1. Участие обонятельных рецепторных комплексов в рецепции одорантов

(Touhara, Vosshall, 2009 – обзор). Большое число OR подтверждает ценные свойства стереохимической теории Эймура. Хотя до сих пор мы не можем предсказать, какие одоранты будут связываться со специфическими Ors, или как отдельный одорант будет пахнуть, стереохимическая рецепторная теория остается доминирующей теорией в этой области. Другие теории остаются бездоказательными (9, 10).

Анализ аминокислотной последовательности показывает, что обонятельные рецепторы принадлежат к первому семейству (классу А) рецепторов, сопряженных с G-белком, который включает в свой состав рецепторы к опсину и катехоламинам. Их называют также серпантинными рецепторами. Их полипептидная цепь 7 раз пронизывает мембрану и имеет внеклеточные и внутриклеточные петли. Лиганд-связывающий домен формируется внеклеточными петлями рецептора. Конформационные изменения, вызванные образованием лиганд-рецепторного комплекса, позволяют внутриклеточным петлям взаимодействовать и связываться с G-белком (Eyster, 1998).

Обонятельные рецепторы кодируются мультигенным семейством, не имеющим себе равного по размерам и разнообразию. У млекопитающих репертуар ORs включает около 800 – 1500 членов, тогда как рыбы имеют небольшое семейство ORs из около 100 генов. Таким образом, экспансия (увеличение) генов для OR, вероятно, появилась с переходом животных из воды к наземному образу жизни. У позвоночных значительная часть семейства генов для ORs стала псевдогенами, приводя к потере большой фракции потенциально функциональных ORs у данного вида. У hominoids около 50% генов ORs приходится на псевдогены, тогда как у мышей и собак– 20%, а у приматов – 25 – 35% генов ORs приходится на псевдогены. Полагают, что при происхождении многих видов семейство генов для ORs подвергалось быстрой молекулярной эволюции путем тандемной генной дубликации и образования асевдогенов. Фракция псевдогенов увеличивалась в ходе эволюции от грызунов, обезъян и человека, означая, что снижение чувствительности обонятельной функции коррелирует с потерей функциональных генов ORs. Действительно, у китов и дельфинов, животных, у которых доминирует слуховая система, от 70% до 80% генов являются псевдогенами. Кроме того, гены для ORs являются высокополиморфными. Показано, что индивидуальные различия у человека в способности детектировать специфические запахи объясняются полиморфизмами одиночных нуклеотидов в генах ORs (Touhara, Vosshall, 2009 - обзор).

Число генов хеморецепторов у насекомых меньше, чем у большинства млекопитающих и ближе по числу генов у рыб. Геномный анализ идентифицировал 62 ORs и 68 вкусовых рецепторов (GRs) у дрозофил (54); 79 ORs и 72 GRs у москитов-переносчиков малярии Anopheles gambial (55); 170 ORs и 13 GRs у пчел Apis mellifera (56); 131 ORs и 88 GRs у перносчика желтой лихорадки и dengue вируса Aedes aeguptii (57); 341 ORs и 62 GRs у таракана (58, 59) и 660 ORs и 14 GRs у шелкового мотылька B.mori.

У насекомых обнаружено и меньшее по сравнению с позвоночными число псевдогенов. По аминокислотной последовательности ORs негомологичны позвоночным (Nouhara, Vosshall, 2009 - обзор).

Ген обонятельного рецептора человека был впервые идентифицирован в 1992 году. Детально охарактеризовано несколько их кластеров, а у некоторых геномных областей полностью определена акминокислотная последовательность. Идентифицированы 44 области, разбросанные по 13 хромосомам, 33 из них содержат последовательности, которые перекрываются с одной или более геномной областью. Вероятно, дубликации большого масштаба формируют существующий репертуар генов обонятельных рецепторов. Поэтому, по-видимому, обонятельных рецепторов больше, чем всех других известных сопряженных с G-белком рецепторных молекул, вместе взятых, что согласуется с их способностью распознавать широкую область структурно разнообразных пахучих лигандов (Sulivan et al., 1990; Buck, Axel, 1991; Dryer, Berghard, 1999; Mombaerts, 1999). Гены рецепторных молекул для одорантов обнаружены у насекомых, рыб, амфибий, птиц и млекопитающих, что говорит о том, что они имеют высокую степень гомологии и хорошо сохранились у всех видов (Dikielny et al., 1994; Ressler et al., 1994; Sulivan et al., 1995; Clyne et al.,1999; Dryer, Berghard, 1999; Kutsukake et al., 2000).

В работе Ache D.W. and Young J.M. (2005) дается характеристика генам обонятельных рецепторов. У многочисленных видов животных семейства генов, ответственных за детекцию одорантов, сходны, но семейства обонятельных рецепторов между видами на детальном уровне различаются. Это, вероятно, обусловливается тем, что для разных видов значение имеют различные группы химических сигналов и, вероятно, отражают эволюционную адаптацию к новым местам в окружающей среде, например, утилизация новых источников пищи. У человека обнаружено около 400, у мыши около 1200, а у крысы – около 1430 функциональных обонятельных рецептора в геноме (…). Существует большая вариабельность в размере семейства обонятельных рецепторов между видами. Авторы статьи подчеркивают, что обонятельные рецепторы образуют один из самых больших генных семейств: у крыс оно составляет около 6% функциональных генов в геноме, подчеркивая важность обоняния у этих видов. Заслуживает внимание то, что подгруппа генов в этом семействе может осуществлять не ольфакторные функции. Например, известен обонятельный рецептор человека, hol 17-4, который функционирует в testis, а также в носу, и реагирует на химические bourgeonal и позволяет сперме испытывать хемотаксис к bourgeonal источникам ().

В статье Ache D.W. and Young J.M. (2005) говориться о том, что геномы многих видов содержат большое число псевдогенов обонятельных рецепторов помимо функциональных обонятельных рецепторов. Многие из этих псевдогенов были однажды функциональными генами, которые претерпели инактивирующие мутации. Геном человека, например, содержит 400 функциональных генов ольфакторных рецепторов и сходное число псевдогенов обонятельных рецепторов (Glusman et al., 2001). Пропорция интактных генов обонятельных рецепторов и псевдогенов сильно варьирует между видами и может отражать, насколько каждый вид положился на обоняние для выживания и размножение в ходе эволюции. Сниженная потребность в усложнении потребности в обонянии может в результате привести к ослаблению селективного давления, которое обычно устраняет инактивирующие мутации из геномного пула и таким образом, аккумуляцию псевдогенов. По данным авторов этой статьи, некоторые авторы отмечают, что уменьшение геномного семейства обонятельных рецепторов у некоторых приматов совпадает с приобретением 3-цветного зрения и указывает на то, что улучшение зрительных возможностей сделало обоняние частично излишним. Однако, исходя из современных данных, человек может быть способен к детекции почти стольких же одорантов, как и мыши (поскольку геномный репертуар мыши включает большое субсемейство обонятельных рецепторов человека), поскольку способен распознавать сходные запахи.

Ссылаясь на данные различных авторов, в статье Ache D.W. and Young J.M. (2005) отмечается, что замечательным свойством обонятельной системы млекопитающих является то, что каждая рецепторная клетка в эпителии, по-видимому, транскрибирует (расшифровывает) только одну аллель только одного из многих функциональных рецепторных генов. Режим “singular expression” гарантирует, что реакции от различных рецепторов сегреггируют в различных реагирующих клетках, таким образом, обеспечивая различение между разными одорантами. Аксоны от обонятельных клеток, экспрессирующих один и тот же обонятельный рецептор, конвергируют на ограниченное число мест в ОЛ мозга, интегрирующие сигналы от функционально идентичных обонятельных клеток.

Насчитывают 913 обонятельных рецепторов у мышей и 339 – у человека (Hall S.E. et al., 2004). Очень мало работ на молекулярном уровне посвящено тому, как и где каждый одорант связывается с обонятельным рецептором и как это приводит к их активации. Основное препятствие для получения такой информации на молекулярном уровне кроется в отсутствии информации о трех-мерной структуре для каждого обонятельного рецептора.

