Инструмент для характеристики проницаемости и селективности ионных каналов.

Свойства проводимости ионных каналов исследуются с помощью имеющихся теорий, которые предполагают отдельные модели ион-ионного и ион-канального взаимодействий (9). В кратце, узкие поры способны различать различные катионы на основе их свойств пассивного сита (селективность по сортировке) и их катионного сродства (селективность по связыванию) (Рис. 2А).

Расчет проницаемости: Уравнение Гольдмана-Ходжкина-Каца

Теория Голдмана-Ходжкина-Каца - самая широко используемая из имеющихся теорий. Она приводит все взаимодействия поры с ионом к одиночному параметру, ионной проницаемости, и полагает, что ионы не взаимодействуют друг с другом (см. уравнение в оригинале). Подробно о расчетах – см. оргининал.

Электростатика ионной селективности: теория Eisenman (см. оригинал).

Проницаемость и селективные свойства trp каналов

TRPV каналы

В суперсемействе TRP проницаемость и селективные свойства описываются наиболее детально для семейства TRPV. У позвоночных идентифицировано шесть TRPV каналов (табл. 1). TRPV 1 опосредует ноноцепцию и вносит вклад в детекцию и интеграцию различных химических и тепловых стимулов (27, 28). TRPV 2 and TRPV 3 открываются при нагревании, активируясь в области теплого и вредного (опасного) нагревания, соответственно (29 – 32). TRPV 4 играет роль в осмочувствительности, ноцицепции и ощущении тепла (33 – 35). TRPV 5 and TRPV 6 являются высоко селективными для Са, которые играют роль при реабсорбции Са в почках и кишечнике (8, 14, 21, 22, 36 – 40).

TRPV 1/2/3/4 являются Са-проницаемыми с довольно низким различием между двухвалентными и одновалентными катионами (P_Ca/P_Na мужду 1 и 10) (см. Табл.1) (3, 16, 41, 42). Относительная проницаемость для одноваленьных катионов у TRPV 4 соответствует уравнению Eisenman IV, означая относительно weak-field-strenght связывающего сайта. Особенно TRPV 1 являются высоко проницаемыми для протонов, которые могут лежать в основе внутриклеточного закисления ноцицептивных нейронов псле активации канала (43). Наоборот, TRPV 5 and TRPV 6 являются высоко селективными каналами для Са, причем P_Ca/P_Na достигает 100. Такая высокая Са-селективность уникальна в TRP суперсемействе. TRPV 5 and TRPV 6 проявляют селективность по отношению к моновалентным катионам, соответствуя уравнению Eisenman X или XI (Na ~ Li > K > Cs). Для двухвалентных катионов Ca > Ba > Sr > Mn (14, 15, 20 – 22, 44).

Модель проницаемости Eyring, примененная к TRPVs

TRPV 5 and REPV 6 разделяют многие свойства проницаемости с классическими потенциал-зависимыми Са-каналами (9, 45 – 48). Характерным свойством высокоселективных Са-каналов является аномальный эффект mole фракции. При субмилимолярной концентрации Са эти каналы высоко проницаемы для одновалентных катионов (Рис. 2С). При увеличении концентрации Са каналы сначала блокируются, а затем начинают проводить Са. Высокая скорость переноса ионов порой Са-канала в случае потенциал-зависимого Са-канала L типа объясняется двумя моделями: модель отталкивания (49, 50, 51) и пошаговая (step) модель (52). Мы полказали, что такие модели можно применит также для пор TRPV 5/6 (32).

В пошаговой модели мы рассматриваем пору канала, в которой два низко-аффинных связывающих сайта располагаются сбоку (фланкируют) центрального высоко-аффинного связывающего сайта (Рис. 2D). В отсутствии внеклеточного Са канальная пора пригодна для проницаемости одновалентных катионов через канал. Однако а присутствии кальция связывающие сайты внутри поры будут преимущественно связываться с Са в результате их более высого связывающего сродства к Са по сравнению с Na. Блокирование однвалентных токов при наномолярной концентрации внеклеточного Са возникает благодаря связыванию одиночного иона Са в поре, который функционирует как пробка, закрывающая канал. Са течет при более высоких концентрациях внеклеточного Са с множественным завладением канальной поры, хотя вероятность обнаружения TRPV 5 поры при тройном Са-оккупированном состоянии очень низкая. (Рис. 2 Е). Управление ионной проницаемости является результатом шагов при связывающем сродстве, обеспечиваемымнизко-аффинными сайтами, как будто фланкирующие сайты обеспечивают ступенчатые шаги для того, чтобы ион выходил из канальной поры (52).

