Варіант № 25

Тривалість росту, год

1. Визначити:

• швидкість росту (μ) між 8 та і16 год. культивування;

• рівень біомаси:

• економічний коефіцієнт за умови, що початкова концентрація етанолу в середовищі становить 3 % (за об'ємом);

• тривалість лаг-фази.

2.Назвіть тип живлення, якщо джерелом енергії є N0₂^- , джерелом вуглецю - вуглекислота, а донором електронів — N0₂^- .

3. Визначити константу швидкості поділу () та тривалість генерації (g), якщо: - початкова концентрація клітин становить 10². а через 8 год. - 10⁸.

4. Чи правильно вказаний склад поживного середовища (г/л)? Якщо так, для вирощування яких мікроорганізмів це середовище може бути використане?

Етанол - 2 %;

NH₄С1-0,8;

КС1- 1,5;

МgS0₄ хН₂0-0,5:

СаС1₂ х 2Н₂0 - 0,1:

FeS0₄ х7Н₂0 - 0,001.

5. Концентрація сульфату амонію в середовищі для вирощування бактерій становить 2 г/л, а глюкози - 15 г/л. Розрахуйте теоретично можливий рівень біомаси

6. Характеристика Соrynebacterium glutamicum - продуцента глутамінової кислоти.

7. Скласти енергетичний баланс окислення глюкози за наступних умов:

а) катаболізм глюкози здійснюється за КДФГ- шляхом;

б) Р/О = 1;

в) ізоцитратдегідрогепаза є НАДФ⁺-залежнпм ферментом;

г) НАДФН є джерелом відновлювальних еквівалентів.

Примітка. Обов'язковим с наведення схеми окислення глюкози, за якою ведеться розрахунок.

Зміст

Вступ…………………………………………………………………….5

1. Розділ 1. Обґрунтування вибору біологічного агента…………….6

2. Розділ 2. Характеристика біологічного агента…………………...9

3. Розділ 3. Визначення показників росту…………………………... 15

4. Розділ 4. Типи живлення мікроорганізмів та аналіз складу поживних середовищ……………………………………….19

5. Розділ 5. Енергетичний баланс окиснення субстрату……………26

Висновки……………………………………………………………….30

Література……………………………………………………………...31

РЕФЕРАТ

Коротко про роботу:

• Загальна кількість сторінок - 33

• Загальна кількість таблиць - 5

• Загальна кількість рисунків - 7

• Загальна кількість літературних джерел - 14

Ключові слова:

Лаг-фаза, біомаса, швидкість росту, живлення, рівень біомаси, продуцент, енергетичний баланс, поживне середовище,

ВСТУП

Біотехнологія на сучасному етапі, а також на багато десятиріч вперед визначає науково-технічний прогрес і рівень життя людей. Вона є не тільки наукою, але і сферою діяльності людини, яка, використовуючи біологічні процеси, що протікають в живих організмах і системах, переносить їх на виробництво для отримання украй необхідних для людини лікарських препаратів, і відтворення тих біологічних ефектів, які не створені природою . Висхідним матеріалом для роботи служать: одноклітинні; мікроорганізми; клітини, органи і тканини тварин, рослин і людини.З кожним днем збільшується кількість досліджених мікроорганізмів, а також сполук які вони синтезують при тих чи інших умовах культивування.

В даний час активно йде перехід на отримання трансгенних рослин і тварин — це теж предмет біотехнології, яка також займається рішенням питань медицини, сільського господарства, ветеринарія, отримання харчових продуктів, проблемами екології і біобезпеки.

Оскільки багато мікроорганізмів патогенні для людини, тварин і рослин, і є причиною різноманітних хвороб, розвивається і медична мікробіологія. В області медицини це — отримання і виробництво антибіотиків, ферментів, гормонів, вітамінів, харчових добавок, препаратів крові, штучних тканин, імунна генодіагностика і генолікування природжених захворювань. В рамках галузі актуальне питання отримання продукції з генетично змінених джерел харчових продуктів . Але , нажаль , ця ланка галузі , в Україні ще мало розвинена, хоча в світі досить широко розвивається під гаслом Подоланням голоду у всьому світі.

