC1 и TRPC5 имеют перекрывающееся распредление в гиппокампе и образуют гетеромультимерные каналы, когда коэкспрессируются в культивируемые клетки (166). Взаимодействие между TRPC1 и TRPC5 приводит к генерации нлвых проводимостей с биофизическими свойствами , отличающимися от таковых у TRPC1 и TRPC5 гомомультимеров (166). Кроме того, биохимический анализ идентифицировал TRPC1, TRPC4 и TRPC5 гетеромультимеры в мозгу эмбриона крысы, которые образуют каналы с новыми проводимостями при экспрессии in vitro (167).

TRPC1 может собираться вместе также с членами TRPC3/6/7 субсемейства (18, 167, 168). Нативные TRPC3 и TRPC6 взаимодействуют с TRPC1 в мозгу эмбриона крыс (167). Кроме того, проводимость, ассоциированная с TRPC3, в культивированных клетках требует коэкспрессии TRPC1 (167, 168). Существует доказательство для многочисленных комбинаций взаимодействий между TRPC1, TRPC3/6 и TRPC4/5 (167). Такие комбинации между различными TRP-белками могут генерировать невероятное разнообразие каналов с массой биофизических свойств и биологических функций.

Члены другого TRP-субсемейства также образуют гетеромультимеры. Белки TRPV у C. elegance OSM-9 и OCR-2 могут взаимодействовать In vivo, так как каждый из них требует для локализации другого в сенсорных ресничках (169). Сходные взаимодействия могут существовать также между TRPV протеинами дрозофилы, Nunchung и Inactive, так как устранение одного из протеинов In vivo приводит к нестабильности другого протеина (73). TRPV5 и TRPV6 образуют гетеромультимеры (81). TRPM6 и TRPM7 также собираются вместе, и это взаимодействие требуется для генерации новой проводимости, большей, чем проводимость одного из двух гомомультимеров, а также для внедрения TRPM6 в ПМ (170).Перемещение TRPM6 в ПМ, индуцируемое гетеромультимеризацией, имеет особое значение, так как мутации, которые разрушают взаимодействия между TRPM6 и TRPM7, не дают TRPM6 достич ПМ, приводя к гипомагниемии и гипокальциемии (170).

Гетеромультимерные взаимодействия среди группы 2 TRPs могут также влиять на субклеточное распределение каналов. С-терминаль TRPP1 взаимодействует с С-терминалью TRPP2, и как упомянуто выше, взаимодействие управляет (drive) транслокацией TRPP2 из внутриклеточных компартментов к ПМ (1). Другая группа 2 TRP каналов, TRPML1, сильно взаимодействует с близкородственным протеином TRPML3 и индуцирует транслокацию последнего к лизосомам, которые, по-видимому, являются конечным пунктом назначения TRPML-белка (158).

Супрамолекулярные комплексы

Некоторые TRP-белки ассоциируют с scaffold протеинами, которые соединяют каналы с большими макромолекулярными ансамблями. Ключевая функция таких комплексов – контроль субклеточного распределения ассоциированных TRP каналов.

Signalplex дрозофилы

Первое доказательство TRP-содержащих комплексов (signalplex) получено на фоторецепторах дрозофилы (23). Молеклярный scaffoled, который нуклеирует комплекс, - Inactivation No After Potential D (INAD), белок, содержащий в значительной степени 5 PDZ protein-protein iterection modules. INAD в дальнейшем увеличивает способность INAD одновременно связываться с многочисленными белками-мишенями в signalplex (23). Signalplex включает 2 типа белков: core noncore. Core-комплекс состоит из 4 белков – INAD, TRP, PLC (NORPA) и PKC - которые присутствуют при одинаковых концентрациях и, наиболее вероятно, конститутивно связаны с INAD (23). Кроме noncore INAD, связывающимися протеинами являются TRPL, родопсин, кальмодулин, миозин III (NINAC) и иммунофилин FKBP59 (23). Эти noncore белки не присутствуют в стехиометрической концентрации с INAD и могут транзиентно взаимодействовать с INAD.