Функциональное доказательство того, что ORs распознают одоранты, получено путем анализа гомологических и гетерологических систем экспрессии, когда пытаются соединить OR с родственным ему лигандом. Обонятельные клетки сами являются гомологической системой экспрессии, которая обеспечивает соответствующий механизм для экспрессии ORs и передачи обонятельных сигналов. При этом экспрессированный OR реагирует на рлсдственный ему лиганд (Touhara, Vosshall, 2009 - обзор).

Функциональные ORs экспрессируют в такие гетерологические системкы, как клеточные линии млекопитающих и ооциты Xenopus laevis, что делает возможным анализ чувствительности OR к одоранту (16, 17, 72 - 76). Однако полагают, что экспрессия ORs в гетерологических клетках каверзна, так как OR, по-видимому, не способен транслоцироваться к плазматической мембране. Вместе с тем функциональным OR становится только при его стабилизации на клеточной поверхности. Кроме того, для повышения эффективности сигнальной трансдукции ORs необходима коэкспрессия Ric8B, предполагаемого фактора обмена гуаниновыми нуклеотидами для Gα_s и Gα_olf. Помимо этих попыток усилить экспрессию и сигнальную тансдукцию предпринимается и ряд других (Touhara, Vosshall, 2009 - обзор).

В ORs различают консервативную и вариабельную части.

ORs обладают 7 гидрофобными трансмембранными доменами, дисульфидными связями между консервативными цистеинами во внеклеточных петлях, консервативным сайтом гликозилирования в N-терминальной области (80) и несколькими паттернами аминокислотной последовательност, которые консервативны в семействе ORs (81,82). Полагают, что эти консервативные мотивы вносят вклад в правильное складывание (расположение - folding) и транспортирование к мембране (membrane trafficing) OR так, чтобы ORs могли функционировать при связывании с одорантами и сорпяжении с ссответствующими G-белками. Наоборот, трансмембранные области относительно вариабельны и могут играть роль в образовании одорант-связывающего кармана, так что вариабильность в этих доменах позволяет ORs покрывать большое разнообразие молекул одорантов в спектре лигандного распознавания (83 - 88) (Touhara, Vosshall, 2009 - обзор).

Так, функциональный анализ site-directed мутантов и исследования по ligand docking simulation показали, что большинство основных (критических) аминокислотных остатков, вовлекаемых в распознавание одорантов, явялются гидрофобными и локализуются в пределах (внутри) связывающего кармана, образованного трансмембранными доменами ТМ3, ТМ5 и ТМ6 (89). Кроме того, точность связывающей модели подтверждалась тем, что изменение одного аминокислотного остатка вызывали предсказуемые изменения в специфичности агониста или антагониста. Это означает, что ORs позвоночных распознают размер, форму и функциональную группу одоранта, используя водородные связи и гидрофобные взаимодействия в одорант-связывающем кармане, образованном трансмембранными спиралями (Touhara, Vosshall, 2009 - обзор).

Суть предложенной комбинаторной стратегии кодирования состоит в том, что каждый одорант распознается подгруппой ORs, которые являются единственными (уникальными) для одоранта (90). ORs, которые распознают много одорантов с широкой областью структур, определяются как широко настроенные или generalist receptor. Эта стратегия перекрывающегося кодирования может представлять молекулярную основу для дискриминативной силы обонятельной системы. Наоборот, некоторые ORs детектируют определенные молекулы одорантов и относятся к узко настроенным или специализированным рецепторам. Такие узко настроенные рецепторы могут служить связующим звеном для сигналов, которые активируют специализированные цепи (круги) в мозге, приводя в результате к дискретному поведению или нероэндокринным изменениям по типу феромонов.

В настоящее время Hall S.E. et al. (2004) разработали компьютерный метод, посредством которого можно предсказывать 3-мерную структуру, а также одорант связывающий сайт для обонятельных рецепторов. Предсказываемые модели подтверждали экспериментальными данными. Авторы построили 3-мерную структуру для для обонятельных рецепторов М-17 мыши и R-17 крысы, которые содержат 130 амнокислотный остаток. Они на 95% идентичны по аминокислотной последовательности, различаясь на 15 аминокислотных остатков, 4 из которых локализуются в ТМ области. Однако несмотря на такое высокое сходство, они обладают различной активностью к одорантам.

Hall et al. (2004) описывают предсказываемую 3-мерную структуру М-17 и R-17 обонятельных рецепторов на атомарном уровне, сайты связывания для одорантов, которые активируют эти рецепторы, и энергию связывания для одорантов и этих сайтов. Как показали авторы, их расчетные данные хорошо коррелируют с экспериментальными данными других авторов. Показали, что из 6 классов одорантов (спирты, кетоны, альдегиды, эфиры, кислоты и амины) М-17 и R-17 активируют только альдегиды. Следует отметить, что существующие экспериментальные данные используют метод оценки увеличения внутриклеточного кальция в качестве меры не только связывания одорагнта с рецептором, но и меры активации одорантом своего рецептора. Вместе с тем при теоретических расчетах определяется связывающий сайт и энергия связывания, а не процесс активации обонятельного рецептора. Сильное связывание – необходимое, но не достаточное условие активации рецептора. Таким образом, некоторые одоранты, которые, как полагают, имеют хорошую энергию связывания, не могут связываться в правильной конфигурации, чтобы активировать обонятельные рецептора, и служат, вероятно, в качестве антагонистов. Например, как полагают авторы, lilial (альдегид) и lyral (альдегид) по их теоретическим данным должны хорошо связываться с обонятельными рецепторами. Однако по данным экспериментов они не активируют рецепторы (нет реакции внутриклеточного кальция на эти стимулы). Предлагается 2 объяснения для этого различия между энергией связывания и активацией: 1 – в экспериментах исследовалось влияние только смесей этих веществ, что делает сравнение теории с экспериментами сомнительными, так как смеси могли содержать антагонисты; и 2 – возможно, lilial lyral сами могут быть антагонистами для этих 17 обонятельных рецепторов крыс и мышей.

В данной работе показаны предполагаемые сайты связывания M-17 и R-17 (hom) с octanal (альдегид), который по экспериментальным данным является агонистом для этих рецепторов. Связывающий карман для него располагаться на глубине в ~10 А от внеклеточной поверхности. Это похоже на карман 11 cis-ретиналя в родопсине быка. Показано, что лиганд-связывающий карман локализуется между 3,4 и 6 спиральными ТМ. У различных подтипов обонятельных рецепторов аминокислотные остатки, непосредственно связывающиеся с одорантом, разные. Поэтому у различных подтипов обонятельных рецепторов конфигурация кармана разная. Вместе с тем, для таких альдегидов, как octanal, citral, citronellal (+) и (-), heptanal и trans-cinnamaldehyde к M-17, как полагают, конфигурация связывающего сайта сходна. Для каждого лиганда длинная ось одоранта параллельна мембране. У всех этих агонистов альдегидная функциональная группа имеет водородную связь с Lys 164. Имеющиеся в кармане такие аминокислотные остатки, как Cys 114, Cys 117, Phe 205, подстраивают конфигурацию сайта под размер одоранта, чтобы обеспечить водородную связь с Lys 164.

Для связывающего сайта в R-17 (hom) рецепторе также альдегидная функциональная группа образует водородные саязи с Lys 164. Однако конфигурация кармана у этого рецептора отличается от M-17, что, вероятно, объясняет различия в способности связываться с одинаковыми одорантами у этих рецепторов. Эти различия обусловлены присутствием разных аминокислотных остатков в этих карманах, а также различным их расположением в каждом из них.