Під поняттям “сучасна біотехнологія” в даний час мають на увазі частіше всього два найбільші її напрями — генетичну і клітинну інженерію, які охоплюють основну частину цієї складної міждисциплінарної технології і мають найширші потенційні області вживання. Саме тут в останні 20 років були досягнуті значні успіхи в розробці і виробництві біологічно активних речовин. Це, в першу чергу, створення промислової технології виробництва широкого ряду генно-інженерних препаратів інсуліну, гормону зростання людини, інтерферонів, інтерлейкінів, еритропоетина, активатора тканинного плазмоногена, ряду моноклональних антитіл і вакцин і багатьох інших . Крім того, методи і досягнення збагатили багато розділів біології і сприяли їх подальшому розвитку.

В даний час найбільший внесок сучасної біотехнології спостерігається в області охорони здоров'я, і в найближчому майбутньому ця тенденція, мабуть, збережеться особлива увага звертається на виробництво антибіотиків.

Розділ I Обґрунтування вибору біологічного агента

З кожним днем кількість використованих мікроорганізмів в різних сферах життя людини збільшується. Широко мікроорганізми використовують і в харчовій промисловості.

Як продуценти молочної кислоти, використостовується велика кількість мікроорганізмів. В основному продуцентами є молочнокислі бактерії, це переважно роди Lactobacterium, Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococus та інші.Але це ще далеко не всі продуценти. Продокувати молочну кислоту здатні також гриби, восновному порядку Мucorales, такі як Rhizopus oryzae a Rhizopus nigricans.

Моїм біологічним агентом є гриб Rhizopus oryzae .

Основною відмінністю грибів продуцентів молочної кислоти від бактерії в тому, що молочна кислота є не єдиним продуктом. У невеликій кількості утворюється також фумаратова, бурштинова, яблучна, мурашина, оцтова кислоти та етанол.

Для максимального виходу молочної кислоти необхідна присутність кисню для мого агента, оскільки він є стійким до кислотності середовища і дозволяє збільшити отримання даної кислоти. А молочнокислі бактерії здатні тільки до бродіння, тільки представники родини Lactobacilaceae можуть рости у присутності кисню, бо є аеротолерантними. R. Oryzae може рости і в анаеробних умовах, але при цьому проявляє патогенні властивості.

Для грибів важливим є умови культивування та склад поживного середовища, від даних умов залежить кількість синтезу а також кількість побічних продуктів. А бактерії в свою чергу потребують ростових факторів, таких як вітаміни (тіамін, пантотенова, нікотинова, фолієва кислоти, біотин), амінокислоти, пуринів та піримідинів, тобто вимагають складних середовищ, до складу середовищ входять томатний сік, дріжджовий автолізат, кров та інші дотогож у високих концентраціях, деякі з них використовують молочний цукор (лактозу).

Тобто мій агент має як переваги так і недоліки при порівнянні його з бактеріями, які теж продукують молочну кислоту.

Патент на отримання молочної кислоти

За допомогою плазмідою ДНК, яка несе ген IdhA гриба Rhizopus oryzae.

Документ:	В формате PDF
Статус	по данным на 20.11.2007 - действует
(11) Номер публикации	2268304
(13) Вид документа	C1
(14) Дата публикации	2006.01.20
(19) Страна публикации	RU
(21) Заявка	2004119091/13
(22) Дата подачи заявки	2004.06.24
(24) Дата начала отсчета срока действия патента	2004.06.24
(45) Опубликовано	2006.01.20
(51) Основной индекс МПК	C12P7/56 (2006.01)
(51) Основной индекс МПК	C12N1/19 (2006.01)
Название	СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске	US 6268189, 31.07.2001. WO 03102152, 11.12.2003. RU 2205216 С2, 27.05.2003.
(72) Автор	Синеокий Сергей Павлович (RU)
(72) Автор	Вустин Михаил Михайлович (RU)
(72) Автор	Юзбашев Тигран Владимирович (RU)
(72) Автор	Рыбаков Юрий Александрович (RU)
(72) Автор	Райнина Евгения Исааковна (RU)
(72) Автор	Токарева Надежда Георгиевна (RU)
(72) Автор	Великая Марина Александровна (RU)
(72) Автор	Агранович Аннета Михайловна (RU)
(72) Автор	Дебабов Владимир Георгиевич (RU)
(73) Патентообладатель	Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) (RU)
Адрес для переписки	117545, Москва, 1-й Дорожный пр-д, 1, ФГУП ГосНИИгенетика, зам. директора В.Г.Параскевову