Первичная функция sygnalplex – сохранять белки, которые содержат core- комплекс в светочувствительных микровиллах фоторецепторов, рабдомерах (15). Компонентами каскада фототрансдуции богаты рабдомеры, и мутации в гене, кодирующем INAD, разрушают рабдомерную локализацию TRP, PLC и PKC (23).Взаимодействие с INAD требуется для удержания (retention), а не для прицеливания этих белков к signalplex (171, 172). Кроме того, TRP, PLC и PKC нестабильны, когда они не удерживаются в signalplex из-за утраты взаимодействий с INAD (23). Это имеет важное физиологическое последствие, так как изменение стехиометрии этих сигнальных молекул снижает общую амплитуду и влияет на кинетику пркращения фото-реакции.

Существует рецепрокная потребность между INAD и TRP для удержания в рабдомерах. Помимо зависимости от INAD для локализации TRP, удержание INAD в рабдомерах требует связывания с TRP. Таким образом, TRP играет дополнительеую роль в качестве заякоревающего ьелка (171, 172).

Интуитивно может казаться, что основная функция нуклеации ключевых компонентов каскада фототрансдукции в signalplex – это способствовать быстрой сигнализации. Это очень притягательная гипотеза, так как входящий поток катионов происходит в течение миллисекунд от инициации каскада фототрансдукции. Однако прямой ассоциации между TRP и INAD не требуется для быстрой активации, так как устранение заимодействия TRP-INAD путем мутации INAD-связывающего сайта в TRP не влияет на фототрансдукцию (171). Мутированный TRP мог бы еще взаимодействовать с signalplex непосредственно через взаимодействия с другими INAD-связывающими белками. Тем не менее signalplex не играет значительной роли, так как разрушение миозина III (NINAC)/INAD-взаимодействия вызывает основательную задержку в окончании реакции. Этот дефект является результатом сигнализации, так как noncore INAD связывающие белки, такие как миозин III (NINAC), не зависят от INAD для нормальной стабильности или локализации в рабдомерах (23).

TRP- содержащие сигнальные комплексы у млекопитающих

TRP каналы млекопитающих также, по-видимому, собираются в макромолекулярные кмплексы. Нативные TRPC3 в нейронах pontine у крыс ассоциируются in vivo с BDNF рецептором TrkB (49). Другие члены комплекса TRPC3/TrkB не обнаружены. TRPC1 локализуется в обогащенных холестероломлипидных raft доменах, caveolae, где он, по-видимому, ассоциирует с IP3-рецептором и G_αq (173). Разрушение caveolae с помощью истощения холестерола предохраняет от входа Са (173). Хотя это не является прямым доказательством вовлечения макромолекулярного комплекса с TRPC1 для Са входа, это говорит о том, что разрушение таких специфических мембранных доменов, как липидные rafts, которые могут «давать убежище» (harbor) TRP- содержащим макромолекулярным коамплексам, предотвращают вход Са.

TRPC4 млекопитающих могут ассоциироваться с макромолекулярным коплексом, который включает двойной – PDZ-доменсодержащий протеин NHERF или (EBP50) (1). Взаимодействие между TRPC4 и NHERF требуется для транслокации канала к ПМ (1). Кроме того, NHERF может мультимеризоваться, давая возможность ему образовывать кластеры дополнительных проеинов. Известные NHERF-связывающие протеины включают ФЛС и G-белок-сопряженный β2-алренергический рецептор (1).

Кроме PDZ-домен-содержащих белков вещества, вовлекаемые в TRP сигнализацию, взаимодействуют также с различными изформами другого scaffoled протеина, назхываемого Homer. TRPC1 связывается с Homer в мозгу и локализует (размещает) его в клмплекс, который содержит IP3-рецепторы и группу 1 метаботропных глутаматных рецепторов (mGluR1) (174). Значение такого комплекса, ограниченного (привязанного – tether) Homer, подчеркивается вовлечением нативнs[ TRPC1 каналов в развитие проводимости в нейронах Пуркинье, индуцируемым mGluR1 (175). Кроме тогоЮ Homer1 существует в комплексе с TRPC3 и IP3-рецепторами и опосредует перемещение IP3 и открывание ворот IP3-рецеторами (176).