В работе Hall et al. (2004) расчетным путем показано, что одранты могут связываться со своим рецептором не по принципу “ключ-замок”, а подстраиваясь под конфигурацию активного центра рецептора. Decanal (альдегид) к M-17 и R-17 связывается с сайтами этих рецепторов сходным образом с octanal (альдегид). Однако decanal должен закуручиваться (изгибаться - twist) вдоль своей длинной оси (горизонтально) для того, чтобы приспособиться к связывающему сайту. Это обусловливается Ile 255, Ala 258, Ala 259, Ser 280, Tyr 283, которые мешают протяжению (распрямиться) этого альдегида. Со ссылкой на начальные экспериментальные результаты других авторов они говорят о том, что эти результаты не обнаружили активации деканолом. Однако более поздние эксперименты показали, что активирует рецептор, но медленнее, чем heptanol у М-17, что вероятно связано с необходимостью изгибания молекулы для приспособления к связывающему сайту. Авторы полагают, что способность не только связываться с рецептором, но и активировать его зависит от размера молекулы действующего одоранта.

Существует гипотеза, согласно которой область между вторым и шестым трансмембранными доменами обонятельного рецептора образует карман (pocket) для связывания с лигандом. Семейство генов кодирует синтез обонятельных рецепторных молекул у млекопитающих, обладающих значительным разнообразием аминокислотных последовательностей внутри этой предполагаемой зоны связывания, чем, вероятно, обусловлено такое разнообразие рецепторов (Shepherd, 1991; Dryer, Berghard, 1999; Mombaerts, 1999). Гены обонятельных рецепторов по способности образовывать друг с другом гибриды группируют в субсемейства. Члены одного и того же субсемейства кодируют рецепторы, гомологичные по аминокислотной последовательности и поэтому могут распознавать один и тот же или сходный одорант (Ressler et al., 1994).

В работе Floriano W.B. et al. (2000) исследовались механизмы, лежащие в основе различных ответов обонятельного рецептора мыши. С их точки зрения, господствующее мнение о том, что для G-сопряженных рецепторов каждый рецептор узко настроен на свой лиганд и близко родственный агонист, неприменимо для обонятельных рецепторов. Они являются самым большим семейством генов в геноме. Они взаимодействуют с десятками тысяч одорантов, которые составляют “запаховое пространство”. Обонятельные рецепторы взаимодействуют с большим разнообразием структур и поэтому, как полагают, должны проявлять большое структурное разнообразие в лиганд-связывающкй области. Гиперизменчивые области в обонятельных рецепторах идентифицированы в трансмембранных доменах ТМ 3 – 5 (см ссылки в этой работе), и они, вероятно, вовлекаются в связывание одоранта.

Понимание того, как это взаимодействие происходит, является важным для понимания ощущения запаха. Встают следующие ключевые вопросы: 1) существует ли карман для связывания? 2) Какой аминокислотный остаток в этом кармане вносит вклад в максимальное сродство? 3) Как изменяется сродство при изменении структуры агониста?

Чтобы ответить на эти вопросы, авторы комбинировали результаты, полученные методом PCR-анализа одиночной клетки, и метод компьютерного моделирования структуры специфического обонятельного рецептора (OR S25 он реагирует только на гексанол и гептанол) и его взаимодействия с 24 пахучими веществами. Структура этого рецептора не только имела вероятный (подходящий) одорант-связывающий сайт, но и предсказывала 2 вещества, которые в эксперименте лучше всего активировали этот рецептор. Кроме этих двух одорантов, расчетные предсказания указывают на пентанол, с которым этот рецептор мог бы связываться. Однако для него нужны гораздо более высокие концентрации.

Авторы показали, что карман для связывания с гептанолом и гексанолом располагается между ТМ 3 – 7 на глубине около 10 А от внеклеточной поверхности. Это похоже на эпинефринсвязывающий карман бета-адренергического рецептора. По результатам компьютерного моделирования ТМ 3,5 и 6 имеют аминокислотные остатки, которые непосредственно вовлекаются в связывание. Считают, что ТМ4 может играть важную роль при связывании, так как он упаковывается против ТМ3 и ТМ5 и поэтому может изменять их относительное положение, если ключевые остатки ТМ4 мутированы. В связывание вовлекаются ТМ3, 4 и 5. Показано, что гексанол-гептанол связывающий сайт образуют 15 аминокислотных остатка, которые проявляют высокую изменчивость в линейной последовательности обонятельного рецептора, которая соответствует их участию в связывании различных одорантов с различными подтипами OR S25. Критическим аминокислотным остатком для связывания OR S25 со спиртами является Lys-302, который связывает протон с гидроксильной группой. Наличие этого критического Lys на ТМ7 напоминаете близкородственный родопсин, где Lys-296 (ТМ7) связывается с хромофором ретиналем. Замены в этом остатке могут переключить специфичность рецептора на другие функциональные группы (то есть, специфичность рецептора к взаимодействиущему с ним лиганду изменяется при разных аминокислотных остатках в сайтах связывания.) Другие рецепторы, как уже отмечали, имеют в этом положении Val, Ser и Ile остатки. Специфичность обонятельного рецептора S-25 к веществам с 6 – 7 атомами углерода обусловливается гидрофобными остатками Phe-225, Leu-131, Val-135 и Ala-230, которые образуют Ван-дер-Ваальсовы связи с лигандом. Построенная модель кармана связывающего сайта позволила авторам предположить, что гидрофобные замены в этих областях будут модулировать предпочитаемую длину С-цепочки. В частности, модель предсказывает, что замены Val на Phe-225 и Val на Leu-131, будет создавать большее пространство в кармане и сдвигать его специфичность к более крупным лигандам. Полагают, что замена Phe на Leu-131 будет иметь противоположный эффект. Авторы считают, что полярные остатки Thr-284 и Gln-300 также располагаются в близком контакте с лигандом, ноне вносят никакого вклада в специфическое связывание с протоном. Полагают, что эти остатки могут играть важную роль для взаимодействия обонятельного рецептора S-25 с другими веществами. Таким образом, в модели идентифицированы предполагаемые аминокислотные остатки, которые, вероятно, вносят вклад в различное сродство специфического обонятельного рецептора к различным пахучим лигандам.

В работе Floriano W.B. et al. (2004) авторы использовали компьютерный метод для предсказания 3-мерной структуры шести обонятельных рецепторов мыши (S6, S18, S19, S25, S46, S50), для которых найдены экаспериментальные профили распознавания одорнатов для группы из 24 одорантов (алифатические спирты, кислоты, bromo-acids and diacids с 4 – 9 атомами углерода). Авторы определяли потенциальные сайты связывания одоранта и энергии связывания каждого одоранта в этих связывающих сайтах. Они показали, что для каждого их шести обонятельных рецепторов связывающий сайт располагается между трансмембранными доменами (ТМ) 3 – 6 с участием внеклеточных петель 2 и 3. То есть в связывающий сайт входят гидрофильные и гидрофобные участки. Различия в распознавании одорантов определяются теми (критическими) аминокислотными остатками, которые входят в состав связывающего сайта. Поэтому даже если различные обонятельные рецепторы сходны по своим химическим свойствам, сродство их к различным одорантам будет, по-видимому, разное. У обонятельных рецепторов семейства GPCRs, в отличие от других членов этого семейства рецепторов, отмечают очень высокую вариабильность аминокислотных последовательностей, что, вероятно, обеспечивает им способность распознавать различные запахи. Экспериментально показано, что S25 рецептор связывается с гексанолом и гептанолом. Рассчитанный авторами профиль сродства связывания для С4 – С9 линейных спиртовых групп показывает, что он является паттерном структурных свойств, а не специфической молекулярной структурой, которая триггирует узнавание. Авторы обнаружили, что связывающий сайт для гексанола и гептанола в S25 рецепторе включает спиральные домены ТМ3, ТМ4, ТМ5 и ТМ6, что совпадает с данными, полученными при компьютерном моделировании 17 OR. Эти данные подтверждаются также в экспериментах с использованием мутаций для связывания дофамина с биогенными аминными рецепторами. В своей работе авторы нашли хорошее совпадение между предполагаемыми ими профилями связывания и экспериментально полученными профилями активности. В своей работе они предположили структуру шести обонятельных рецепторов, для которых другими авторами были получены экспериментальные данные взаимодействия одорантов с этими рецепторами. В этой работе они предполагают связывающие сайты для 24 алифатических одорантов, для которых рассчитали энергии связывания. Однако, по мнению авторов, расчет энергии активации является необходимым, но недостаточным условием для активации рецептора. Некоторые одоранты могут связываться с рецептором, но не могут его активировать.