Самые явные различия между Са-каналами L-типа и TRPV 5 проявляются в высоте внутренних барьеров для Na и немного более высоким сродством к Са центральной well (скважина) в случае TRPV 5 (табл. 3). Эти различия объясняют существенно большую пролтность тока, измряемую при микромолярных концентрациях Са в случае TRPV 5. Этот анализ подчеркивает сходства в свойствах проницаемости TRPV 5 и чвойтств потенциалзависимого Са канала L-типа, которые можно описать механизмами, которые примиряют канальную спецпфпчность и высокие потоки Са в одиночной поре, занятой множеством ионов через шаги в связывающей энергии.

Доступ к поре TRPV 5

Структурно-функциональный анализ этого типа каналов сейчас наиболее существенный. Как показано на Рис. 3, области пор TRPV 5 шести млекопитающих проявляют значительную гомологическую последовательность с селективным фильтром К-канала бактерий (KcsA) (53, 54).Нейтрализация D⁵⁴⁶ у TRPV 1 и соответствующей D⁶⁸² у TRPV 4 резко снижает сродство каналов к блокатору потенциал-зависимой поры рутениевому красному и снижает проницаемость для Са и Mg (16, 55). Дополнительная мутация остатка D⁶⁷² у TRPV 4 дальше снижает селективность для двухвалентных катионов и изменяет проницаемость для одновалентных катионов, следующую из Eisenman IV по I (Рис. 4) (16). Замена отрицательно заряженной аминокислоты на М⁶⁸⁰ уничтожает проницаемость для Са и Mg в TRPV 4 (16). Таким образом, эксперименты ясно показывают, что область последовательности GM(L)GD в предполагаемой области поры TRPV 1/2/3/4 определяет свойства проницамости каналов и является функциональной копией области последовательности GYGD в селективном фильтре К-каналов. Неожиданно, мутация одиночного основного остатка в TRPV 4, Lys⁶⁷⁵ , который также присутствет в селективных фильтрах TRPV 1/2/3, но не в KcsA или TRPV 5/6, не повлияло на свойства проницаемости канала (16).

Аспартат одиночной поры определяет свойства проницаемотсти TRPV 5/6 каналов

Показано (15), что мутация аспартата на аланин в положнии D⁵⁴² of TRPV 5, которое соответствует D⁵⁴¹ of TRPV6 (Рис. 3А), уничтожает проницаемость для Са, ослабление Са-зависимого тока и блок внеклеточным Mg, тогда как проницаемость к одновалентным ионам остается по существу нитактной (Рис.5). Введение других незаряженных или отрицательно заряженных аминокислот в положение D⁵⁴² также уничтожает Са селективность, тогда как введение основных аминокислот (D^542K ) приводит в результате к нефункциональному каналу. Эти функциональные данные установили, что D⁵⁴² является критической детерминантой проводимости TRPV5 и ключевым элементом селективного фильтра. Другие отрицательно заряженные остатки в области поры TRPV5 оказывают более слабое влияние свойства поры. Мутации Е⁵³⁵ и D ⁵³⁰ обладают очень небольшим вличнием на свойства Са- проницаемости (15). Интересно отметить, что Е ⁵²² , локализованная на N-конце спирали поры, функционирует как предполагаемый рН-сенсор, регулирующий свойства рН-зависимой проницаемости у TRP5/6 (21, 56). Глутамат-глутаматная мутация, E522Q, снижает процессы, зависимые от внеклеточного рН, такие как уменьшение блока канала внеклеточным Mg при более щелочных условиях и снижение эффективности блока канала кальцием при низких рН (56).