Функции TRPs

Суперсемейство TRP каналов участвует во множестве функций в возбудимых и невозбудимых клеткках. TRP кналы играют критическую роль в сенсорной физиологии. Это включает сенсорную роль в самых разнообразных восприятиях. TRP каналы важны не только для способности животных воспринимать окружающий мир, но и для способности отдельных клеток воспринимать свое локальное окружение.

Восприятие окружающего мира

TRP каналы играют важную роль в таких сенсорных модальностях, как осязание, слух, вкус, обоняние, зрение и ощущение температуры у животных от червей до мух, мышей и человека.

Хемочувствительность

Генетический анализ osm-9 гена у C. elegance, который кодирует один из двух archytypal TRPV протеинов, получил первое доказатнльство того, что TRP каналы участвуют в хемовосприятии (хемоощущении) (54). Мутации osm-9 (также, как и ген другого TRPV, ocr-2), вызывают дефекты в реакции на одоранты (54, 169). Если osm-9 и ocr-2 экспрессируются в клетках, которые воспринимают одоранты, то, вероятно, они вовлекаются в обонятельную трансдукцию. Кроме того, OSM- и OCR-белки требуются для многочисленных сенсорных модальностей, включая ноцицепцию и осмовосприятие (см. ниже).

Некоторые TRP каналы млекопитяющих требуются для хемовосприятия, один из которых (TRPM5) является каналом вкусовой трансдукции (177, 178). TRPM5 широко используются для вкусовой модальности, так как реакции на сладкое, горькое и а/к сильно снижаются иои совсем исчезают при нокауте гена TRPV5 у мышей (97, 178).

TRPC2 функционируют в реакциях на феромоны, которые у млекопитающих осуществляются с участием вомероназального органа. TRPC2 экспрессируются в вомероназальном органе (44), и самцы мышей, дефицитных по TRPC2, проявляют отличные поведенческие фенотипы. Они включают failure (срыв, сбой), который проявляется в агрессии к вторгающимся самцам и склонность спариваться с самцами или самками. Заслуживает внимания то, что TRPC2 является псевдогеном у человк (43), а вомероназальный орган у человека является, как правило, рудиментарным органом.

Помимо TRPM5 и TRPC2 термо-TRPs вносят вклад в восприятие химичесикх стимулов, поэтому функционируют при хемовосприятии (см.ниже).

Термочувствительность и ноцицепция

Многочисленные TRP каналы млекопитающих активируются при изменении температуры и объясняют большую часть температурной области, на которую реагируют млекопитающие. Как описано выше, TRPV1 и TRPV2 являются сенсорами для некамфортного тепла (> 43ºС) (56), и очено горячей температуры (> 52ºC) (64), соответственно, тогда как TRPV3 ( > 30 - 39ºС) (181 – 183) и TRPV4 (~25 - 34ºС) (184, 185) вносят вклад в восприятие средних температур. TRPM8, по-видимому, функционируют при нашем ощущении прохлады (115, 116), а TRPA1 могут быть сенсорном холода (127, 128); однако это последнее заключение противоречиво (124, 126). Хотя термоTRPs экспрессируются в таких нейронах, как те, которые находятся в дорзальном корешковом или тригеминальном ганглии, которые функционируют термовосприятии, TRPV3 и TRPV4 экспрессируются также в кератиноцитах кожи (181, 184). Эти каналы, по-видимому, активируются при нагревании в этих клетках кожи (181, 186, 187), хотя механищм, благодаря которому температура стимулирует вклад кератиноцитов в термовосприятие, остается темой обсуждения (188). Одна возможность заключается втом, что активированные кератиноциты высвобождают такой фактор, как АТФ, который активирует АТФ-регулируемый канал в сенсорных нейронах, которые иннервируют кожу (188).