По рассчитанным профилям распознавания для S50 и S6 показали, что эти рецепторы лучше всего распознают класс алифатических diacids. Рассчитали, что в пределах этого класса S50 обладает преимущественным сродством связывания с azeliac acid (C9 diacid). Этот одорант является единственным из 24, который вызывал реакцию в экспериментах. Если теоретически для одного и того же рецептора (S6) предсказывалась высокая энергия связывания для двух одорантов одного и того же класса (например, suberic acid, C8 diacid, и pimelic acid, C7 diacid), то в эксперименте suberic acid и pimelic acid вызывали значительно более слабую реакцию, чем azelic acid. При этом, по мнению автора, потребуется или большая концентрация или более длительное время воздействия. (Я считаю, что это подтверждает то, что с одним обонятельным рецептором с высоким сродством связывается один одорант).

Классифицируя одоранты по предполагаемой энергии связывания для S18, S19 и S4, в работе показали, что одоранты, которые в эксперименте вызывают реакции, имеют более подходящие энергии связывания, чем одоранты, не вызывающие реакций. Однако расчеты энергии связывания имеют свои недостатки, объясняющиеся тем, что учитывается только преобладание электрического вклада в энергию связывания заряженных одорантов или недооцениваются Н⁺ -связи в энергии лиганд-рецепторного комплекса. Кроме того, энергии связывания рассчитываются при температуре обонятельных клеток и не включают энтропийные эффекты.

Предполагаемые профили связывания для S25 хорошо согласуются с экспериментальными. Полагают, что с этим рецептором гораздо сильнее связываются спирты, чем любое вещество из других трех исследуемых классов одорантов. Внутри класса спиртов гептанол и гексанол, которые вызывают реакции в эксперименте, обладают наилучшей энергией связывания, а бутанол, пентанол и октанол связываются слабее с этим рецептором. По мнению авторов, существуют различия в абсолютных значениях порогов активации для различных классов одорантов. Также абсолютная энергия связывания различных обонятельных рецепторов значительно варьирует между разными случаями. Это различие в энергии связывания для различных классов химических веществ авторы объясняют недостатками в расчетах, которые приводят к ошибочным результатам. (По-моему, это лишний раз подтверждает правоту разного сродства одоного рецептора к разным одорантам даже одного и того же класса химических веществ).

При исследовании порогов активации этих шести рецепторов к разным одорантам показало, что, хотя один и тот же рецептор связывается с несколькими одорантами, но сродство их к ним разное. Так, например, к nonanoic acid самое высокое сродство у S19 (в 10 раз выше), чем у других изучаемых рецепторов. Сродство этого рецептора к другим исследуемым кислотам на 1 – 2 порядка ниже. (По-моему, это лишний раз подтверждает правоту разного сродства одоного рецептора к разным одорантам даже одного и того же класса химических веществ).

Корреляция между порогами концентрации и энергией связывания обнаружена также для связывания S19 со спиртами. При этом у nonanol совпадает пороговая концентрация с пороговой концентрацией nonanoic acid (1 мкм).

В своей работе при сравнении предполагаемой 3-мерной структуры для шести обонятельных рецепторов с известной полной амино-кислотной последовательностью авторы показали, что члены одного и того же семейства протеинов с высоким сходством амино-кислотной последовательности имеют высокую степень структурной гомологии. Для семейства из шести обонятельных рецепторов, исследуемых здесь, это сходство находится в области от 20 до 94%. CRMS (the corresponding root mean square) отличается между трансмембранными доменами предполагаемой структуры обонятельного рецептора в области от 1,5А (между S6 и S50 со сходством последовательной в 94%) до 6,3А (между S19 и S25 со сходством последовательности в 25%). Структура для S19 сильно отличается от других структур за счет различий в ТМ4.

При компьютерном моделировании в данной работе показано, что по расположения связывающих сайтов четыре обонятельных рецептора (S18, S19, S25, S46) узнают одоранты из одного и того же класса химических веществ, тогда как два других (S6 и S50) распознают класс одорантов (diacids), который не распознает ни один из других четырех рецепторов. По мнению авторов, узнавание своего одоранта связано с расположением определенных аминокислотных остатков в сайте связывания. Обонятельные рецепторы, которые распознают кислоты и bromo acids (S18, S19, S46) имеют His в положении ТМ3 – 6 (это условное обозначение означает 6-ой а/к-остаток на ТМ3, начинающийся от аминоконца петли 3), а/к-остатков с короткой гидрофобной боковой цепью (Val, Ala или Gly) в положении ТМ3 – 10 и Pro в положении ТМ6 – 19. Единственный обонятельный рецептор из шести, который не распознает кислоты (S25), имеет Val в ТМ3 – 6, полярный Thr в положении ТМ3 – 10 и друглй Thr – в положении ТМ3 – 19. Thr284 в положении ТМ6 – 19 в S25 связан водородной связью с Lys302, который является якорным а/к-остатком для гидроксильной группы.

В работе показано, что два обонятельных рецептора, которые распознают спирты и кислоты (S18 и S19), имеют Phe в положении ТМ3 – 9, которое в обонятельном рецепторе S46, который распознает только кислоты, занято Thr, а в обонятельном рецепторе S25, который активируется только спиртами, в этом положении находится Gly. Таким образом, по мнению авторов, эти различия в а/кислотном составе в связывающем сайте и объясняет разницу в предпочтении к данном классу химических веществ для S18, S19, S25 и S46. Авторы предположили также, что три положения (ТМ3 – 6, ТМ3 – 9 и ТМ3 - 10) являются гипервариабильными положениями в линейной а/к-последовательности обонятельного рецептора и вовлекаются при дифференцировке различных одорантов.

Интересно отметить, что лиганды получившие самое высокое рассчитанное сродство связывания с обонятельными рецепторами, исследуемыми в работе, оказались важными ароматическими (aroma) и/или вкусными (flavor - ароматными) компонентами источников каких питательных веществ для мыши, как фрукты (плоды), овощи и сыр. Это подтверждено в работе Malnic, в которой экспериментально были получены реакции на эти одоранты от данных рецепторов. В частности, furaneol и его метоксипроизводные (mesifuraniol) – наиболее важные летучие химические вещества в аромате земляники. Концентрация этих веществ вместе с furaniol glycoside производным резко увеличивается в процессе созревания с максимальным значением на стадии зрелости. Furaniol является также важным компонентом в аромате и вкусе многих фруктов, включая ананас, манго, малина и помидоры (см ссылки в этой работе – Floriano et al., 2004). Высокое сродство фураниола, связанного с гликозидами, ко всем шести обонятельным рецепторам может означать, что они играют сложную роль в восприятии flavor, и связывание этих веществ с обонятельными рецепторами может приводить не к специфическому ощущению (desriptor) запаха, а вместо этого – к общему “ощущению” (чувству - sensation).

Согласно стереохимической теории обоняния, молекула пахучего вещества должна взаимодействовать с активным центром молекулярного обонятельного рецептора, имеющего соответствующую этой молекуле стереоструктуру.

Katada S. et al. (2005) в своей работе чтобы адресовать молекулярную основу распознавания запахов суперсемейству обонятельных рецепторов млекопитающих, провели функциональный анализ на серии мутантов с адресованным сайтом (site-directed) и выполнили ligand docking simulation исследования, чтобы определить одорант-связывающий сайт обонятельного рецептора мышей. Результаты исследований авторов работы показали, что некоторые аминокислотные остатки в трансмембранных доменах образуют лиганд-связывающий карман. В отличие от других типов рецепторов, сопряженных с G-белком, обонятельные рецепторы одоранты главным образом посредством гидрофобных и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (а не ионных или водородных связей). Это объясняет широкое, но селективное связывание обонятельными рецепторами, а также их относительно низкое лиганд-связывающее сродство. Такая широкая и специфическая чувствительность говорит об эволюционном процессе, в ходе которого мутации в активном сайте привели к аномальному числу обонятельных рецепторов с широкой областью лигандной специфичности. Считают, что один обонятельный рецептор может связываться со множеством одорантов, но с различным сродством и специфичностью (). Имеются исследования, в которых показано, что одороанты могут не только активировать, но ингибировать обонятельные рецепторы (Oka et al., 2004, a,b).