Хароакткрным свойством TRPV5/6 каналов является блокирование поры внутриклеточным Mg (57, 58). В отсутствие внеклеточных двухвалентных катионов токи одновалентных катионов проявляют характерный потенциалзависимый воротный механизм и почти абсолютное inward rectification (Рис. 6). Эти два свойства являются зависимыми от потенциал-зависимого блокирования- разблокирования канала внутриклеточным Mg. Mg блокирует канал путем связывания с одиночным аспартатны остатком D⁵⁴¹  в поре TRPV6 (соответствующей D⁵⁴² of TRPV5) (Рис. 3А), где он взаимодействует с проникающими катионами. Блок ослабляется при положительных потенциалах, ознаяая, что при этих условиях Mg способен проникать через селективный фильтр канала. Нейтрализация D⁵⁴¹ уничтожает селективность к Mg, давая потенциал-независимые, moderately inwardly rectifying одновалентные токи в присутствии внутриклеточного Mg. Эти данные являются основными для понимания свойств поры TRPV5/6.

Таким образом, исходя из имеющихся данных, можно сделать вывод, что свойства селективности и проницаемости TRPV5 and TRPV6 определяются главным образом кольцом из 4 аспартатных остатков в канальной поре, похожим на кольцо из 4 отрицательных остатков (аспартаты и/или глутаматы) в поре потенциал-зависимых Са-каналов (59 – 61). Сходство последовательностей слабое между областями поры потенциал-зависимых Са-каналов и TRPV5/6 (Рис. 7), означая, что очень сходные функциональные свойства обусловливаются главным образом вхождением кольца из отрицательных зарядов в селективный фильтр. Тем не менее, архитектура поры TRPV5/6 каналов имеет такие же основные свойства, как у потенциал-зависимого Са-канала L-типа. (62).

Архитектура поры TRPV5 каналов

TRPV5 and TRPV6 могут генерировать ряд плейотропных гомо-и гетротетрамерных каналов с различной кинетикой транспорта Са (8). Более детально структуру поры получали с помощью метода замщенного цистеина (23, 63). Цистеины, вводимые в область, предшествующую D^542/541, проявляли цикличесикй паттерн реактивности, означая, что эти остатки формируют спираль поры, похлжую на таковую у кристаллической структуры KcsA. За спиралью поры следует селективный фильтр , который имеет диаметр ~ 5,4Å в своей самой узкой точке, которая определена путем измерения проницаемости для катионов увеличивающегося размера (23). Эти значения находятся между теми, которые известны для Са-каналов L-типа (6,2 Å ) (64) и Т-типа (5,1 Å) (65). TRPV1, по-видимому, имеют гораздо больший диаметр пор (>6,8 Å), так как он пропускает такие крупные одновалентные катионы, как N-метил-d-глюкамин (NMDG⁺) и тетраэтиламмоний (ТЕА⁺) (43). Диаметр поры TRPV6 значительно увеличивался, когда D⁵⁴¹ замещали на аминокислоты с более короткой боковой цепью, означая, что этот аспартат образует самую узкую часть селективного фильтра и вносит вклад в фильтрующие свойства поры. На основе этих данных и гомологии с KcsA. Сначала представили структуру поры TRP каналов (23, 63). Как показано на Рис 8, внешнее преддверие в TRPV5/6 окружено двумя основными структурными доменами: поровой спиралью ~ из 15 аминокислот, за которыми следует не геликоидальная (не спиральная) петля. В противоположность KcsA селективный фильтр TRPV6, по-видимому, выстилается боковыми цепями аминокислот, а не углеродами основы.

Каноническая проблема пор TRPC

Члены субсемейства TRPC разделяют самую высокую гомологию с первыми охарактеризованными TRP каналами от дрозофил и функционируют в основном как депо- и/или ФЛС-зависимый проницаемый для Са катионный канал (2, 66 – 68). У позвоночных существует 7 членов субсемейства TRPC (табл.1). Функциональные TRPC каналы представляют собой либо гомо- либо гетеротетрамеры с другими TRPCs (69). Они вовлекаются в такие различные процессы, как восприятие феромонов (TRPC2), вазорегуляцию (TRPC3/4/5), сигнализацию в ц.н.с. (TRPC1/3/4) и функционирование ГМК (TRPC3/6/7) (70 – 76).