Потребности в TRPV1, TRPV3 и TRPV4 при термовосприятии подтвердились у нокаутных мышей. TRPV1-дефицитные мыши не проявляют реакции на вредный нагрев до тех пор, пока температура не повысится до ~ 55ºС (189, 190). Мыши, у которых отсуствуют TRPV3, проявляют преимущественный термальный дефект в температурной области, совпадающей с биофизическим анализом.

Есле предоставлен выбор между 35 ºС и комнатной температурой, животные дикого типа имеют сильную склонность занимать 35ºС-зону, тогда как TRPV3-нокаутные мыши проявляют только слабое предпочтение к более высоким температурам (191). TRPV4^-1 –мутантные мыши также проявляют разнообразие поведенческих фенотипов, включая неспособность различать между 30 и 34ºС (192, 193).

Существует два сообщения, описывающие TRPA1-дефицитных мышей, и дефективны ли эти мыши в ощущении холодной температуры остается противоречивым. В соответствии с одним из исследований, TRPA1^-1—мыши не проявляют ухудшения при восприятиитемпературы (126). Тогда как второе исследование сообщает о дефекте при отдергивании лапы от холодной (0ºС0 поверхности (1128). Неясно, являются ли эти различия результатом небольших различий поведенческих образцов (пардигм) или продуктом обрезанных (trancated) версий TRPA1, которые, в свою очередь, могли бы влиять на другие каналы.

Несмотря на противоречия, касающиеся термовоспринимающей роли TRPA1, все три TRPs дрозофилы, которые функционируют как термочувствительные, являются TRPA-белками. Гомолог TRPA1 дрозофилы у млекопитающих, dTRPA1, играет роль в термотаксисе. Если предоставлен выбор между двумя температурными зонами, 27 – 31º С и 35 – 41º С, личинка дикого типа выбирает более прохладную зону. Снижение экспрессии dTRPA1 с помощью маленьких iterfering РНК (siRNAs), уничтожает это предпочтение (133). Если TRPA1 млекопитающих может быть сенсором холода (127), то dTRPA1 необходим для детекции тепла (warm) (123, 133). Painless (безболезненный), первый идентифицированный термоTRP у беспозвоночных, требуется для реакции избегания личинки при опасных нагревах (> 39 - 41ºС) (134). Другой TRPA1-белок,Pyrexia, необходим, чтобы муха выдерживала несколько минут воздействия жаркими температурами, такими как 40ºС, без достижения паралича (131).

ТермоTRP требуются также для реакции на химические стимулы

Общим свойством TRPs млекопитающих является то, что они реагируют на химические стимулы. Это свойство сначала было обнаружено для TRPV1. обеспечивающего молекулярное объяснение давно известного наблюдения, что такие вещества, как капсаицин, вызывают одно и то же ощущение в виде температурного нагрева (56). Кроме проявления ослабленной реакции на нагрев и ваниллоидные вещества, TRPV^-1-мыши дефицитны по своей реакции на Н⁺ и проявляют минимальную температурную гиперальгезию (189, 190), которая увеличивается проальгезивными агентами, продуцируемыми на стороне повреждения. Таким образом, TRPV1 – молекулярный интегратор вредных термических и химических стимулов. Хотя роль TRPA1 в качестве холодового сенсора еще обсуждаетя, существует согласие, что TRPA1^-1- животные дефицитны в своих реакциях на такие химические ирританты, как горчичное масло (126, 128). TRPA Painless дрозофилы требуется также для избегания изотиоцианата, который является острым (едким – puntgent) веществом, находящимся в wasabi и горчичном масле (135).