Анализ суперсемейства GPCRs позволил идентифицировать высоко консервативные и вариабельные области, которые, вероятно, вовлекаются в структурную организацию и опознавание лиганда. Корреляционный мутационный анализ () и Фурье-анализ множественных последовательностей обонятельных рецепторов () поддержали гипотезу, что именно вариабельные остатки ответственны за связывание с одорантом (). Стратегия компьютерного моделирования была применена для OR5 мыши, а затем для S25 мыши (предполагаемый рецептор для гексонала) (Floriano et al., 2000) и I7 крысы (предполагаемый рецептор для октанала) (Singer, 2000). Компьютерные имитации и правильность предположения подкреплялись функциональными исследованиями.

mOR-EG – это обонятельный рецептор мыши, который изолирован из обонятельной клетки, чувствительной к эвгенолу, с помощью Са-изображения и RT-PCR одиночной клетки (). Авторы статьи обнаружили, что этот рецептор опознает 22 одоранта, причем величины ЕС₅₀ находятся в области от нескольких мкМ до нескольких сотен мкМ. При этом авторы исследовали действие одорантов, предъявляя их не обонятельным клеткам, а НЕК293 клеткам, экспрессирующим mOR-EG и G_{альфа15.} Было показано, что если в молекулах одорантов меняется один из радикалов, то это приводит к тому, что этот рецептор взаимодействует с этими одорантами, но в разной концентрации, различающейся до 40 раз. Полагают, что размер радикала в молекуле одоранта и, вероятно, гидрофобные взаимодействия являются важными детерминантами для активности агониста. (Интересно получить то же самое, но при стимуляции обонятельных клеток). Авторы предположили, что mOR-EG принадлежит к классу GPCRs. Исходя из этого предположения, они строили молекулярную модель этого рецептора. По их данным, предполагаемый одорант-связывающий карман образован 26 а/к остатками, из которых 10, вероятно, являются кандидатами, вовлекающимися в опознавание одоранта. Для определения роли этих 10 а/к остатков их подвергали направленному мутагенезу, а затем проводили функциональную проверку связывания с одорантами. Для функционального анализа мутированных mOR-EG использовали эвгенол, так как показано, что эвгенол сходным лигандом для этого рецептора в обонятельных клетках in vivo (). Показали, что для обеспечения гидрофильного взаимодействия с лигандом посредством водородных связей нужны Ser 113, Asn 207 и Thr 255. При замене Ser113 на Thr, Cys, Val или Ala чувствительность НЕК293 клеток, коэкспрессирующих мутантный рецептор и G_{альфа15,} значительно изменялась. ЕС₅₀ у S113T и S113C была 17 мкМ и 889 мкМ, соответственно. Вместе с тем, S113A и S113V полностью теряли способность реагировать на эвгенол, а также и на другие тестируемые в работе одоранты. Авторы считают, что Ser113 действиует в качестве донора водорода для образования водородной связи с атомом кислорода, присоединенного к бензольному кольцу в положении R₄, которое может быть решающей для активности агониста.

Авторы статьи исследовали влияние мутаций на Thr остатках, помещенных в предполагаемый одорант-связывающий карман: Thr205 (TM5), Thr211 (TM5), Thr255 (TM6) и Thr280 (TM7), каждый из которых замещали на Ser113, Val или Ala. Они показали, что в противоположность Ser113, Val или Ala мутация на Thr211 и Thr255 не уничтожала восприимчивость к эвгенолу, что означает, что эти а/к остатки не вовлекаются в электростатические взаимодействия, а скорее обеспечивают Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия. Два других а/к остатка не вовлекаются в опознание эвгенола.

Оказывается, что в предполагаемом связывающее кармане присутствует много гидрофобных а/к остатков: Leu, Ile, Val и Phe. Полагают, что они образуют гидрофобное окружение, которое предоставляет место для относительно маленьких алифатических молекул, таких, как одоранты. Авторы мутировали Leu на Val, Ile на Leu или Val, Val на Ala или Leu, Phe на Leu, так как все эти замены не изменяли размера и полярности. L212V и L259V замены приводили в результате к увеличению значения ЕС50 на 1 порядок величины, что означает, что Leu212 и Leu259 участвуют в Ван-дер-Ваальсовых взаимодействия с лигандом. По данным авторов, Ile256 располагается вплотную к лиганду и отвечает за определение пространственной конфигурации связывающего кармана. Phe206 и Phe252, как полагают, вовлекается в опознавание лиганда.

Таким образом, Ser113 служит в качестве донора водорода для образования водородной связи с атомом кислорода, присоединенного к бензольному кольцу в положении R4. Такие аминокислоты, как Asn207, Leu212, Leu259, Thr211, Thr255, Ile256, Phe206 и Phe252, которые взаимодействуют с эвгенолом, локализуются в непосредственной близости к эвгенолу в определенной структуре. Интересно, что почти половина связывающего кармана находится в липидном бислое, а а/к в связывающем сайте не консервативны между семейством обонятельных рецепторов. Эта вариабельность обеспечивает диапазон молекулярной восприимчивости для обонятельных рецепторов.

Итак, авторы статьи обнаружили, что большая часть необходимых а/к остатков, которые вовлекаются в опознание одоранта, гидрофобна, и что связывающий карман располагается в пространстве, формируемом с помощью ТМ3, ТМ5 и ТМ6.

Природа рецепторных сайтов, которая обеспечивает молекулярную основу ольфакторной дискриминации, обсуждалась в течение многих лет. Стереоспецифическая рецепторная теория Эймура (1963) и других подтверждена открытием суперсемейства обонятельных рецепторов и последующими функциональными доказательствами (). Физиологические эксперименты также показали, что каждая функциональная группа или “odotop”, по аналогии с pharmacophore или epitope, представляют собой молекулярную детерминанту (определяющий, решающий фактор) для способности одоранта действовать в качестве лигандов для обонятельных рецепторов (). По мнению авторов, их данные обеспечивают прямое понимание (проникновение) природы взаимодействия обонятельного рецептора с одорантом на молекулярном уровне и доказывают стерическую теорию и теорию функциональных odotope. Авторы показали, что лигандная специфичность (то есть способность различать запахи) определяется способностью mOR-EG различать различные размеры молекул одорантов. Далее авторы показали, что информация о лиганде или детерминанты трансдуцируются с помощью трех-мерной конфигурации связывающего пакета и его специфического одорантного лиганда. Таким образом, все эти результаты позволяют достаточно полно понимать молекулярную основу детекции одоранта. По мнению авторов статьи, опознавание (recognition) одорантов с помощью обонятельных рецепторов селективно по форме, размеру и длине лиганда, и этоа селективность определяется окружением связывающего сайта в каждом обонятельном рецепторе.

Исследования с мутациями показали, что тонкое различие в связывающем сайте обонятельного рецептора влияет на чувствительность к одоранту. Высокая пропорция псевдогенов и необычайно высокое соотношение полиморфизмов одиночных нуклеотидов возникло в генах обонятельных рецепторов человека (Lapidot et al., 2001). Мутации в функциональных обонятельных рецепторах будут влиять на разнообразие в чувстве обоняния у человека и на некоторые специфические аносмии.

Активация GPCR вовлекает сложные конформационные изменения из неактивной в активную форму в течение лигандного связывания. Отмечено, что в ходе лигандного связывания ТМ6 в некоторых GPCRs претерпевают движение, которое разблокирует сеть ионных взаимодействий в цитоплазматических концах ТМs, что, в свою очередь, приводит к активации последующих сигнальных каскадов (). По-видимому, Phe252 в TM6 mOR-EG является критическим в переводе конформации рецептора из неактивного в активное состояние. Вероятно, Phe252 образует стабильное взаимодействие с антагонистом и помогает поддерживать конформацию рецептора в неактивном состоянии.