Проводимость TRPC1/5: регуляция снаружи поры

Для исследования этой проблемы был проведен систематический мутагенез (85) всех отрицательно заряженных остатков, локализованных во внеклеточных петлях TRPC5. В то время как нейтрализация аспартатов и глутаматов в петлях между ТМ1 – ТМ2 и ТМ3 – ТМ4 не оказывала явного влияния, то нейтрализации трех из пяти глутаматов в петле между ТМ% и ТМ6 (Е⁵⁴³, Е⁵⁹⁵ и Е⁵⁹⁸) приводила в результате к потере La+3 потенциации. Кроме того, Е⁵⁹⁵/Е⁵⁹⁸ двойной мутант прявлял измененные свойства одиночного канала (Рис. 10А). Наоборот, мутация Е559 или Е570, локализованных в центральной части этой петли, не оказывала влияния на канальные свойства.

Экспрессия TRPC1 мутанта, у которого нейтрализовали все 7 отрицательно заряженных остатка в области между ТМ5 и ТМ6 (D to N and E to Q) (Рис.10А), приводила в результате к к сниженным Са-токам, но нормальным Na токам через TRPC1, и индуцировали изменения потенциала реверсии (86). Эти данные означают, что область TRPC1, образующая пору, также локализуется между ТМ5 и ТМ6. Сходные эффекты индуцироуются точечными мутациями E^576К и D^581К , но не D^581N и E^615К. Аналогично глутаматным остаткам, идентифицированным в TRPC5, отрицательно заряженные остатки, которые детерминируют свойства поры TRPC1, по-видимому, локализуются в дистальной части входа предполагаемой поры.

Исследование биогенеза и топологии TRPC1 (87) показали, что TRPC1 может потенциально образовывать 8 гидрофобных α-спиралей, но только 6 из них пронизывают мембрану. Одна из немембранных spanning α-спиралей локализуется в области между ТМ5 и ТМ6. Хотя α-спираль достаточно длинная, чтобы пронизать мембрану (23 аминокислоты, Рис.10А), она только частино входит в мембрану, означая, что она могла бы формировать поровую спираль, сходную с той, которая описана для KcsA and TRPV5/6. Замечательное свойство топологической модели (87) - в недостаточности в отрицательно заряженных остатков в области поры. В соответствии с этим, Обнаружено (88), что критический остаток для блока тока внутриклеточным Mg в TRPC5 гомотетрамерных каналах, D⁶³³, располагается внутриклеточно между концом ТМ6 и “TRP box” (Рис. 10В, С) (88). Замена D⁶³³ незаряженным или положительно заряженными остатками приводило в результате к заметному падению входящих токов и снижению Mg блока. В заключении, существующие данные показывают, что свойства проницаемости TRPC1/5 регулируются отрицательно заряженными остатками, которые, по-видимому, локализуются вблиз, но с наружной стороны существующей поровой области.

Таинственные поры TRPMs

Субсемейство TRPM у млекопитающих состоит из 6 членов, которые играют роль в таких различных процессах, как вкусовое восприятие (89 – 91), Mg гомеостазис (92 – 95), клеточная пролиферация (93, 96) и ощущение холода (97 – 99) (табл.1). Сходно с другими TRP каналами, предполагаемая пора-образующая область TRPM каналов может располагаться в петле между ТМ5 и ТМ6. TRPM4 and TRPM5 явлются единственными Са-непроницаемыми TRP каналами, известными на сегодняшнийдень (89, 101 – 102). TRPM3, TRPM2 and TRPM8 являются Са-проницаемыми катионными каналами с низкой селективностью (98, 99, 103 – 107), и TRPM6 and TRPM7 – относительно высоко проницаемы для двухвалентных катионов (3, 93, 94, 96). Функциональные свойства TRPM1 не охарактеризованы.

Сравнение последовательности ТМ5-ТМ6 петли показывает, что эта область консервативна среди всех членов семейства TRPM (Рис. 11А). Эта область состоит из гидрофобных удлинений, которые могут соответствовать спирали поры, за которой следует инвариантный аспартат (сайт D), который, возможно, локализуется в селективном фильте (108). Эти высоко гомологичные области TRPMs также разделяют ограниченную гомологию с KcsA and TRPVs каналами. Три других сайта содержат частично консервативные, отрицательно заряженные остатки между предполагаемой спиралью поры и полностью консервативный аспартат. Учитывая инвариантный аспартат, исследователи обнаружтлт, что эти сайты локализуются в положении -7 (сайт А), -3 (сайт В) и -2 (сайт С) (Рис.11 А). Вероятно, что этот кластер отрицательноых зарядов вносит вклад в свойства поры TRPM-каналов.