Термичесике и химические стимулы влияют на активность TRPM5 (97? 177? 178), и их конвергенция оказывает благоприятный эффект на реакцию на сладкие вкусы. Стимуляция нерва chorda tympani сахарами обычно увеличивается при температурах > 15 - 35ºС. Однако, остаточные реакции на сахара у TRPM5^-1—мышей не увеличивается при температуре (97). Таким образом, TRPM5, по-видимому, требуются дя усиления восприятия (ощущения, перцепции) сладостей при более высоких температурах.

Механочувствительность

По краней мере, один термо-TRP функционирует при механовосприятии. TRPV4 in vitro активируется гипотоничностью (194), а TRPV4^-1—мыши проявляют дефекты при осмотической регуляции (195). Роль TRPVs в осмочувствительности консервативна, так как TRPVs OSM-9 и OCR-2 у C. elegance требуются для избегания высокой осмолярности и механических стимулов помимо функционирования при хемовосприятии. TRPV4 крыс восстанавливают номальное избегание гипоосмотичности и механических стимулов у мутантных osm-9 червей, когда экспрессируются в те нейроны (ASH), которые нормально экспрессируют osm-9 и функционируют при этих модальностях (196). Загадка в том, TRPV4 in vitro активируются гипо-а не гипертоничностью. Роль TRPs в осмочувствительности проявляется также у дрожжей, так как белки TRPY функционируют при высвобождении Са из вакуолей в ответ на гиперосмотические условия (2,3).

Идентичность каналов слуховой трансдукции у млекопитающих не решена. Полагают, что такой канал экспрессируется на вершине стереоцилии волосковых клеток внутреннего уха, где механическая сила, опосредуемая через упругий воротный механизм (пружину), открывает каналы. TRPA1 был кандидатом для канала слуховой трансдукции, так как он располагается на вершине стереоцилии, а снижение экспрессии TRPA1 у зебрафиш и мышей с помощью morpholinas и siRNA, соответственно, снижает потенциалы, вызываемые звуками (129). Однако, у TRPA1^-1- -мышей слуховые реакции нормальные (126, 128). Предположили, что TRPA1 могут быть каналами слуховой трансдукции только в клетках в период раннего развития, так как morpholino и siRNA анализ проводили на ранней стадии развития зебрафиш и эмбрионов мышей, тогда как реакции у нокаутных животных анализировали у постнатальных мышей (128).

Два TRP канала млекопитающих функционируют в слуховой рецепции, однако на основе паттернов экспрессии и/или фенотипов мутантных животных ни тот ни другой не является, по-видимому, каналом трансдукции. Мыши с жесткими мутациями TRPML3 проявляют разнообразие фенотипов, включая прогрессивную дезорганизацию клеточных пучков во внутренних и наружных волосковых клетках (197). TRPML3 экспрессируется в везикулах по всему телу волосковых клеток, что заставляет предполагать, что он функционирует для везикулярного или внутриклеточного ионного гомеостазиса в волосковых клетках (197). Слуховая реакция нормальная у молодых TRPV4^-1- -мышей; однако у более старых мутантных мышей проявляется сильное снижение слуха (198). TRPN1 – канала механочувствительности у зебрафиш, так как РНК TRPN1 экспрессируется в волосковых клетках, а снижение экспрессии TRPN1 у личинок с помощью morpholinas снижало потенциалы, вызываемые звуком (199). У лягушек протеин TRPN1, по-видимому, не является каналом трансдукции, так как он не располагается в стереоцилиях, а вместо этого – в подвижных ресничках волосковых клеток (200).

Найденный протеин TRPN, NOMPC дрозофилы (136) и два протеина TRPV дрозофилы (Nanchng and Inactive) требуются для слухового восприятия (73, 74, 201). У животных дикого типа усиление слуховыъх сигналов нелинейно. Слабые сигналы значительно усиливаются вибрациями через механизм механической обратньй связи в механосенсорных клетках в антеннах. Однако nompC-мутантные мухи проявляют линейное усиление на всех уровнях слуховой стимуляции (201). У nanchung- and inactive-мутантов наблюдали конверсию, при которой оба проявляли глубокие дефекты слуха (73, 74) как результат чрезмерного усиления при более низких интенсивностях звука (201). Полагают, что так как для оборатной связи и усиления требуется канал механотрансдукции, то NOMPC является таким каналоим слуховой трансдукции (201). По крайней мере, должен быть один дополнительный такой канал, если при мутации nompC слуховая реакция не исчезает.