Результаты показали, что лигандной специфичностью обонятельного рецептора можно манипулировать с помощью точечных мутаций в связывающем сайте, позволяя обонятельному рецептору приобретать способность опознавать определенные молекулы одорантов с более высоким сродством, а другие – с более низким.

Показано, что Ser-остаток в ТМ3 служит в качестве заякоревающей точки для такого лиганда, как алифатический спирт ().

В обзоре Elsaesser R., Payson J. (2005) предлагается механизм обонятельной трансдукции. Он заключается в том, что молекула одоранта связывается с рецептором во внеклеточном гидрофобном кармане, который вовлекает аминокислотные остатки из трансмембранных доменов (см. ссылки). Это стыкующее событие приводит к изменению конформации рецептора (см. ссылки), которое может быть сопряжено с активацией G-белка на цитоплазматической поверхности цилиарной мембраны и дальнейшей активации каскада вторичных посредников. Входящий ток Са открывает Са-активируемые Cl-каналы, в результате чего хлор выходит из цитозоля ОЖ в слизь (см. ссылки). Этот выход хлора обусловливается высокой его концентрацией в цитозоле обонятельных клеток и определяется активностью Na-K-Cl-котранспортера в базолатеральной мембране клеток (см. ссылки). Выход хлора деполяризует мембрану и приводит к улучшению соотношения сигнал-шум. Однако, протеин(ы), участвующие в Са-активируемой хлорной проводимости, до сих пор не идентифицированы (см. обзор Munger S.D. et al., 2009). В обзоре Munger S.D. et al. (2009) говорится, что в настоящее время идентифицированы некоторые факторы, модифицирующие каскад трансдукции. В усиление обонятельного сигнала посредством воздействия на G-протеины вносит вклад фактор гуанинового обмена Ric-8B. В то же время 2 циклонуклеотидные ФДЭ, ФДЭ1С2 и ФДЭ4А, участвуют главным образом в адаптации или в прекращении реакции на одорант. Ольфакторный маркерный протеин является важным модулятором амплитуды и кинетики обонятельного ответа. В обзоре Elsaesser R., Payson J. (2005) говорится, что многочисленные механизмы обратной связи заканчивают и модифицируют процесс сигнализации. Центральная роль в этой модуляции принадлежит кальмодулину. Он связывается с Са, который входит в ОЖ при стимуляции одорантом и действует во множественных путях. Са/кальмодулин непосредственно ингибирует CNG-каналы посредством снижения их лигандной чувствительности (), он стимулирует ольфакторные ФДЭ, которые восстанавливают базальный уровень цАМФ (). Са/кальмодулин активирует также СаМкиназу II, которая фосфорилирует и, в свою очередь, ингибирует АЦ III, обеспечивая дополнительный механизм для ослабления ольфакторных сигналов (). RGS2, регулятор G-протеиновой сигнализации, опосредует другой адаптивный механизм. RGS2 непосредственно ингибирует АЦ III в процессе, который не вовлекает модуляцию Gальфаolf (). В механизмах обратной связи могут также участвовать фосфорилирование рецептора и активация или ингибирование cng-каналов NO ().

(Touhara, Vosshall, 2009 - обзор). Активированная обонятельная клетка должна вернуться обратно в устойчивое состояние в процессе, известном как десенситизация. G-белок сопряженные рецепторы могут фосфорилироваться при связывании с одорантом такими протеинкиназами, как ПКА и киназа рецептора, сопряженного с G-белком (GRK), приводя в результате к десенситизации (141 - 143). К десенситизации приводит также интернализация ORs вместе с β-арестином, которая осуществляется посредством фосфорилирования с помощью ПКА (144). Кроме того повышение цитозольного Ca само приводит к последующему закрытию ионных каналов, через которые он входит в клетку (148). Са также отрицательно регулирует активность АЦ. Эти Са-опосредуемые механизмы отрицательной обратной связи возвращают активированные обонятельные клетки к устойчивому состоянию, готовому к восприятию нового пахучего стимула.

При картировании специфических протеинов на препаратах изолированных ольфаторных жгутиков был обнаружен гликопротеин с молекулярной массой 95 кДа (gp95) и плотностью распределения по поверхности мембран жгутиков обонятельных клеток 10 – 20 тысяч молекул на 1 мкм² (Chen, Lancet, 1984). Он является кандидатом на роль обонятельного рецептора. Этот протеин является тканеспецифичным и обнаруживается только в ольфакторном эпителии, а в нем - в жгутиковой мембране (Chen, Lancet, 1984; Chen, Pace, 1986; Lancet, 1986; Boyle et al., 1987; Lancet, 1987; Menco, Farbman, 1992). Методом in situ гибридизации показано, что обонятельные рецепторы экспрессируются в обонятельных клетках на ранней стадии развития (Е12), независимо от созревания клетки, когда периферический отросток еще не прорастает к апикальной поверхности обонятельной клетки, и присутствуют в ней задолго до возникновения детекции запаха. Экспрессия генов обонятельных рецепторов у этих животных обнаруживается между Е12-Е14 у крыс и Е13 – Е13,5 – у мышей (Saito et al., 1998). Картированы 16 генов, кодирующих синтез предполагаемых ольфакторных рецепторов человека. Эти гены состоят из 4 субсемейств, причем два из них являются псевдогенами (Ben-Arie et al., 1994; Mombaert, 1999). У крыс обнаружен ген (OR37), кодирующий синтез ольфакторного белка (Strotmann et al., 1992).

В различных экспериментах показано, что у обонятельных клеток нет специфичности к одоранту данного качества, и рецепторные клетки способны воспринимать несколько разных запахов (Moulton, 1976; Шеперд, 1987). Полагают, что в одной обонятельной клетке может экспрессироваться по крайней мере 2 типа рецепторов (Kashiwayanagi, Kurihara, 1994). По мнению G.M.Shepherd and S.Firestein (1991) а также Hall S.E. et al. (2004), обонятельная клетка экспрессирует единичный тип рецепторов, но с разной степенью сродства к разным лигандам. Наконец, существует мнение, согласно которому рецепторная клетка ольфакторного эпителия может обладать широкой чувствительностью к одорантам. При этом каждая из них экспрессирует несколько молекулярных рецепторных молекул данного субсемейства. Таким образом, спектр качественных ответов является суммой отдельных рецептивных полей данной обонятельной клетки. Причем на уровне одиночной клетки не только категории обонятельных рецепторов и их специфичность могут различаться, но и их сродство к молекулам одорантов. Таким образом, у позвоночных (крыс и амфибий) на клеточном уровне процесс связывания с молекулярным рецептором приводит в результате к активации множества обонятельных клеток с частично перекрывающимися профилями настройки (Duchamp-Viret et al., 1999).

Считают, что способность людей со специфической аносмией при некоторых условиях ощущать запахи обусловлена возможностью одного молекулярного рецептора обонятельных клеток взаимодействовать с разными пахучими веществами. Известно, что этот тип аносмии проявляется только при низких концентрациях одорантов, а при более высоких их концентрациях в рецепцию могут вовлекаться другие рецепторы, имеющие более низкое сродство к лиганду. Такое свойство рецепторных молекул обонятельной выстилки человека связывают с небольшим числом генов в геноме человека (около 500) по сравнению с числом воспринимаемых им одорантов (около 5000) (Ressler et al., 1994).

Однако беспрецедентный размер и разнообразие семейства обонятельных рецепторов свидетельствует о том, что каждый из них может быть высокоспецифичным для одного или нескольких сходных одорантов, поскольку свойства для большого разнообразия молекулярных рецепторов различны: варьирует их сродство к лигандам, фармакологическая реактивность, связь с другими компонентами клеток (Этингоф, 1991).