Первые представления о структуре поры TRPM

Структурно-функциональная связь вTRPM каналах исследуется эксперимннтально в течение последних лет. Были использованы (109) теоретические предположения предполагаемой поровой области TRPM каналов (Рис. 11В), как пусковой точки для идентификации остатков в TRPM4, котрые ответственны за проницаемость поры и ее блокады внутриклеточным спермином. Замена остатков Е981 на А986 с селективным фильтром у TRPV6 получила в результате функциональный канал, который сочетает отличительные признаки ворот у TRPM4 (активация Са, потенциал-зависимость) с TRPV6-подобной чувствительностью к блоку внеклеточным Са и M. Этот эксперимент обеспечил строгое указание на локализацию селективного фильтра у TRPM4. Замена Е981 на аланин резко снижало сродство канала к блоку спермином, тогда как мутации по обоим отрицательным зарядамв области были неэффективны (109). Это означает, что Е981 локализуется во внутренней части поры, где он доступен внутриклетосному спермину. Удивительно, чтомутации по соседним аспартатм, D982 and D984 сильно влияли на rundown и зависимость канала от потенциала. Замена Gln977 на глутамат (сайт А на Рис.11 А), соответствующего остатка в TRPM каналах, проницаемых для одновалентных катионов, изменяла последующую проницаемость к одновалентным катионам и приводила в результате к поре со средней проницаемость для Са. Таким образом, эти результаты означают, что предполагаемая область поры состоит из критических детерминант своств поры у TRPM4.

ВОСПРИЯТИЕ ЛОКАЛЬНОГО КЛЕТОЧНОГО ОКРУЖЕНИЯ.

Помимо восприятия стимулов из внешней среды TRP каналы обеспечивают клеткам способность реагпровать на сигналы в их локальном окружении.

TRPC каналы в наведении (guidance) конуса роста,

outgrowth нервного волокна и синаптической активности

TRP каналы играют роль при outgrowth нервного волокна и наведении конуса роста при развитии нервной системы. К известным сигнала наведения (guidance cues) относятся нетрины и BDNF, которые оказывают свои аттрактивные или репульсивные влияния на конусы роста через индукцию входа Са. TRPC3 были кандидатами для регуляции наведения конуса роста с помощью BDNF, так как он активируется с помощью BDNF в ходе развития мозга млекопитающих (49). В поддержку этой возможности говорит то, что нокдаун экспрессии TRPC3 с помощью siRNAs ингибирует BDNF-индуцируемый turning конусов роста в культивируемых церебральных гранулярных клетках (207). Сходно, снижение экспрессии TRPC1 у xenopus с помощью morpholinos, мешает turning конуса роста в ответ на действие нетрина-1 или BDNF (208, 209). Другой TRP канал, TRPC5, участвует в вытягивании нервного волокна, так как воздействие на гиппокампальные нейроны EGF способствует внедрению TRPC5 в ПМ, которое ингибирует outgrowth аксона (210).

TRPC каналы функционируют в постсинапической области в ответ на реакцию метаботропных рецептров. Активация метаботропных серотониновых рецепторов в дендритах интернейронов таламуса приводят к высвобождению нейротрансмиттера GABA (γ-аминобутириковая кислота) из дендритов и локальному GABA-ергическому ингибированию. В нейронах, получаемых от TRPC4^-1—нокаутных животных, высвобождение GABA из дендриоов сильно снижается в таламических интернейронах (211). В противоположность этой ингибиторной роли TRPC1, по-видимому, лежат в основе возбудительного постсинаптичекого тока, следующего за ативацией метаботропных глутаматных рецепторов в клетках Пкркинье, так как манипуляции, которые мешают активности TRPC1. снижают возбудительный постсинаптический ток (175).

СОСУДИСТЫЙ ТОНУС.