Предположение, что белок NOMPC является каналом слуховой трансдукции, совпадает с прежним сообщением, что он является каналом механотрансдукции, который требуется для осязания (136). Ген nompC экспрессируется в механочувствительных органах, а механорецепторные токи, генерируемые у животных дикого типа в ответ на отклонение сенсоных щетинок, отсутствует у nompC-мутантных мух. Мутантные животные проявляют поведенческие фенотипы – они нескоординированы и нечувствительны к легкому прикосновению. Ген trpA painless дрозофилы необязателен для нормальной реакции на легкое прикосновение, но функционирует в реакции избегания на опасные механические стимулы (134). TRP-4 – гомолог NOMPC червей и является каналом, чувствительным к растяжению, и мутации trp-4 вызывают локомоторные дефекты (202).

ФОТОТРАНСДУКЦИЯ

При условии, что фототрансдукция в палочках и клобочках млекопитающих обеспечивается через закрытие ГТФ-зависимых каналов, странно, что в фототрансдукции дрозофилы участвуют TRP каналы. Последние исследования показывают, что TRP каналы могут функционировать в небольшой подгруппе ганглиозных клеток сетчатки млекопитающих, которые являются фоточувствительными (pRGCs) и вносят вклад в циркадианный ритм (203). Эти pRGCs используют каскад фототрансдукции, которых сходен с фототрансдукцией у дрозофилы. Каскад запускается при световой стимуляции опсина, меланопсина и заканчивается деполяризацией клетки. Исследования гетерологической экспрессии показали, что световая активация меланопсина осуществляется через ФЛС и TRPC3 (204 – 206), однако неясно, какой TRP канал сопрягается с каскадом, активируемым светом, в pRGCs. Тем не менее, каскады, функционирующие в pRGCs и фоторецепторах дрозофилы, по-видимому, имеют общую природу.

Owsianik G., Talavera K., Voets T., Nilius B. Permeation and selectivity of TRP cnannels // Ann. Rev. Physiol. 2006. 68: 685 – 717.

Резюме. Ионные каналы – образующие поры трансимембранные белки, которые позволяют ионам проникать через биологические мембрагы. Структура поры играет критическую роль в детерминировании ионной проницаемости и селективных свойств отдельных каналов. В последнее днсятилдетие разработаны подходы для идентификации ключевых элементов участков пор различных классов ионных каналов. В этом обзоре суммируется современные представления о проницаемости и селективности канальных белков из семейства transition receptor potential (TRP). В то время, как все TRP каналы проницаемы для катионов, только два TRP канала непроницаемы для Са2 (TRPM4, TRPM5), а два других высоко проницаемы для СМа2 (TRPV5, TRPV6). Несмотря на активные исследования этого типа каналов, очень ограниченное число работ посвящено исследованию функциональной характеристики свойств поры, биофизических аспектов катионной проницаемости или описнию структур поры TRP каналов. В этом обзоре описываются существующие экспериментальные и теоретические данные и обсуждается функциональное влияние модификаций структуры поры на свойства TRP канала.

ВВЕДЕНИЕ

TRP каналы составляют большое т функционально разностороннее суперсемейство белков катионных каналов, которые экспрессируются во многих типах клеток от дрожжей до млекопитающих (1,2). По сравнении. с ионными каналами более классического типа, большинство TRP протеинов было обнаружено после того, как были клонированы кодированы их гены, и впоследствие охарактеоизованы после их сврхэкспрессии в гетерологических клеточных системах. Это привело к появлении.ю двух проблем: определение их функции как истинных (настоящего) ионных каналов и выяснение их физиологической роли.