Все больше накапливается данных в пользу гипотезы о том, что в одной обонятельной клетке экспрессируется один обонятельный рецептор для данного одоранта (Sengupta et al., 1994; Keverne, 1995; Mombaerts, 1996; Hudspeth, Tanaka, 1998; Clyne et al., 1999; Cunningham et al., 1999; Mombaerts, 1999; Smith, 1999). Исследования с помощью in situ гибридизации показали, что как у рыб, так и грызунов, ген каждого обонятельного рецептора экспрессируется в небольшой фракции обонятельных клеток. Три различных субсемейства генов для обонятельных рецепторов обнаружены только в 0,1 – 0,2% клеток (Ressler, 1994).

С этой гипотезой согласуются данные, полученные на изолированных обонятельных клетках тритона методом пэтч-клэмп, где показано, что из 1569 тестируемых клеток только 1,6% реагировали на лилиаль, а из 896 только 1,7% - на лираль. Из общего числа рецепторных клеток обонятельного эпителия клетки, чувствительные к лиралю и лилиалю, занимают около 2% (Takeuchi, Кurahashi, 2003). Доказательством этого предположения являются также данные, полученные на ольфакторных клетках зебрафиш. Методом иммунного анализа было показано, что в обонятельной выстилке идентифицируются широко рассеянные клетки, экспрессирующие один и тот же обонятельный рецептор и посылающие аксоны в одиночную идентифицированную гломерулу (Baier et al., 1994; Sulivan e al., 1995; Yokoi et al., 1995; Yilmaster-Hanke et al., 2000; Yu et al., 2004). Но они рассеяны по поверхности эпителия не случайным образом, а образуют пространственные группы (Baier et al., 1994; Carr et al., 1994). Обонятельные клетки, имеющие ген одного и того же рецептора, окружены сотнями обонятельных клеток с геном другого обонятельного рецептора.

По мнению Serizava S. et al. (2005), в обонятельной системе мышей правило одна обонятельная клетка – один обонятельный рецептор регулируется посредством отрициательной обратной связи. Они пишут, что в обонятельной системе мыши присутствует около 1500 генов для обонятельных рецепторов, которые образуют кластеры в 50 различных локусах, которые разбросаны среди массива хромосом (). Гены для обонятельных рецепторов в обонятельных клетках экспрессируются по взаимно эксклюзивному () и моноаллельному пути (). А правило одна обонятельная клетка – один обонятельный рецептор образует генетическую основу для направляемой обонятельным рецептором проекции аксона обонятельной клетки. Авторы обсуждают возможные механизмы, которые регулируют экспрессию гена одиночного обонятельного рецептора в каждой обонятельной клетке у мыши.

Авторы предложили 3 механизма активации для выбора одного гена мультигенного семейства: рекомбинация ДНК, в результате которой обеспечивается близкое расположение промотора и the enchancer ragion; конверсия гена, в результате которой происходит перенос копии гена в экспрессионную кассету; и LCR, которая взаимодействует с сайтом только одоного промотора. Необратимые изменения ДНК, то есть рекомбинация и конверсия гена, явлюятся заманчивым объяснением для экспрессии гена одиночного обонятельного рецептора. Авторы с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) проанализировали ядра обонятельных клеток, экспрессирующих MOR28. Эти эксперименты показали не только моноаллельную экспрессию обонятельного рецептора, но также исключили возможность генной конверсии. Однако нельзя исключить наличия изменений ДНК в соседних областях. Этот анализ не поддержал модели генной транслокации. Авторы исследовали cis-действующую область ДНК, которая может регулировать экспрессию гена одиночного обонятельного рецептора. С помощью трансгенной конструкции искусственных хромосом у дрожжей (YACs), авторы исследовали кластеры генов для обонятельного рецептора, содержащих ген для MOR28 (). Показали, что cis-действующей локусной контрольной областью (LCR), которая активирует MOR28 кластер, является Н-область ДНК. Как обеспечивается экспрессия гена одного особого обонятельного рецептора в пределах активированного кластера? Авторв полагают, что активационный комплекс, образованный в LCR, взаимодействует с сайтом только одного промотора в кластере гена обонятельного рецептора. Такие механизмы отмечены для взаимно исключающей экспрессии генов зрительного пигмента человека в палочках ().

Авторы предположили, что для достижения такой взаимно исключающей экспрессии в обонятельных клетках существует регуляция по механизму отрицательной обратной связи.

Авторы делают заключение: гены обонятельных рецепторов млекопитающих экспрессируются по взаимно исключающему способу в обонятельных клетках. Такая уникальная экспрессия образует генетическую основу для аксональных проекций обонятельных клеток в ОЛ, направляемых обонятельными рецепторами. Авторы идентифицировали LCR для генного кластера обонятельного рецептора мыши, содержащего MOR28 (). Авторы полагают, что экспрессию гена только одного обонятельного рецептора в пределах кластера обеспечивает физическое взаимодействие между LCR и промотором. Эта модель привлекательна тем, что снижает вероятность одновременной активации генов двух различных обонятельных рецепторов, из вероятности из около 1200 генов, на которых около 50 локусов. Последние трансгенные эксперименты показали ингибиторную роль протеина обонятельного рецептора в предотвращении дальнейшей активации генов других обонятельных рецепторов (). Стохастическая активация гена обонятельного рецептора с помощью LCR и регуляция по механизму ООС с помощью генной продукции обонятельного рецептора, вероятно, обеспечивает правило 1ОК – 1OR в обонятельной системе млекопитающих.

Вместе с тем посредством иммунохимического, гистохимического и иммуногистологического анализа с помощью моноклональных антител, а также методом in situ гибридизации выявили важную закономерность, суть которой заключается в том, что в гломерулу проецируется аксон от обонятельной клетки, экспрессирующей специфический рецептор (Key, Akeson, 1993; Katon et al., 1993; Carr et al., 1994; Ressler et al., 1994;’ Vassar et al., 1994; Mori, 1995; Mori et al., 1999; Potter et al., 2001;). Следовательно, гломерула является представителем ольфакторных рецепторов. Для нее характерна высокая специфичность в организации ольфакторных проекций, а также функциональная специализация. Они представляют различные обонятельные рецепторы, занимающие определенные области, причем обонятельные рецепторы тесно вовлекаются в механизмы, которые формируют этот высоко репродуцируемый паттерн проекции. Полагают, что обонятельные рецепторы обеспечивают направление роста аксонов в обонятельную луковицу (Mombaerts, 1999; Strausfeld, Hildebrand, 1999; Yilmaster-Hanke et al., 2000).

Специфические рецепторы к одорантам выявлены как у насекомых, так и млекопитающих. В обонятельной выстилке крыс и лягушек обнаружен камфорный рецептор и получены его биохимические характеристики (Фесенко и др., 1978 а, б; Fesenko et al., 1979; Fesenko, 1989). Посредством регистрации электроантеннограммы у мотыльков, стимулируемых такими одорантами, как линалоол, нерол, смесями веществ из листа томата и другими одорантами, с применением специфического окрашивания люциферовым желтым обонятельных клеток, расположенных в определенной области антенны, показана их избирательная реакция на линалоол. Из других веществ только нерол, входящий в ту же группу монотерпеноидов, как и лоналоол, мог вызвать ответ в этих же клетках, но величина его составляла около 1% от реакции на линалоол (King et al., 2000).

(Touhara, Vosshall, 2009 - обзор). Методом экспрессии Or43a в гомологичную систему антенны Дрозофилы или в гетерологичную систему ооцитов Xenopus было показано, что лигандом для Or43a являются бензальдегид и циклогексанон (109). У шелкового мотылька B. mori рецепторы BmOR1 и BmOR2 спцифически связываются с феромонами bombicol и bombical, соотвественно. Многие накопившиеся данные свидетельствуют о том, что в процессе эволюции у насекомых рецепторы к феромонам отделились из репертуара ORs, а не было создано новое семейство специфических рецепторов к феромонам, тогда как у позвоночных эти классы рецепторов имеют структурные различия.