Вход Са в эндотелиальные клетки сосудов вызывает высвобождение вазоактивных веществ, которые, в свою очередь, индуцируют вход Са в ГМК сосудов и влияют на сосудистый тонус и кровяное давление. В эндотелии экспрессируется много TRP каналов и учатсвует в эндотелиальной функции, хотя самые убедительные гентические доказательства получены для TRPC4. Мыши, теряющие TRPC4, дефицитны по IP3-индуцируемому входящему Са-току и проявляют резкое снижение вазорелаксации (212). Удаление TRPC6 увеличивает сократимость ГМК сосудов и кровяное давление (213). Парадоксально, что существует увеличение базального катионного входящего потока. Этот последний эффект является результатом увеличения экаспрессии TRPC3, который в отсутсиве TRPC6 проявляет конститутивную активность. Эти последние результаты совпадают с доказательством, что TRPC6 and TRPC3 образуют гтеромультимер (43), и говорят, о том, что TRPC3 конститутивно активен в отсутствии TRPC6. Это результат is reminiscent подавления конститутивной активности TRPL дрозофилы при взаимодействии с TRP (18).

СЕКРЕЦИЯ ЖИДКОСТЕЙ И ГОРМОНОВ

TRP каналы играют важную роль в секреции жидкостей, электролитов и гомонов, у позвоночных и беспозвоночных. Помимо функционирования в фототрансдукции, TRPL требуется для Са-опосредованного транспорта жидкости в эпителии дрозофилы (214). У млекопитающих TRPC1 могут играть роль в секреции жидкостиЮ, когда экспресируются в клетках слюнных желез чедлвека, и уровень их экспрессии коррелирует с Са-входом и секрецией жидкости в этих клтках (215).

Два TRPM канала участвуют в секреции инсулина. TRPM4 экспрессируется в линии инсулиновых панкреатических β-клеток, и экспрессия доминантной негативной формы этого канала снижает секрецию инсулина, индуцируемую глюкозой (216).

Активация TRPM2 в этих клетках, по-видимому, требует циклической АДФ-рибозы и 37ºС, так как канал слабо активируется циклической АДФ-рибозой при 25ºС. Поэтому TRPM2 – дополнительный пример химического и термического входов, конвергирующих на TRP канале.

ФУНКЦИЯ ПОЧЕК, МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ И КОСТЕЙ

По крайней мере один TRP требуется для функции мочевого пузыря, так как мутации TRPV1 приводят в результате к увеличению емкости мочевого пузыря и неэффективному опорожнению (218). Уротелиальные клетки от TRPV1 ^-1--животных дефективны по стретч-индуцируемому высвобождению АТФ, который может лежать в основе фенотипа пузыря, так как пуринэргическая стимуляция связана с функцией пузыря. Неизвестно, является ли TRPV1 механочувствительным каналом или он реагирует непосредственно на растяжение мембраны.

Определенным доказательством того, что TRP каналы необходимы для почечной функции у человека является то, что мутации TRP каналов (см. раздел ниже) лежат в основе заболеваний почек. Удаление TRPV5 у мышей вызывает высокие уровни экскреции Са в мочу из-за дефекта реабсорбции Са вдоль дистальной конволюции (виток) почек, которая является областью экспрессии TRPV5 (219)/ TRPV5 экспрессируется также в остеокластах, а TRPV5^-1- животные деыективны по трансцеллюлярному транспорту Са в ходе резорпции кости остеокластами (22). Критическая роль TRPV5 в этих процессах совпадает с наблюдениями, что TRPV5 и высокородственный TRPV6 являются наиболее селективными для Са каналами среди TRPs млекопитающих (1).

У зебрафиш loss-of-fanction мутации TRPM7 приводят к карликовости, аномалиям скелета, образованию камней в почках, развитию melanophore и дефектам реакции на прикосновение (221). Кроме того, существует минерализация в mesonephric tubules и изменения в окостенении. TRPM7 проницаем для Са и Mg (99). В определенных типах клеток TRPM7 важны для жизнеспсобности, так как делеция TRPM7 в линии клеток DT-40 у циплят приводят в результате к летальности (99). Этот фенотип является результатом дефекта Mg-гомеостазиса, так как добавление его в среду избавляет от летальности (105).