Винахід відноситься до біотехнологічної промисловості, а саме до способів отримання молочної кислоти. Молочну кислоту отримують шляхом культивування рекомбінованого штама дріжджів Schizosaccharomyces – продуцента молочної кислоти, який містить принанні один чужерідний ген лактатдегідрогенази. Отримання штама дріжджів Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-3127, при отриманні якого в ролі реципієнта використовували штам Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-285, а трансформацію штама проводили плазмідною ДНК, яка несе ген IdhA гриба Rhizopus oryzae. Даний винахід дозволяє здійснувати синтез молочної кислоти при низьких значеннях рН і підвищеній наявності її в середовищі. А наявність штама дозволяє продукувати молочну кислоту при рН 4,0 і концентрації молочної кислоти в середовищі 80 – 100 г/л. 2 н. п. ф-ли,5 іл, 2 табл.

Розділ II „Характеристика біологічного агента „

Морфологічно – культуральні ознаки

Rhizopus oryzae - це фікомицетний гриб , який відноситься до нищих грибів,

тобто плодове тіло гриба має не септований міцелій (немає перегородок) і

тому є багатоядерним. Такий талом називають ценоцитним. Спори утворюються

у спорангіях.

Наш гриб відноситься до класу Zygomycetes.Назва "зигоміцети"

(від греч."зигос"-ярмо) звязано особливим типом статевого розмноженя,

при якому утворюються зигоспори.

Ценозигота або зигоспора, утворюється в результаті злиття двох гаметангій

(гаметотангеогамия), яка у вигляді місточка ("ярма") зєднує дві батьківські

гіфи.Зигоміцети-найбільш розвинена група фікоміцетниг грибів, які перейшли

до наземного способу життя.

Представники порядка Mycorales (мукорових, головчятої плісняви) живуть

на гниючих органічних матеріалах; деякі з них як субстрат використовують

навоз. Саме тому кінський навоз і навозна жижа зіграли в свій час досить

важливу роль, ваконуючи роль субстрату для пробедення багатьох наукових

дослідів. Такі гриби, як Rhizopus oryzae відомі не лише мікалогам. Ці гриби

стали обєктами прмисловості, також ними цікавляться хіміки і біотехнологи.

Особливості розмноження.

Розповсюдження мукорових грибів відбувається дуже швидко за допомогою

багаточисельних спорангіоспор і досить швидкому росту гіфів.

Для безстатевого розмноження характерним є спорангії і спорангіоспори.

Столони добре виражені, дугоподібні вигнуті, прикріплюються до субстрату за допомогою ризоїдів, над якими розташовуються пучками, рідше поодиноко, прості, стоячі спорангієносці, зазвичай окрашені, найчистіше коричневі. Спорангії з апофізом.

На ріст і фізіологічну активність грибів впливає чимало факторів навколишнього середовища: температура, кислотність, ступінь аеробності середовища, світло, вологість, тиск, концентрація кисню в середовищі та багато інших.

Температура. Для росту міцелія оптимальна температура – 18 – 25 С. Оптимальна температура для різних періодів росте гриба змінюється. Амплітуда оптимальної температури також різна для окремих видів термофільних та психрофільних грибів. R. Oryzae – термофільний гриб.

Види роду Rhizopus по їх відношенню до температури представлені декількома групоми: 1) мінімум 10 С, оптимум 40 С, максимум 45 – 50 С; 2) оптимум 30 – 35 С, максимум до 45 С; 3) оптимум 25 – 30 С, максимум 30 – 35 С. Зв'язок між оптимумом росту міцелія при культивуванні і виявом патогенності властивостей грибів відзначається не завжди. За деяких умов . R. Oryzae – патогенний.