От 16 точек обонятельного эпителия крыс отводили электроольфактограмму (ЭОГ). По каждой группе животных составляли топографические карты ответов. Эксперименты показали, что для разных запахов эти карты отличались и были схожими для одного и того же запаха у разных особей (Mackay-Sim, Kesteven, 1994)

У лягушек с помощью стеклянных микроэлектродов регистрировали электроольфактограмму от 121 точки обонятельной выстилки. Стимулами служили 20 различных одорантов, в том числе камфора, бутанол, ментол, кумарин и другие. В опытах была выявлена корреляция между амплитудой локальных ответов ЭОГ и плотностью обонятельных рецепторов в точке регистрации. Оказалось, что чувствительность к одоранту определялась местом регистрации электроольфактограммы, причем топографическое распределение локальных ответов, вызываемых 20 пахучими веществами, различались у разных животных (Daval et al., 1980).

Следовательно, на поверхности обонятельного эпителия рецепторные клетки образуют «пространственные карты запахов». У рыб обонятельные клетки с одинаковым обонятельным рецептором случайным образом распределяются по всему обонятельному эпителию. У грызунов экспрессия семейства рецепторных молекул подразделяется на различные не перекрывающиеся пространственные зоны, которых у мышей насчитывается четыре (Ressler et al., 1994; Sullivan et al., 1995). В каждой из зон ольфакторный рецептор может взаимодействовать со своим лигандом, а клетки объединяются в группы по рецепторам со сходной лигандной специфичностью. Методами генетического анализа при гибридизации in situ с использованием зондов, специфических к обонятельным рецепторам, в эпителии носа крысы были топологически идентифицированы обонятельные клетки, специфически экспрессирующие определенный подтип мембранного рецептора (Breer et al., 1993).

Таким образом, обонятельный эпителий представляет собой мозаику обонятельных рецепторов, реагирующих на различные одоранты. При этом обонятельные жгутики разных клеток могут перекрываться. Поэтому в пределах одной зоны цилиарная сеть может содержать сложный ассортимент обонятельных рецепторов, принадлежащих различным обонятельным жгутикам.

Н.Saito et al. (1998) клонировали обонятельные рецепторы у мышей и выявили три их типа. Каждый тип рецепторной молекулы образует характерный пространственный паттерн, расположенный в одной из четырех различных пространственно разделенных зон. Так, обонятельные рецепторы 18A и V5 у мыши экспрессируются в обонятельных клетках зоны I и II, соответственно, а обонятельный рецептор V1- в I, II, III зоны.

Таким образом, в ольфакторном эпителии млекопитающих и амфибий установлены “молекулярные карты”, в которых обонятельные клетки локализуются в соответствии с молекулярным рецептором к специфическому одоранту, способным различать одоранты по размерам молекул (Polak et al., 1989). Наличие пространственных зон экспрессии генов обонятельных рецепторов указывает на то, что сенсорная информация до передачи ее в мозг организована в периферическом отделе, поскольку определенной зоной ограничены рецепторные клетки, реагирующие на один и тот же пахучий стимул. В ходе своего развития обонятельная клетка, как полагают, отбирает один рецепторный ген из 500 – 1000 возможных в соответствии с теорией вероятности (Sullivan et al., 1995).

Сравнительно недавно проведены исследования, посвященные идентификации белковых молекул, специфически взаимодействующих с определенным одорантом. В работе Tauhara K. et al. (1999) посредством сочетания изображения флуоресценции внутриклеточного Са²⁺ и PCR-анализа, связанного с обратимой транскрипцией, показали, что обонятельный рецептор «распознает» специфические структурные области в пределах молекулы одоранта. Таким образом, одиночная обонятельная клетка экспрессирует только один молекулярный рецептор. Авторы работы клонировали ген MOR23 для обонятельного рецептора к лиралю и проследили весь механизм трансдукции этого одоранта у мышей. Кроме гена MOR23, ими клонировано еще 15 других рецепторных генов из той части 220 клеток, которая реагировала на эвгенол, крезол и этилванилин.

Биологически значимым раздражителем для рыб являются аминокислоты (Hara, 1978; Кружалов, 1980; Johnstoun, 1980). В рецепторных клетках золотой рыбки охарактеризован мембранный рецептор (R5.24), который взаимодействует только с аргинином основной (катионной) аминокислотой. При этом к нейтральным алифатическим аминокислотам сродство этого рецептора было в 5 – 75 раз, а к кислым (анионным) аминокислотам – в 80 – 300 раз меньше. Такую высокую специфичность рецептора к аргинину авторы связывают со специфической длиной карбоновой R-группы, которая может отличаться на один атом углерода (Speca et al., 1999).

У крыс ген OR37 для специфического мембранного рецептора выявлен в определенных группах клеток, которые локализованы в ограниченных областях обонятельного эпителия (Strotmann et al., 1992). У нематод биохимическими, генетическими и поведенческими методами охарактеризован обонятельный рецептор ODR-10 к диацетилу, который кодируется геном odr-10 (Troemel et al., 1997).

В обонятельных клетках мышей идентифицирован рецепторный белок S25, сопряженный с ГТФ-связывающим белком, который из 24 одорантов, принадлежащих алифатическим спиртам, карбоксильным кислотам, дикарбоксильным кислотам и бомкарбоксильным кислотам, содержащим от 4 до 9 атомов углерода, взаимодействовал только с гексанолом и гептанолом (Floriano et al., 2000). Распознавание молекулы пахучего вещества обонятельным рецептором осуществляется по определенной функциональной группе, входящей в состав одорантов.

Методом PCR-анализа и in situ-гибридизации показано, что уже на очень ранних стадиях эмбриогенеза обонятельные рецепторы экспрессируются в соответствующих зонах ольфакторного эпителия. Полагают, что ранняя экспрессия молекулярных рецепторов играет важную роль в создании “карты обонятельных рецепторов” (Saito et al., 1998). При этом одно субсемейство рецепторных молекул экспрессируется только в 0,1 – 0,5% всех обонятельных клеток. Такая специфичность определяется тем, что только одна из двух аллелей гена каждого рецептора экспрессируется в одной обонятельной клетке. Это и приводит к тому, что в одной рецепторной клетке локализуется только один вид молекулярного рецептора (Chess et al., 1994; Griff, Reed, 1995). Таким образом, кодирование информации о качестве одоранта происходит уже в пространственном распределении молекулярных рецепторов (Mackay-Sim, Kesteven, 1994). При этом трансдукция возможна только в зрелых клетках, поскольку только в них созданы условия для встраивания в плазмолемму белка, образующего рецепторную молекулу (Cunningham et al., 1999; Dryer et al., 1999).

Все обонятельные рецепторные молекулы реагируют на летучие одорантные молекулы, однако не все одоранты активируют обонятельные рецепторы, некоторые из пахучих веществ являются их антагонистами. Например, undecanol ингибирует способность bourgeonal активировать OR17-4 человека (рецептор, вовлекаемый в обонятельную функцию и хемотаксис сперматозоидов). Димеризованное производное изоэвгенола, но не сам изоэвгенол, ингибирует эвгенол-зависимую активацию mOR – EG. Наличие большого числа сегрегирующих псевдогенов в обонятельном геноме может вносить вклад в перцептуальные различия между индивидами, как, например, чувствительность к изовалериановой кислоте. Одновременное наличие агонистов и антагонистов в сложной смести запахов создает дополнительные уровни сложности для кодирования пахучих стимулов (см обзор Munger et al., 2009).

Итак, в мембранах обонятельных клеток обнаружены белковые молекулы, играющие роль мембранных рецепторов, взаимодействующих с одорантом. Считается, что рецепторы к одорантам принадлежат семейству G-белоксопряженных мембраносвязанных протеинов (Firestein, Shepherd, 1992).

Исходя из данных электрофизиологических исследований, проведенных на изолированной обонятельной выстилке или на изолированных рецепторных клетках, рецепторы одорантов локализуются в жгутиковом аппарате, поскольку реакции на одоранты регистрировались только при условии их целостности (Минор, Сакина, 1973; Firestein et al., 1990).