Физиологическая роль любого данного ионного канала зависит от двух фундаментальных свойств: регуляция его открытого и закрытого состояния (gating) и его способность образовывать эффективный путь для определенных видов ионов, которые пересекают клеточную мембрану (селективность). Поэтому приоритеты при характеристике любых канальных протеинов должны быть в детерминировании свойств их проницаемости и селективности и в обеспечении связи между этими свойствами и структурой поры. Несмотря на многочисленные данные, говорящие о том, как эти многочисленные белки функционируют, эти исследования нашли два основных практических применения в области TRP. Во-первых, Экспериментальные манипуляции структурой белка, вызывющие изменения проводящих свойств, обеспечивают доказательством, что этот белок, действительно, является ионным каналом. Хорошо известно, что сверхэкспрессия экзогенных или эндогенных белков в определенных клеточных системах может вызывать активацию и/или upregulation эндогенных каналов. Таким образом, удачные измерения активности канала в клетках, экспрессирующих белок предполагаемого канала, даже когда эта активность не присутствует в контрольных клетках, не обязательно означает, что экспрессированный белок является пора-образующей канальной субъединицей (3). Поэтому мутации остатков кандидатных канальных белков, которые изменяют ионную селективность, проводимость одиночного канала или блокируют поры, обеспечивают убедительным доказательством, что тестируемый белок, действительно, является пора-образующей субъединицей ионного канала. Во-вторых, свойства проводимости ионных каналов обычно менее чувствительны к системы экспрессионного отбора, чем воротный механизм, модуляция и фармакологические свойства. Поэтому чвойства проводимости обеспечивают надежными признаками, которые можно использовать для установления связи новых идентифицированных канальных белков с их нативными копиями.

КОРОТКИЙ ОБЗОР СУПЕРСЕМЕЙСТВА TRP

TRP суперсемейство состоит из увеливающегося числа белков у позвоночных и песпозвоночных, объединяемых по их гомологии с продуктами trp гена дрозофилы, который вовлекается в восприятие света в глазах у мухи (4). На основе структурной гомолоии суперсемейство можно разделить на 7 основных субсеместв: TRPC (canonical), TRPV (vanilloid), TRPM (melastatin), TRPP (polycystin), TRPML (mucolipin), TRPA (ankyrin) and TRPN (no mechaoreceptor potential C, NOMPC) (2,5,6,) (табл.1). Все TRP каналы состоят из 6 предполагаемых трансмембранных участков (6 ТМ) и цитозольного амино- и карбокси-конца. Длина этих цитозольных хвостов сильно различается между субсемействами TRP каналов, которые делают их различные структурные и функциональные домены (Рис.1.) (1,2). Как и другие 6 ТМ пора-образующие белки, функциональные TRP каналы представляют собой гомо- или гетеромультимеры из 4 TRP субъединиц (7,8). Полагают, что область катион-проницаемой поры образуется коротким гидрофобным растяжением между ТМ5 и ТМ6.

По сравнению с интенсивно исследуемыми белками семейств ионных каналов, включая потенциалзависимые К-, Na- and Ca-каналы, хлорные каналы (регулятор цистофиброзной трансмембранной проводимости, CFTR, и хлорные каналы, CLC, CLC семейства), Na-селективные каналы эпителиального хлорного канала (EnaC)/acid-чувствующий ионный канала (ASIC/)degenerin суперсемейство и циклонуклеотидрегулируемые (СNG) каналы (9), понимание структуры поры и свойств прницаемости большинства членов суперсемейства TRP до сих пор очень ограничено. Несмотря на многочисленные функциональные исследования представителей семейств TRPC, TRPV and TRPM (2, 5, 6, 10, 11), которые определили TRP каналы как семейство genuine катионных каналов, анализ проницаемости и свойств поры далек от завершения. Мало известно о свойсивах пор вновь идентифицированных суперсемейств TRP, TRPA, TRPML, TRPP and TRPN. В этом обзоре представляюься функциональные и теоретические данные, касающиеся структурных и проницаемых свойств пор TRP каналов.