Підвищена і висока температура відіграє фунгіцидну дію, що залежить від рН і складу середовища, густоти міцелія і його віку, вологості та інших факторів.

Світло Впливає на ріст міцелія, спороутворення, метаболічні та інші морфологічні процеси грибів. Гриби, як і інші організми, попадають під дію малих доз радіації – видимого світла, УФ-променів, іонізуючого випромінювання. Механізм дії іонізуючого радіації не встановлений. Але гриби є досить стійкими до дії радіації. Іонізуюче випромінювання впливає на зміни генетичних властивостей грибів. Мутанти грибів виникають під дією відповідних видів і доз УФ, іонізуючої радіації, бувають морфологічні та біохімічні. Ці особливості використовуються для виявлення шляхів біосинтеза багатьох метаболітів.

Пряме світло інгібує ріст грибів. Чергування освітлення і темряви стимулює ріст. При цьому спостерігаються деякі періоди адаптації при переході від росту при освітленні до росту в темноті і навпаки. Тривалість цих періодів для різних грибів різна. Ріст різного спектрального складу по різному впливає на ріст і спороутворення для окремив видів грибів.

Реакція грибів на світло складається з двох частин:

1. неорієнтована реакція, зв’язана з ослабленням рівня світла, яка робить клітину чутливою до бокового асиметричного освітлення;

2. фототропічні реакції, зв’язана з підвищенням ростового рівня клітини, чутливою до цього джерела світла. Також залежать від віку культури.

Світло теж впливає на синтез нуклеїнових кислот, білка, компонентів клітинної оболонки і пігментів.

Кислотність середовища.

рН – має важливе значення для процесів життєдіяльності грибів. Здебільшого для грибів оптимальною є рН 4,0 – 5,0, хоч є і такі, що витримують високі або навпаки дуже низькі концентрація кислоти. У багатьох грибів залежно від рН можуть змінюватися культуральні та морфологічні ознаки: забарвлення середовища і колоній, характер росту міцелію, розміри та форма органів розмноження, впливає на фізіологічну активність грибів. Гриби в процесі росту змінюють концентрацію середовища за вдяки виділення з клітини метаболітів і ферментів, які викликають дані зміни.

R. Oryzae, має здатність рости на середовищах з великою концентрацією цукру, накопичують в середовищі органічні кислоти.

Концентрація речовини, теж специфічно впливає на ріст і розмноження грибів. Для росту потрібне водне середовище з розчиненням в ньому різних речовин. Повністю засолена чи дистильована вода є шкідлива навіть згубна для деяких видів. Якщо тиск середовища не зрівноважений з тиском всередині гіфа, порушуються процеси життєдіяльності.

Осмотичний тиск.

По відношенню до тиску гриби ділять на:

• осмофільні, ті, що здатні рости на середовищах з високим осмотичним тиском (До них відноситься і мій гриб);

• осмотолерантні, які не ростуть в розчинаг з високим осмотичним тиском;

• галофільні – здатні рости на середовищах з високою концентрацією, наприклад солей.

Важливим фактором розповсюдженості грибів також є відношення до різноманітних хімічних речовин – отрутам, антибіотикам та іншим.

Відношення до кисню та вуглекислому газу.

Багато видів можуть рости і утворювати спори при низькій концентрації кисню в середовищі, що є досить поширеним серед патогенних видів. При рості в таких умовах може змінюватись морфологія і фази росту.

На рахунок їх відношення до кисню, то в анаеробних умовах, ростуть

досить погано і лише короткий час. При відсутності молекулярного кисню

переходять до бродіння; багато які з них саме під час бродіння утворюють

молочну кислоту або етиловий спирт. При цьому може змінюватись форма росту.

В грибах містяться активні ферменти гліколітичного шляху розщеплення вуглеводів, саме тому вони здатні рости при різних концентраціях кисню.

Підвищена кількість вуглекислому газу стимулює проростання спор фітопатогенних та сапрофітних грибів.

За систематикою Хоуксворта (1995р.) та Маргіліс – Шварц (1997р.)

R. oryzae належить:

Царство

Fungi

Відділ

Zygomycota

Клас

Zygomycеtes

Порядок

Мucorales

Родина

Мucoraсеае

Рід

Rhizopus

Вид

Rhizopus oryzae

За систематикою Кавалір-Сміта (1998р.):

Rhizopus oryzae належить:

Царство

Fungi

Підцарство

Еомусоtа

Відділ

Archemycota

Розділ III „Визначення показників росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів”

Завдання:

Визначити:

-швидкість росту (µ) між 24 та 32 год культивування;

-рівень біомаси;

-економічний коефіцієнт за умови, що початкова концентрація глюкози в середовищі становить 1,0 %

-тривалість лаг-фази.

Розв’язання

Визначимо основні параметри кривої росту наведеної на рисунку.

Швидкість експоненційного росту

1. Швидкість експоненційного росту – це міра швидкості росту клітин в експоненційній фазі. Її визначають за формулою

де lg e = 0,43429.

Рис. Параметри росту: а – біомаса; б – швидкість росту; в – тривалість лаг- фази

Згідно з умовою t = 32 а t₀ = 24 год . Визначаємо за графіком концентрацію біомаси у момент часу t та t₀ . Маємо, що

Х_t = 3,3 г/л;

Х₀ = 2,5 г/л.

Отже,

µ = (ln 3,3 – ln 2,5) / (32 – 24) = 0,2776/ 8 = 0,035 год^-1

Рівень біомаси

2. Рівень біомаси (концентрація біомаси) – це різниця між максимальною (у стаціонарній фазі росту) та вихідною біомасою бактерій:

Х=Х_макс – Х₀ .

Цю величину виражають у грамах сухої речовини, яка міститься у літрі культуральної рідини або клітинної суспензії. Згідно з наведеним графіком вихідний рівень біомаси ) і рівень біомаси у стаціонарній фазі росту становить відповідно:

Х₀ = 0,5 г/л; Х_макс = 3,5г/л.

Отже, згідно з наведеним рівнянням концентрація біомаси становить:

Х = 3,5 – 0,5 = 3,5 (г/л )

3.Економічний коефіцієнт

Економічний коефіцієнт. Важливим показником періодичного процесу є відношення концентрації біомаси до кількості спожитого субстрату – Х / S. Якщо ці дві величини виражені у вагових одиницях, як в нашому завданні, то відношення Х / S називають економічним коефіцієнтом ( Y ). Якщо врожай у грамах відноситься до кількості молей спожитого субстрату, то отриману величину називають молярним економічним коефіцієнтом.

Згідно з умовою,

• початкова концентрація гексадекану в поживному середовищі (S) становить 1,0 % або 10 г/л;

• рівень біомаси – 3,5 г/л.

Економічний показник: Y = Х / S = 3,5 / 10 = 0,35 або 35 %.

4.Тривалість лаг-фази

Тривалість лаг-фази визначають як проміжок часу між моментом t_r, в який культура досягла певної біомаси Х_r, і моментом часу t_t, в який вона могла б досягти такої ж біомаси, якби одразу ж після інокуляції починався експоненційній ріст.

Для визначення тривалості лаг-фази на кривій росту проводимо теоретичну пряму, паралельно тій частині кривої, що відображає експоненційний ріст культури. Тривалість лаг-фази визначають за формулою

Т = t_r - (ln Х_r – ln X₀)/ µ ),

де µ =(2,3(lg Х_r – lg Х_t))/( t_r – t_t).

За умовою Х₀ = 2,5 г/л; приймають Х_r таким, що дорівнює 2 г/л. На реальній та теоретичній кривій визначають час t_r та t_t потрібний для досягнення 2,5 г/л біомаси: t_r =24 год, а t_t =20 год.

Розрахуємо швидкість росту в період даного проміжку часу, при умові, що

Х_t =2,5 г/л. Отже, швидкість росту:

µ = (2,3(lg 2,5 – lg 2))/(24-20)= 0,056год^-1

Знаючи швидкість росту на даному проміжку розраховуємо тривалість лаг-фази:

Т =20– ((ln 2,5 – ln 2) / 0,056) =16 год

Отже тривалість лаг-фази становить 16 год